מאמר שיטה

ניתוח התפתחות קאמרית הלב במהלך מופרה העכבר באמצעות כל הר Epifluorescence

DOI:

10.3791/59413

⸱

17 באפריל 2019

 , 
1Department of Medicine, Division of Cardiovascular Medicine, Vanderbilt University Medical Center, 2Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University, 3Vanderbilt Center for Stem Cell Biology, Vanderbilt University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים את הפרוטוקולים לבחון התפתחות הלב העכבר באמצעות מיקרוסקופ פלורסנטי הר שלם על העכבר עוברי גזור מן חדרית ספציפי MLC-2v-tdTomato כתב טוק-אין עכברים. שיטה זו מאפשרת לנו לבצע בכל שלב של היווצרות חדרית במהלך התפתחות הלב העכבר מבלי מהגידולים שיטות מעבדה הומנית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר את שיטת ניתוח העכבר עוברי והדמיה של צ'יימברס חדרית עובריים בעכבר במהלך התפתחות הלב באמצעות חדרית כתב פלורסנט ספציפי טוק-אין עכברים (עכברים MLC-2v-tdTomato). פיתוח לב כרוך צורה צינור הלב ליניארי, הצינור הלב לולאה, ארבעה septation קאמרית. אלה תהליכים מורכבים מאוד נשמרים כל גולגולת. בלב עובריים בעכבר כבר בשימוש נרחב עבור מחקרים התפתחותיים הלב. עם זאת, עקב גודלם קטן מאוד, לנתח לבבות עובריים בעכבר הוא טכנית מאתגר. בנוסף, ויזואליזציה של הלב קאמרית היווצרות לעיתים קרובות צריך היברידיזציה, ביתא-galactosidase מכתים באמצעות LacZ כתב עכברים או immunostaining הלבבות עובריים המחולקת למקטעים. כאן, אנו נתאר כיצד לנתח לבבות עובריים בעכבר והמחש ישירות קאמרית חדרית היווצרות MLC-2v-tdTomato עכברים באמצעות מיקרוסקופ פלורסנטי הר שלמה. בשיטה זו, אפשרי לבחון באופן ישיר את הלב צינור היווצרות לולאה ואת היווצרות קאמרית ארבע ללא נוסף ניסיוני מניפולציה של העכבר עוברי. למרות הקו MLC-2v-tdTomato כתב בטוק העכבר נמצא בשימוש פרוטוקול זה כדוגמה, פרוטוקול זה ניתן להחיל קווים העכבר הטרנסגניים אחרים כתב פלורסנט הלב ספציפיים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תא צורה במהלך התפתחות הלב היא תהליך מורכב מעבר מיגדרי העובריים מורפולוגית ברורים מספר1,2. צורת חרמש האוכלוסייה ובתאים לב צורות צינור הלב ליניארי, ואז עובר התארכות של לולאה כדי ליצור צורת הספירלה של הלב המתפתח. לאחר תהליך septation שלה, הופכת את הלב המתפתח בלב תאיים ארבע. הפרעה של כל התהליכים האלה תוצאות התפתחותיות לב מולדים. לכן, חשוב להבין את המנגנונים המולקולריים שבבסיס היווצרות קאמרית במהלך התפתחות הלב. למרות אינספור מחקרים קודמים על פיתוח של הלב, ההבנה שלנו של תהליך מורכב זה נותר מוגבל.

היברידיזציה באתר אימונוהיסטוכימיה, ביתא-galactosidase מכתים שימוש בעכברים כתב LacZ היה בשימוש....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו בהסכמת ראש הוועדה ואנדרבילט אוניברסיטת מרכז מוסדי חיה טיפול רפואי לשימוש.

1. עכבר ואוסף העובר לנתיחה

  1. חבר MLC-2v-tdTomato נקבה שבוע 8-10+ /- עכברים עם MLC-2v-tdTomato זכר שבוע 8-10+ /- עכברים להשיג MLC-2v-tdTomato+ +, MLC-2v-tdTomato+ /- ועוברי- / - MLC-2v-tdTomato.
  2. בדוק הסכרים עבור מהנרתיק פקקים בכל בוקר. בצהרי היום של זיהוי הכנס מהנרתיק נחשבת E0.5.
    הערה: בדיקה נרתיקית לגילוי פקק הנרתיק יש לבצע בבוקר (במרחק של 8-24 שעות לאחר פעילות מינית), מאז פקק הנרתיק עלול ללכת לאיבוד לאורך כל היום.
  3. המתת חסד הסכרים בהריון-coitum פוסט ימים ש....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במהלך התפתחות הלב, MLC-2v נחשב להיות הסמן המוקדם ביותר של הקאמרית חדרית מפרט17. כמתואר באיור1, אנחנו גזור את העוברים כל של העכבר ולבבות עובריים מן הכתב MLC-2v-tdTomato טוק-אין עכברים ובחן MLC-2v-tdTomato ביטוי כתב במהלך התפתחות הלב. בעכברים MLC-2v-tdTomato כתב בטוק, ביטוי tdTomato המכונן בלב המתפתח הוא מדמיין באמצעות הדמיה כל הר epifluorescence מוקדם ככל האפשר E8.012 (איור 2). ביטוי.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיטה המתוארת כאן הוא פשוט יחסית לבחון פיתוח קאמרית חדרית, מבלי לבצע ניסויים מהגידולים לתייג גנים מבני חדרית או מסוימים דום לב או חלבונים. לכן, בשיטה זו ממזערת את variabilities טכני נמצאו לעיתים קרובות בסעיפים הלב immunostained.

ישנם שני שלבים קריטיים לביצוע בהצלחה בשיטה זו כולל הערכה מדויקת של עידן עובריים של עכברים, דיסקציה של לבבות עובריים. אנחנו למעשה להעריך גיל העכברים על-ידי זיהוי הנרתיק עובריים מחבר בעכברים הנשי. עם זאת, הנוכחות של פקק הנרתיק אינו מצביע בהכרח הריון. הוא רק מציין כי יחסי.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי NIH R03 HL140264 (י'-ג'יי N) ותוכנית גלעד מדעי מחקר מלומד (י'-ג'יי N).

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מיקרוסקופ ניתוחLeicaMZ125
סולם DNA (100 bp)PromegaG2101
מיקרוסקופ ניתוח אפיפלואורסצנטיLeicaM165 FC
GoTaq Green master Mixמכונת PromegaM712
PCR (מחזורי מאסטר)Eppendorf6336000023

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Evans, S. M., Yelon, D., Conlon, F. L., Kirby, M. L. Myocardial lineage development. Circulation Research. 107 (12), 1428-1444 (2010).
  2. Paige, S. L., Plonowska, K., Xu, A., Wu, S. M. Molecular regulation of cardiomyocyte differentiation. Circulation Research. 116 (2), 341-353 (2015).
    3. ....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

MLC 2v tdTomato

מאמרים קשורים