מאמר שיטה

חקירת שינויים Caecum Microbiota לאחר פציעה טראומטית במוח עכברים

DOI:

10.3791/59410

⸱

19 בספטמבר 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Emergency and Trauma Center, The International Medical Center, The First Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מוצג כאן הוא פרוטוקול לגרום לטשטוש פגיעה מוחית טראומטית באמצעות מכשיר הקשה לרוחב הכלי נקישה ואחריו אוסף של תוכן caecum לניתוח microbiome בטן.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העלאת ראיות מראה כי הציר מיקרוביוטה-המוח-בטן ממלא תפקיד חשוב בפתוגנזה של מחלות המוח. מספר מחקרים גם להדגים כי פציעות במוח טראומטי לגרום לשינויים במעיים מיקרוביוטה. עם זאת, מנגנונים המשמשים את הוויסות הדו-כיווני של ציר המוח-המעיים נותרים בלתי ידועים. כיום, מספר דגמים קיימים ללימוד השינויים מיקרוביוטה במעיים לאחר פגיעה מוחית טראומטית. לכן, המחקר המוצג משלב פרוטוקולים לגרימת נזק מוחי טראומטי באמצעות התקן כלי הקשה נוזל לרוחב וניתוח של דגימות caecum לאחר הפציעה עבור חקירת שינויים מיקרובידום הבטן. שינויים של הרכב המעיים מיקרוביוטה לאחר פגיעה מוחית טראומטית נקבעים באמצעות שינוי רצף של 16 s-rDNA. פרוטוקול זה מספק שיטה אפקטיבית ללימוד היחסים בין מיקרואורגניזמים בידור ופגיעה מוחית טראומטית.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פגיעה מוחית טראומטית (tbi) היא בעיית בריאות הציבור העולמי והגורם המוביל למוות ונכות אצל מבוגרים צעירים1,2. TBI גורמת למקרי מוות רבים מדי שנה, והניצולים חווים מגוון של לקויות פיזיות, פסיכיאטריות, רגשיות וקוגניטיביות. לכן, TBI הוא נטל כבד למשפחתו של המטופל ולמשאבי החברה. TBI מערבת הן את הפגיעה המוחית העיקרית המתרחשת בזמן הטראומה וכל פציעות מוחי משני המתפתחים שעות לחודשים לאחר הפציעה הראשונית. פגיעה מוחית משנית מתווכת על ידי כמה מפלים ביוכימיים, אשר אינם מזיקים רק למוח אלא גם יש השפעות שליליות משמעותיות על מערכות איברים שונים, כולל מערכת העיכול3.

כיום, ישנם שלושה דגמים כדי לגרום TBI בניסויים בבעלי חיים: פגיעה בכלי הקשה של נוזל, שליטה השפעה קורטיקלית (CCI), והאצת ירידה במשקל. פציעה לרוחב הכלי הקשה (LFPI) היא המודל הנפוץ ביותר להקמת פגיעה מוחית מפוזר (DAI)4. המכשיר מייצר פגיעה מוחית באמצעות כריתת גולגולת על ידי החלת דופק קצר של לחץ נוזלי על השכבה השלמה. הדופק נוצר על ידי השביתה של המטוטלת. LFPI היא שיטת מידול מתוכמת ולשליטה עבור מחקר TBI.

המיקרובידום מוגדר הגנום הקולקטיבי של כל המיקרואורגניזמים השוכנים בגוף האדם. חיידקים מעיים במיוחד לא רק לשחק תפקיד חשוב בהומאוסטזיס מעיים פונקציה אלא גם לווסת היבטים רבים של הפיזיולוגיה המארחת ותפקוד של איברים אחרים5. בשנים האחרונות, יש הגדלת ראיות המציינת כי מיקרוביוטה המעיים להסדיר את התפתחות המוח ותפקוד באמצעות צירי המוח-בטן6. השיבוש של המעיים מיקרוביוטה נקשר להפרעות בתפקוד המוח כולל מחלת פרקינסון, הפרעות במצב הרוח, ואוטיזם7. לאחרונה, מחקרים פרה-קליניים דיווחו גם כי פגיעה במוח חריפה יכול לגרום לשינויים במעיים microbiota8,9.

מחקר של Treangen ואח '10 מצאו ירידה משמעותית בשלושה מינים מיקרוביאלית וגדל בשני מינים מיקרוביאלית אחרי tbi המושרה של CCI. הוכחה זו מצביעה על כך שאפנון של מיקרוביוטה עשוי להיות שיטה טיפולית בניהול TBI. עם זאת, המנגנונים המשמשים לפגיעה במוח המושרה שינויים מיקרוביוטה עדיין לא ידוע. מסיבה זו, מודל פשוט ויעיל יחסית של לימוד השינויים במעיים מיקרוביוטה לאחר TBI נדרש. לכן, המחקר הנוכחי מציג פרוטוקול לבחון שינויים במעיים מיקרוביוטה לאחר TBI בעכברים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים שבוצעו אושרו על ידי הוועדה הניסיונית לאתיקה בעלי חיים של אוניברסיטת ג'ה-ג'יאנג. כל המכשירים והחומרים המשמשים בניתוח הם עקרים. התהליך של המשך. לוקח בערך 20 דקות

1. טיפול בבעלי חיים

  1. השתמש 5 עד 6-שבוע בן זכר C57BL/6J עכברים (20-25 g של משקל) בניסוי זה.
  2. לשמור על עכברים על מחזור אור/12 h 12/כהה, ולוודא שהם מקבלים מזון ומים libitum המודעה. לספק את אותם כמויות של מזון ומים הן קבוצות הדמה ו TBI במהלך המחקר.
  3. לעשות את כל המאמצים כדי למזער את הכאב בעלי חיים ואי נוחות.

2. אינדוקציה של פגיעה מוחית טראומטית

  1. הזרקת קטמין (80-100 מ"ג/ק"ג)/xylazine (10 מ"ג/ק"ג) IP עבור הרדמה. בדוק את עומק ההרדמה באמצעות רפלקס העין או רפלקס הכאב. השתמש בדמעות מלאכותיות או משחה עין סיכה כדי לשמור על העיניים מפני ייבוש.
  2. לאחר הרדמה, לשים את העכבר בתנוחה נוטה. השתמש במשטח חימום מבוקר טמפרטורה כדי לשמור על הטמפרטורה ב-37 ° c במהלך הניתוח ובמשך 30 דקות אחרי TBI.
  3. . תגלח את השיער באזור החתך
  4. לחטא את הקרקפת עם 70% אתנול באמצעות שלושה חלוקים לסירוגין, ולאחר מכן בטעות את הקרקפת במישור משונן.
  5. השתמש מלקחיים לסגת את החתך משני הצדדים ולהפריד את קרום החזה מעט.
  6. השתמש בסמן כדי לצייר מעגל (3 מ"מ קוטר) על האזור הקודקודית הימנית של הגולגולת, 2 מ"מ הרחק מקו האמצע.
  7. לקדוח את הגולגולת עם מקדחה חשמלית. ודא ששלב זה מופעל בזהירות כדי להגן על השכבה הפגומה.
  8. הסירו את כנף העצם וחשפו חלון עצם קטן (3 מ"מ קוטר).
  9. מניחים צינורית של פציעה מפלסטיק (קוטר פנימי = 2.5 מ"מ, אורך = 8 מ"מ) על פתיחת הגולגולת ובטון הצינורית לגולגולת באמצעות אקריליק שיניים.
  10. מלא את הצינורית בעזרת מזרק (5 מ ל) 0.9 סטרילי (מתמיסת מלח רגילה) המשתמשת במזרק (3 מ"ל) כדי להבטיח שאין בועות בצינורית.
  11. הפעילו את האולוסקופ ואת המגבר והקפידו שצינור הלחץ הגבוה של פציעת ההקשה בנוזל הרוחבי (LFPI) יהיה חופשי מבועות האוויר. בדוק את המכשיר על ידי אספקת כ 10 פולסים עד שהוא נותן אות קבוע. כוונן את זווית מיקום המטוטלת כדי להגיע לעוצמת פעימה של כ-2.0 כספומט.
  12. חברו את צינורית הפציעה להתקן LFPI. לגרום לפגיעה במוח על ידי משיכת ההדק ושחרור המטוטלת. לאחר מכן, השיגו דופק והעבר אותו לדורא דרך מערכת האבובים המלאה בנוזלים.
  13. להפעיל את העכברים בקבוצה המזויף עם הליך כירורגי זהה. אל תבצע את ה-LFPI.

3. טיפול לאחר ניתוח

  1. לאחר גרימת פגיעה במוח, הסר את צינורית הפלסטיק ותפר את החתך. במהלך הניתוח מנהל בופרינורטין (2mg/ק"ג) מ"ר או IP ולאחר מכן כל 6-12 h במשך שלושה ימים.
  2. הנח את העכבר על משטח חימום עד שהוא אמבולטורי. הגדר את הטמפרטורה של משטח החימום כדי 37 ° צ' כדי להאיץ החייאה הרדמה.
  3. לשים את העכבר בכלוב ולנהל מזון ומים libitum המודעה.

4. לפרוטומיה ואוסף דגימות מהcaecum

  1. המתת חסד העכברים על ידי CO2 ואחריו פריקה צוואר הרחם על נקודות הזמן המתאימות.
    הערה: בניסוי זה, נקודות הזמן שנבחרו היו 1 h, 6 h, 1 d, 3 ד, ו -7 ד פוסט טראומטי פגיעה במוח כדי לנתח את האבולוציה הדינמית של מיקרוביוטה בטן.
  2. להסיר את השיער מפני השטח של הבטן. לחטא את הבטן עם 70% אתנול.
  3. מניחים את העטוף הסטרילי על העכבר. לחתוך את הבטן התחתונה באמצע, ממש מעל הראש בעכברים הזכרים.
  4. לאחר חשיפת המעיים, אתרו את המעי הסטום והפרידו אותו בעדינות מפני מעיים אחרים. הימנע אוחז את מעי עם שיניים או מלקחיים חדים. השתמש במלקחיים מרועטיים, כגון מלקחיים של אדסון בסרפי.
  5. חותכים את הקסטה. עם מספריים חדים
  6. לחלץ את התוכן caecum באופן ידני על ההלבשה סטרילי ולאחסן את התוכן בצינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL.
  7. אחסן את תוכן caecum בשעה-80 ° c עד ניתוח מיקרובידום.

5. הפקת דנ א ו-16S-rDNA ניתוח נתונים

  1. בידוד של דנ א מצואה
    הערה: ערכת בידוד DNA זמינה מסחרית (טבלת חומרים) שימש לניסוי זה.
    1. השתמש אזמל כדי לגרד 300 מ"ג של צואה בתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה 2 mL ומניחים את השפופרת על הקרח.
    2. הוסף 1 מ ל של מאגר מעכב לכל דוגמה. מערבולת ברציפות במשך 1 דקות או עד דגימת צואה הוא הומוגניים ביסודיות.
    3. צנטריפוגה את המדגם במהירות המקסימלית עבור 1 דקות כדי לצנפה את חלקיקי הצואה.
    4. פיפטה 2 μL של מחקר. לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש Pipet 600 μL של supernatant משלב 5.1.3 לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה 2 מ"ל המכילים פרוטטינואז K. לאחר מכן, להוסיף 600 μL של מאגר 1 ו מערבולת עבור 15 s.
    5. מודקון את המדגם ב 70 ° c עבור 10 דקות.
    6. הוסף 600 μL של 100% אתנול לליפוסט (1:1 יחס) ו לערבב על ידי vortexing. צנטריפוגה במהירות המקסימלית לזמן קצר כדי להסיר טיפות מתוך מכסה הצינור.
    7. החל 600 μL של הליפוסט לעמודת הסחרור. צנטריפוגה במהירות המירבית עבור 1 דקות. למחוק את הזרימה. . חזור על השלב הזה עוד פעם אחת לאחר מכן, העבר את העמודה לצינור אוסף חדש של 2 מ"ל.
    8. פתח את עמודת הספין והוסף 500 μL של מאגר 2. צנטריפוגה במהירות המירבית עבור 1 דקות. הסר את העמודה והציבו אותו בשפופרת אוסף חדשה של 2 מ"ל.
    9. הוסף 500 μL של מאגר 3 לתוך העמודה. צנטריפוגה במהירות המירבית עבור 3 דקות. למחוק את הזרימה. חזור על התהליך הצנטריפוגה פעם אחת כדי להבטיח את מאגר 3 הוא חומק לחלוטין.
    10. מניחים את עמודת הספין לתוך צינור חדש 2 מ ל צינור ופיפטה 200 μL של מאגר 4 ישירות על הקרום. מודטה עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר (RT), ולאחר מכן צנטריפוגה במהירות המירבית עבור 1 דקות כדי להייוט DNA.
  2. שנות הרצף וניתוח נתונים של 16S-rDNA
    1. השתמש 20-30 ng של DNA כדי ליצור הגברה.
    2. השתמש בצבעי יסוד זמינים מסחריים המיועדים לאזורים שאינם שמרו יחסית, הגובלים באזורי ההיפר-משתנים של V3 ו-V4 של חיידקים 16S rDNA. שימשו את הרצף הקדמי המכיל את "הסדרה" CCTACGGRGVGAAT "והפוך את התחל המכיל את הרצף" GGACTACNCGGGTWCC "במחקר הנוכחי.
    3. הפוך את התגובות PCR לתערובת על ידי הוספת 2.5 μL של מאגר 1, 2 μL של dNTPs, 1 μL של כל פריימר, 0.5 μL של DNA פולימראז, ו 20 ng של DNA תבנית בשפופרת. השתמש ddH2O כדי לכוונן את מערכת התגובה 25 μl.
    4. הגדר את הפרמטרים של תגובת ה-PCR כדלקמן: בצע את הקדם-הדנטורציה ב-94 ° צ' למשך 3 דקות פעם אחת. לבצע דנטורציה ב 94 ° c עבור 5 s, לספח ב 57 ° צ' עבור 90 s, להאריך ב 72 ° צ' עבור 10 s, ולחזור על זה 24x.
    5. בצע ברצף מזווג PE250/300 בהתאם להוראה של היצרן ולהשתמש QIIME ניתוח נתונים חבילת עבור ניתוח נתונים rRNA של 16S.
      הערה: בניסוי זה, רצפי DNA וניתוח נתונים נעשו בעיקר על ידי החברה רצף מקצועי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הקמת TBI מופיעה באיור 1. לאחר הרדמה חיטוי, הקרקפת היה מsagittally (איור 1A). פתיחת גולגולת (בקוטר 3 מ"מ) הייתה מחוגלת לתוך הגולגולת על קליפת המוח הימנית עם מקדחה חשמלית, השכבה הייתה שלמה (איור 1B, C). מעבר לחלון העצם הונחה צינורית פלסטיק והיא הייתה מבטון לגולגולת בעזרת אקריליק שיניים (איור 1D).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מוצג כאן הוא פרוטוקול פשוט ויעיל כדי לקבוע שינויים במיקרוביוטה cecal לאחר TBI בעכברים. אינדוקציה של פגיעה מוחית ואיסוף של דגימות תוכן caecum הם חלקים קריטיים של הפרוטוקול.

למרות החוקרים לאחר שחקרו את השינויים של מיקרוביוטה בטן בעקבות TBI, הפגיעה במוח המשמש במחקרים אלה היו CCI-8 וירידה במשקל/ההשפעה מודלים9. עם זאת, מודל CCI בעיקר משכפל חבלה במוח, ומודל ירידה במשקל עלול לסבול ממספר אי-דיוקים. בין כל הדגמים הקיימים של פגיעה במוח, lfpi הוא המודל הנפו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים להודות בכנות Baohong וואנג על הדרכה טכנית שלה.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים


רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ערכת בידוד DNA QIAGEN51604לטיהור מהיר של DNA גנומי מדגימות צואה
שירות ניתוח גניםGENEWIZשירות ניתוח גנים
כרית חימוםשנחאי SAFE Biotech Co.כרית חימוםTR-200
בית החולים המסונף הראשון, בית הספר לרפואה, מזרק אוניברסיטת ג'ה-ג'יאנג
אוניברסיטת ג'ג'יאנגפובידונה יוד
מזרק מכשיר LFPI וירג'יניה מכשיר LFPI של אוניברסיטת חבר העמים FP302 מקדחה מיקרו גולגולת RWD מדעי החיים 78061 מקדחה מיקרו גולגולת פובידון יוד בית החולים המסונף הראשון, בית הספר לרפואה,

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cheng, P., et al. Trends in traumatic brain injury mortality in China, 2006-2013: A population-based longitudinal study. 14, e1002332(2017).
  2. Maas, A. I. R., et al. Traumatic brain injury: integrated approaches to improve prevention, clinical care, and research. The Lancet Neurology. 16, 987-1048 (2017).
  3. Gaddam, S. S., Buell, T., Robertson, C. S. Systemic manifestations of traumatic brain injury. Handbook of Clinical Neurology. 127, 205-218 (2015).
  4. Kabadi, S. V., et al. Fluid-percussion-induced traumatic brain injury model in rats. Nature Protocols. 5, 1552-1563 (2010).
  5. Fung, T. C., Olson, C. A., Hsiao, E. Y. Interactions between the microbiota, immune and nervous systems in health and disease. Nature Neuroscience. 20, 145-155 (2017).
  6. Collins, S. M., Surette, M., Bercik, P. The interplay between the intestinal microbiota and the brain. Nature Reviews Microbiology. 10, 735-742 (2012).
  7. Cryan, J. F., Dinan, T. G. Mind-altering microorganisms: the impact of the gut microbiota on brain and behaviour. Nature Reviews Neuroscience. 13, 701-712 (2012).
  8. Nicholson, S. E., et al. Moderate Traumatic Brain Injury Alters the Gastrointestinal Microbiome in a Time-Dependent. Shock. , (2018).
  9. Houlden, A., et al. Brain injury induces specific changes in the caecal microbiota of mice via altered autonomic activity and mucoprotein production. Brain, Behavior, and Immunity. 57, 10-20 (2016).
  10. Treangen, T. J., et al. Traumatic Brain Injury in Mice Induces Acute Bacterial Dysbiosis Within the Fecal Microbiome. Frontiers in Immunology. 9, 2757(2018).
  11. Alder, J., Fujioka, W., Lifshitz, J., Crockett, D. P., Thakker-Varia, S. Lateral fluid percussion: model of traumatic brain injury in mice. Journal of Visualized Experiments. , (2011).
  12. Thompson, H. J., et al. Lateral fluid percussion brain injury: a 15-year review and evaluation. Journal of Neurotrauma. 22, 42-75 (2005).
  13. Pang, W., Vogensen, F. K., Nielsen, D. S., Hansen, A. K. Faecal and caecal microbiota profiles of mice do not cluster in the same way. Laboratory Animals. 46, 231-236 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

16S rDNA

מאמרים קשורים