הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

השימוש יחיד מולקולה פלורסנט ב באתרו הכלאה (SM-דג) כדי mRNAs Quantify ו Localize ב Oocytes מאתר

10.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59414

⸱

24 באפריל 2019

 , 
1Department of Animal Science, University of Nebraska-Lincoln

במאמר זה

סיכום

Reproducibly לספור את המספרים של mRNAs ב oocytes בודדים, מולקולה בודדת RNA פלורסצנטיות באתרו הכלאה (RNA-דג) היה אופטימיזציה עבור תאים שאינם מחסידי. Oocytes נאספו, hybridized עם הגששים ספציפית התעתיק, לכמת באמצעות תוכנה כימות של התמונה.

תקציר

שיטות בשימוש שגרתי לכמת mRNA oocytes, העוברים כוללים תגובת שרשרת של פולימראז הפוכה-תמלול דיגיטלי (dPCR), כמותיים, בזמן אמת RT-PCR (RT-qPCR), רצפי RNA. כאשר שיטות אלה נעשות באמצעות oocyte יחיד או העובר, נמוך-עותק mRNAs לא אמינה מזוהים. כדי להתגבר על בעיה זו, oocytes או עוברי יכול להיות איחדו יחד לניתוח; עם זאת, זה מוביל לעתים קרובות השתנות גבוהה בין הדגימות. ב פרוטוקול זה, אנו מתארים את השימוש זריחה בהכלאה באתרו (דגים) באמצעות הכימיה DNA מסועף. טכניקה זו מזהה התבנית המרחבי של mRNAs בתאים בודדים. כאשר הטכניקה זה משולב עם מציאת מקום ותוכנות מחשב מעקב, השפע של mRNAs בתא גם ניתן לכמת. בעזרת טכניקה זו, יש השתנות מופחתת בתוך קבוצת הניסוי, פחות oocytes, העוברים נדרשים לזהות הבדלים משמעותיים בין קבוצות הניסוי. SM-DNA זמינים מסחרית-דגים ערכות מוטבו לזהות mRNAs רקמות משרטוטי או תאים חסיד בשקופיות. עם זאת, oocytes אינן מתיישבות ביעילות על שקופיות, כמה ריאגנטים בערכה היו קשים מדי וכתוצאה מכך oocyte פירוק. כדי למנוע את פירוק, נעשו מספר שינויים לערכה דגים. באופן ספציפי, oocyte permeabilization ושטוף מאגרים המיועדים את immunofluorescence של oocytes, העוברים החליף את המאגרים קניינית. Permeabilization, שוטף, וכן incubations עם המחקרים וכל מגבר בוצעו ב- 6-ובכן צלחות, oocytes הונחו על שקופיות בסוף הפרוטוקול באמצעות מדיה הרכבה. שינויים אלה הצליחו להתגבר על המגבלות של ערכת זמינים מסחרית, בפרט, פירוק oocyte. כדי במדויק, reproducibly לספור את מספר mRNAs ב oocytes בודדים, שימש תוכנות מחשב. יחד, פרוטוקול זה מייצג חלופה PCR ורצף כדי להשוות את הביטוי של הפרוטוקולים ספציפי בתאים בודדים.

מבוא

רוורס טרנסקריפטאז תגובת שרשרת פולימראזית (PCR) כבר תקן זהב עבור כימות mRNA. שני מבחני, PCR (dPCR) דיגיטלי1 ו זמן אמיתי כמותיים PCR (qPCR)2 משמשים כיום. של שתי טכניקות PCR, dPCR יש רגישות רבה יותר מאשר qPCR רומז כי זה יכול לשמש כדי למדוד את שפע mRNA בתאים בודדים. עם זאת, בידיים שלנו, הפיק dPCR ניתוח של שפע נמוך mRNAs בבריכות של 5-10 oocytes לכל כל מדגם ניסיוני נתונים עם הפארמצבטית נמוך ווריאציה גבוהה3. . זה ככל הנראה בגלל השגיאה ניסיוני המשויך החילוץ-RNA ויעילות שעתוק במהופך. רצפי RNA גם בוצעה באמצעות עכבר אחת oocytes האנושי4,5. טכניקה זו דורשת cDNA הגברה השלבים הנדרשים עבור הדור ספריה אשר סביר להניח מגביר את השתנות בתוך קבוצת הניסוי. יתר על כן, שפע נמוך תעתיקים לא ניתן לזיהוי. למרות רצף המחירים ירדו בשנים האחרונות, הוא עדיין יכול להיות ושדורשת עקב העלות הגבוהה של ביואינפורמטיקה ניתוחים. לבסוף, mRNA לוקליזציה היא תהליך דינמי עם שינויים מרחביים התורמים חלבון פונקציה6. לכן, יצאנו לאמץ טכניקה היה לייצר אמצעי כמותית מדויקת לשחזור ולוקליזציה של הפרט mRNAs ב oocytes יחיד.

DNA מסועף מצמידים זריחה בהכלאה באתרו מגביר את האות זריחה במקום RNA/cDNA הגברה המאפשרת זיהוי mRNAs יחיד תאים בודדים- 7,-8,-9. הבדיקה מבוצעת דרך סדרה של הכלאה הגברה (באמצעות DNA קנים), קרינה פלואורסצנטית תיוג צעדים כדי להגביר את האות של קרינה פלואורסצנטית7. הטכניקה מתחילה עם קשירה של זוגות בדיקה oligonucleotide 18 - 25-לבסיס כי הם משלימים על ספציפיות mRNA3,8,10. 15-20 זוגות בדיקה מיועדים ירידה לפרטים הבטחת כל תורגם על-ידי היעד. הכלאה mRNA ספציפי ואחריו הגששים קדם מגבר, מגבר כי הטופס תצורה מסועף. כ, fluorophores תווית 400 לאגד כל מגבר, וכתוצאה מכך עלייה 8000-fold ב פלורסצנטיות המאפשר זיהוי של הפרט mRNAs (איור 1)11.

figure-introduction-1
איור 1: סכימטי של פרוטוקול SM-דג- הכלאה רציפים של התעתיק בדיקה ספציפיים, כפועל DNA מגבר ו fluorophore ליעד mRNA מוצג. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

מחקרים קודמים באמצעות קרינה פלואורסצנטית מולקולה בודדת ב באתרו הכלאה (SM-דג) לשפות אחרות β-אקטין mRNAs נוירונים בודדים12 , וירוס הפפילומה האנושי DNA של סרטן צוואר הרחם תא קווים7. תוכנת מחשב במקום למצוא תוכנית מעקב אחר מזהה אות ניאון punctate בודדים, שימש בהצלחה כדי לכמת את מספר mRNAs כל3,תא13.

בהתבסס על התוצאות של גילוי mRNA נוירונים12, אנחנו שיערו כי SM-דג יוכיח כלי שימושי כדי quantitate רמות תורגם מאתר oocytes, העוברים כולל שפע נמוך mRNAs. עם זאת, הטכניקה ממוטבת לשימוש עם תאים קבוע חסיד, פורמלדהיד קבוע פרפין משובצים קטעי רקמה (FFPE). Oocytes לא יכולה לדבוק שקופית, גם כאשר הם מצופים פולי-L-ליזין. יתר על כן, הן שבירות יותר תאים סומטיים ומקטעים רקמות וכתוצאה מכך פירוק התא כאשר נתון של המאגרים קניינית ערכות זמינים מסחרית3. כדי להתגבר על האתגרים הללו, oocytes היו קבוע, מועברים באופן ידני בין טיפות של המאגרים. יתר על כן, מאגרי permeabilization ושטוף ערכות הוחלפו כדי להפחית את פירוק התא. שתגבש רגשים נרכשים לצד ערכת דגים או תעתיקים ספציפי ניתן לבקש. כל ערכת בדיקה קניינית זמין באחד בשלושה ערוצי קרינה פלואורסצנטית (C1, C2, C3) כדי לאפשר ריבוב. בניסוי הנוכחי, oocytes מאתר היו שהוכתמו כפול, כימות באמצעות בדיקה C2 Nanog ובדיקה C3 Pou5f1 . רגשים אלו נבחרו מבוסס על הביטוי המדווחת של Nanog , Pou5f1 oocytes, העוברים. בסיום השלבים הכלאה, oocytes היו ממוקמים בתוך טיפות אנטי-לדעוך הרכבה מדיה עבור יישום בשקופיות היסטולוגית. תמונות קונאפוקלית שימשו כדי לכמת את מספר punctate אותות פלואורסצנט אשר מייצגים mRNAs בודדים. בנוסף לכימות של mRNAs, ההדמיה הראתה גם את התפוצה המרחבית של ה-mRNA ספציפי בתא, אילו שיטות כימות אחרים של RNA הם הצליחו. להגיע להישגים. טכניקה זו הוכיח יש השתנות נמוך בתוך קבוצת הניסוי המאפשר שימוש מספר קטן יחסית של oocytes בכל קבוצה ניסיונית כדי לזהות הבדלים משמעותיים בין קבוצות הניסוי3.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

ההליכים בבעלי חיים היו נבדקו ואושר על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה-אוניברסיטת נברסקה, כל השיטות בוצעו בהתאם להנחיות הרלוונטיים ולתקנות. במחקר זה, outbred CD-1 עכברים הייתה גישה ad libitum צ'או מכרסמים רגיל ומים; הם היו מתוחזקים ביומן 12:12 כהה: אור מחזור.

1. הכנת מדיה הנדרשים

  1. על בסיס מדיה (אום), להוסיף 100 מ מ NaCl, 5 מ מ אשלגן כלורי, 0.5 מ מ ח'2PO4ו- 1.7 מ"מ CaCl2-2 H2O במים סטריליים 100 מ.
    הערה: ניתן לאחסן OMM בינוני עד כחודש.
  2. התקשורת מלאה (OMOPS), להוסיף 20 מ מ 3-morpholinopropane-1-sulfonic חומצה (MOPS), 1.2 מ מ MgSO4-7 H2O, גלוקוז 0.5 מ מ, 6 מ מ L-לקטט, 1 מ מ ala-אך זה לא נגמר, טאורין, 0.1 מ"מ x 1 שאינם חיוניים חומצות אמינו (NEAA), 0.01 מ מ ethylenediaminetetraacetic (חומצה EDTA), חומצה אלפא ליפואית מיקרומטר 10, 10 µg/mL מדולל גנטמיצין, 21 מ מ 1 מ' NaOH, 5 מ מ NaHCO3, 0.2 מ מ פירובט, 0.5 מ מ ציטראט, BSA 4 מ"ג/מ"ל FAF על 1:10 לדילול OMM במים סטריליים עבור הנפח הכולל של 100 מ ל. לעקר את המדיום עם מסנן 0.22 מיקרומטר.
    הערה: OMOPS ניתן לאחסן עד 1 לשבוע.
  3. עבור המדיום אחזקות (HM) להוסיף סרום שור העוברי 5% OMOPS. לעשות 2 מ ל HM לכל העכבר.
  4. פתרון hyaluronidase הוסיפו 0.1 מ"ג/מ"ל של hyaluronidase נגזר מן האשכים שור, 1 מ ל HM.
  5. המאגר פיקסציה לשלב 4% paraformaldehyde ב- 10 מ"ל של PBS x 1 יחד עם 0.1% העובר כיתה פוליוינילפירולידון (PVP)14.
  6. כדי להכין מאגר שטיפת 50 מ ל (WB), להוסיף חומרים פעילי שטח ללא יונית 0.1% ו- 0.1% PVP 1 x PBS14.
  7. כדי להכין 10 מ"ל permeabilization מאגר, להוסיף 1% שאינם - יונית חומרים פעילי שטח PBS 1 x14.
    הערה: המאגרים רוחצים את permeabilization המתואר לעיל להחליף את המאגרים קניינית ערכות זמינים מסחרית.

2. אוסף של oocytes ovulated של עכברים הנשי

  1. הכנה:
    1. לעורר עכברים נקבה 5-8 שבועות של גיל על-ידי הזרקת בקרום הבטן (IP) של 5 IU סוסים שליה גונדוטרופין (א) ואחריו 5 IU גונדוטרופין כוריוני אנושי (hCG) 44-48 h15,מאוחר יותר16.
    2. לשמור על 35 מ מ פטרי המכילות 2 מ של HM על צלחת ההתחממות 37 º C. פיפטה אחת, 100-µL טיפה של HM המכיל מדולל hyaluronidase ואחריו שלוש, 50 µL טיפות של HM ללא hyaluronidase בצלחת פטרי 60 מ מ. במקום לוחות המכילים טיפות על התחממות 37 ° C צלחת לפני השימוש.
      הערה: הטיפות hyaluronidase צריכה להיעשות רק לפני ניתוח כל זוג oviduct כדי למנוע אידוי את הריכוז של הרכיבים של HM עם או בלי hyaluronidase.
  2. המתת חסד עכברים, h 16 אחרי הזריקה IP של hCG, שימוש יתר איזופלוריין ואחריו נקע בצוואר הרחם.
  3. נקה את העכבר באמצעות אתנול 70%. לחשוף את חלל הבטן והמחש את מערכת הרבייה הנשית. מחזיקים את השחלה עם מלקחיים, להסיר את הרצועות הרחם ואת רקמת שומן עודף מ סביב השחלה. לחתוך את oviduct מן הרחם ולמקם את זוג שחלה-oviduct HM חם בצלחת 35 מ מ.
  4. להסיר את השחלה כל רקמת שומן שמסביב. דמעה נפוחות אמפולת oviduct באמצעות מחט 27-מד ½ אינץ '. לדחוף את oviduct באתר של הקרע, מתחמי תא-oocyte תלולית (COCs) יסולקו. להעביר את oocytes ovulated, אשר נמצאים בחזקת להיות מפה של השני (MII) של מיוזה, לירידה 100 μL המכיל HM מדיה עם hyaluronidase באמצעות פיפטה של הפה (איור 2).

figure-protocol-1
איור 2 : חלקי pipettor הפה המשמש להעברת oocytes. (א) את הפה. חתיכת (B) 0.22, 4 מ מ (ג) ליניקת אבובים (D) 1000 μL pipet קצה עם פילטר (E) 9" פסטר pipet. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

  1. Pipette את מתחמי תא oocyte-תלולית MII למעלה ולמטה ב hyaluronidase המכיל HM עם פיפטה בפה מכך cumulus תאים. העברת כל oocyte, ברגע שהם נטולי cumulus לתאים שטיפה זרוק HM המכיל רק באמצעות פיפטה את הפה. חזור על הפעולה עבור כל droplet לשטוף. אל תעביר מפוצלים או שקוף oocytes15.
    הערה: חשוב להעביר את oocytes מכל טיפה בצלחת 35 מ מ עם כמו HM קטן ככל האפשר. זה נכון לכל העברה בפרוטוקול. Oocytes MII לא להישאר ב- hyaluronidase המכיל HM בינונית במשך יותר מדקה.

3. SM-דגים צביעה של Oocytes

  1. לתקן את oocytes טוב בודדים של צלחת 6-ובכן המכיל 500 µL מאגר קיבעון. להטביע 20 oocytes או פחות בתוך הבאר. תקופת דגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: כל שלב צביעת SM-דג מתרחשת בתוך ובכן בודדים בצלחת חרוט 6-. טוב. ודא oocytes לחלוטין המשוקע במאגרי ואני לא צף על המאגר. בכל שלב צריך להיות שבוצעו עם 20 oocytes או פחות מכל קידוח.
  2. להעביר oocytes קבוע μL 500 שטיפת מאגר (WB שמתואר בשלב 1.6) למשך 10 דקות. חזור על 2 פעמים נוספות.
  3. דגירה oocytes במאגר permeabilization למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: המאגר permeabilization שמתואר בשלב 1.7 מחליף את המאגר permeabilization הנימוס.
    1. איסוף ערכות בדיקה, במהירות לסובב אותם למטה ב microcentrifuge. חמים כל בדיקה להגדיר עבור 10 דקות 40 ° צלזיוס המים הרותחים או חממה. מגניב כדי טמפרטורת החדר.
      הערה: שלב זה צריך להתבצע במשך הדגירה permeabilization
  4. לשטוף oocytes ב µL 500 של WB 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. העברת oocytes 80 μL פרוטאז השלישי מאגר (זמין הערכה), זה מדולל 1:8 ב- 1 X PBS, למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: אמצעי האחסון 80 µL מכסה במידה מספקת הבאר בודדים בצלחת 6-. טוב.
  6. לשטוף oocytes ב µL 500 של WB 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  7. לדלל את מערכות החללית ומחוממת של Nanog, Pou5f1, ו DapB (גן שליטה שלילי), 1:50 ב בדיקה diluent. תקופת דגירה oocytes ב 80 μL של המכשיר הספציפי תעתיק של 2 שעות ב- 40 מעלות צלזיוס.
    הערה: כל ערכת בדיקה קניינית זמין באחד בשלושה ערוצי קרינה פלואורסצנטית (C1, C2, C3). Nanog ואת Pou5f1 הגששים תויגו עם C2, C3, בהתאמה.
  8. חמים קניינית, מגבר 1 (1 אמפר), מגבר 2 (AMP2), מגבר 3 (AMP3) ומגבר 4-קרינה פלואורסצנטית (מגבר 4-FL) בטמפרטורת החדר.
    הערה: שלב זה צריכה להתבצע במהלך בדיקה ספציפית התעתיק 2 שעות.
  9. להעביר את oocytes μL 500 של WB, תקופת דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  10. דגירה oocytes ברצף במאגרי הגברה.
    1. דגירה oocytes ב 80 µL של AMP1 במשך 30 דקות ב- 40 מעלות צלזיוס oocytes העברה כדי 500 µL של WB 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. דגירה oocytes ב µL 80 של AMP2 למשך 15 דקות ב- 40 מעלות צלזיוס. העברת oocytes µL 500 של WB 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. דגירה של oocytes ב 80 µL של AMP3 במשך 30 דקות ב- 40 מעלות צלזיוס. העברת oocytes µL 500 של WB 10 דקות בטמפרטורת החדר.
      הערה: השארית של הפרוטוקול מבוצעת בחושך כי כח-FL מכיל את fluorophore. כאשר עובד תחת המיקרוסקופ ויבתר, להפחית כמה שיותר את האור.
    4. להוסיף oocytes 80 μL של AMP4-FL למשך 15 דקות ב- 40 מעלות צלזיוס.
      הערה: AMP4-FL מסופק כאלטרנטיבה מאגר-A Alt-B (Alt-A), או Alt-סי בחר AMP4-FL המאגר תלוי על איזו פליטה גל היא הרצויה.
  11. לשטוף oocytes ב µL 500 של WB 10 דקות בטמפרטורת החדר. דגירה oocytes ב µL 80 של דאפי במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף oocytes ב µL 500 של WB למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  12. פיפטה 12 µL של התקשורת נגד דהייה הרכבה במרכז שקופית מבלי להוסיף בועות הכימית. להעביר את oocytes עם כמה WB קטן ככל האפשר לתוך כלי התקשורת הרכבה ולהחיל על coverslip.
    1. להטות את coverslip בזווית, לאט ובעדינות למקם מעל הנוזל בשקופית. הימנעו מלחיצה על coverslip קשה מדי למנוע עיוות של oocytes, הקדמה של בועות.
    2. אחסן את השקופיות תיבה כהה לילה יבש בטמפרטורת החדר. מעיל קצות השקופיות לק ברור לאטום coverslip.
  13. השתמש מיקרוסקופ רגיל כדי למצוא oocytes על שקופיות, מעגל עם סמן קבוע.
    הערה: שלב זה אינו נדרש, אך משפר את oocytes איתור בשקופית. לקבלת תוצאות מיטביות, תמונות שקופיות בתוך 1-5 ימים כמו האות פלורסנט יתחיל לדעוך.

4. עיבוד תמונה

  1. תמונה של oocytes תלת-ממדי, באמצעות z שלב קונפוקלית.
    הערה: כדי לנתח במדויק את התמונות, כל שלב z להיות מיקרומטר 1.0/פרוסה.
  2. שמור תמונות קונאפוקלית של nd2 דחוס או בודדים. קובצי TIFF עבור כל oocyte. שני הסוגים תמונה תואמים התוכנית עיבוד התמונה קוד פתוח, פיג'י.
  3. הורד והתקן את התוכנה פיג'י גישה פתוחה (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
    1. לגרור קבצים nd2 פיג'י, לבחור hyperstack. אם תמונות קונאפוקלית נשמרו בתור. קובצי TIFF דלג לשלב 4.4.
      הערה: כאשר הקובץ nd2 הוא נפל לתוך פיג'י מהרשימה הנפתחת hyperstack אמורה להופיע באופן אוטומטי.
    2. לחץ על הכרטיסיה תמונה לבחור צבע, לחץ על פצל ערוצים כדי להפריד בין הערוצים פלורסנט של הקובץ nd2.
    3. צור בודדים. קובצי TIFF לכל z-פרוסה של oocyte בכל אחד מהערוצים פלורסנט. לחץ על הכרטיסיה תמונה , בחר את סטאקסולאחר לחץ על אוסף תמונות. לחץ על הכרטיסיה תמונה , בחר סוג, לחץ על צבע RGB כדי להמיר כל פרוסה z תמונת צבע RGB בודדים.
      הערה: צבע RGB הוא מלאכותי, יכול להיות נבחרת הרצוי עבור כל גל פליטה.
    4. שמור כל תמונה המומר. קובץ TIFF. מקם תמונות oocyte יחיד לכל ערוץ פלורסנט בתיקייה חדשה כדי למנוע בלבול במהלך תפרים (שלב 4.3).
  4. לנרמל את אחד. תמונות TIFF עבור Pou5f1 ו- Nanog שימוש בתמונות שליטה שלילי (DapB).
    הערה: נורמליזציה מתבצעת באמצעות בתוכנית לעריכת תמונות. הקפד להסיר רמות זהות פלורסצנטיות רקע מתמונה כל שליטה.
  5. פתוח אחד מנורמל. קובץ TIFF בפיג'י לתפור יחד כל z-פרוסות עבור כל oocyte ב כל אורך הגל.
    1. לחץ על הכרטיסיה תוספים , בחר Stitching, ולחץ על רשת/אוסף (איור 3 א). בחר תמונות רציפים בתפריט הנפתח, לחץ על אישור (איור 3B).
    2. ספריית עיון, בחר את התיקיה המכילה את כל התמונות פרוסות z עבור oocyte בודדים-גל אחד (ראה שלב 4.3.4). לחץ על אישור.
    3. הזז את המחוון בתחתית התמונה תפור לערוץ הצבע המתאים עבור הגל המשמש ו ליצור את התמונה הסופית תפור RGB על-ידי לחיצה על התמונה, בחירת סוג, לחץ על צבע RGB.
      הערה: תמונה זו ישמש עבור כימות פלורסצנטיות שמתואר בשלב 4.6 להלן.
  6. המירו את התמונה תפור לתמונה המוקרנת מקסימום 32 סיביות. לחץ על התמונה, בחר סוג, ולחץ על ' 32-bit (איור 3C). שמור את התמונה הזו חדשה. קובץ TIFF.

figure-protocol-2
איור 3 : תפרים יחד של z קונאפוקלית-סדרת תמונות של oocytes. (א) המסך מציג את הכלי יישום plug-in רשת/אוסף בפיג'י שבה השתמשת כדי להפיק תמונות ללא הפרדות צבע של oocyte. (B) תמונות רציפים משתמש פלורסצנטיות חפיפה בין רציפים. קובצי TIFF כדי ליצור תמונה מורכבת. (ג) תמונה מורכבת נשמר כמו 32 סיביות. קובץ TIFF. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

  1. הורד והתקן את מציאת נקודה, מעקב אחר תוכנית13, אשר זמין מאתר האינטרנט של D.R. לארסון, חוקר במוסדות של הבריאות הלאומית המכון הלאומי לסרטן (https://ccr.cancer.gov/Laboratory-of-Receptor-Biology-and-Gene-Expression/daniel-r-larson). הורד והתקן את גישה פתוחה וירטואלי עבור מערכת ההפעלה של נתונים אינטראקטיביים שפה (מסוג IDL) אשר נדרש כדי להפעיל את המקום למצוא תוכנית מעקב (http://www.spacewx.com/pdf/idlvm.pdf).
  2. פתחו את התמונה 32 סיביות, תפור, אשר נוצר בשלב 4.6 (איור 4A), מציאת מקום, תוכנית מעקב. בחר מהרשימה הנפתחת Localize ולחץ Localize (איור 4B), אשר יחשב את מספר הנקודות נמצא בתמונה.
    הערה: בכל מקום נספרים מייצג של mRNA בודדות. הגדרות הסף פוטון ותעודת הלהקה מוצגים צילום מסך (איור 4B). עבור פרוטוקול זה, שימש ברירת המחדל עבור כל הגדרה הסף. נציג חיובי ולנקודות רקע מוצגים (איור 4C).

figure-protocol-3
איור 4 : כימות של mRNAs באמצעות נקודת מוצא ומעקב. (א) z בודדים-סדרת תמונות היו תפרו יחד כמתואר באיור 3 ונשמרו מקסימום 32 סיביות מוקרן. קובץ TIFF. (B) תמונה המשולב נפתח ב ספוט Finder ומעקב. בתרגום שימש כדי לספור את הנקודות פלורסנט (התיבה האדומה). סף ותעודת פוטון הלהקה מסומנים באמצעות התיבה הכחולה. (ג) החץ הכחול מצביע על איתות חיובי (מעל מפתן). החץ הלבן מראה של פלורסנט ספוט מתחת לסף וספרתי, לכן, לא. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

עם הסיום של הפרוטוקול, התוצאה תהיה תמונות בודדות מתוך קונאפוקלית z-סדרות (איור 4A ואיור 5), תפור תמונות (איור 4C), וסופרת mRNA (איור 4B). בעת ביצוע ריבוב, יהיו גם התמונות הממוזגות מציג את התווית עבור שני mRNAs שונים (איור 5). הסעיפים mRNA נוצרים באמצעות תמונות התפר שנוצר על ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

סדרה של צעדים קלים במהלך הפרוטוקול יבטיח פלורסצנטיות מוצלחת וספירות מדויק של mRNAs. ראשית, הפרוטוקול חייב להתבצע מיד לאחר איסוף של קיבוע oocytes. שימו לב כי PVP נוסף למאגר קיבוע paraformaldehyde 4% כדי למנוע oocytes נצמדים אחד לשני. מצאנו כי יש צורך לבצע את הניסוי מיד אחרי אוסף קיבוע oocytes. כל עיכוב תוצאות הרבה נמוך יותר קרינה פלואורסצנטית האות, כי כתוצאה undercounting של הפרוטוקולים. . זה בחלקו בשל RNA השפלה. Oocytes לא יותר מ 20 יש להעביר טוב בצלחת. ובכן 6 בבת אחת, כל טוב להשתמש בהם רק פעם אחת. הדגירה פעמים צריכה גם ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים יש ריהצהל

תודות

אנו מודים ד ר דניאל ר לארסון לעזרתו נדיב עם ההתקנה ואת השימוש מציאת נקודה, מעקב אחר תוכנית 13 ותמיכה טכנית של אוניברסיטת נברסקה לינקולן מיקרוסקופ הליבה עבור ההדמיה מיקרוסקופיה קונפוקלית. מחקר זה מייצג תרומה של האוניברסיטה של אגף המחקר החקלאי נבראסקה, לינקולן, נברסקה, נתמך על ידי קרנות הפתח UNL (נב-26-206/ההצטרפות-232435 ומספר נאב-26-231/ההצטרפות-1013511).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
(±)-&אלפא חומצה ליפואיתסיגמא-אולדריץ'T1395חומצה אלפא ליפואית
אלבומין, סרום בקר, חומצת שומן נמוכהMP Biomedicals, LLC199899FAF BSA
BD 10 מ"ל מזרק שחפתבקטון, דיקינסון וחברה30965910 מ"ל מזרק
BD PrecisionGlide מחטבקטון, דיקינסון ושות'30510927 1/2 מד מחט
סידן כלוריד דיהידראטסיגמא-אולדריץ'C7902CaCl2-2H2O
חומצת לימוןסיגמא-אולדריץ'C2404ציטראט
D-(+)-גלוקוזסיגמא-אולדריץ'G6152גלוקוז
דיסודיום פוספטNa2HPO4
אחיזה קלה צלחת פטריפלקון קורנינג35100835 מ"מ צלחת
אדטט דיסודיוםאוונטור8994-01EDTA
מספריים בון משובחים במיוחדכלי מדע עדינים14084-08ישר, חד / חד, לא משונן, 13 מ"מ מספריים חיתוך
סרום בקר עובריאטלנטה ביולוגיS10250FBS
תמיסת ריאגנט ג'נטמיציןgibco15710-064Gentamicin
GlutaMAX-I (100X)gibco35050-061Glutamax
חותם זהב מיקרו כפכפיםחותם זהב303925 x 75 מ"מ שקופיות
גונדוטרופין, מסרום סוסות בהריוןסיגמאG4877eCG
hCG רקומביננטיNHPPAFP8456AhCG
היאלורונידאז, סוג IV-S: מאשכי בקרסיגמא-אולדריץ'H3884תכשיטני היאלורונידאז
בסגנון מלקחייםאינטגרה17-305Xמלקחיים 4-3/8 אינץ', סגנון 5F, ישר, מיקרו לסת עדינה
L-(+)-חומצה לקטית, חומצה חופשית MP Biomedicals, LLC190228L-לקטט
מגנזיום גופרתי הפטאהידראטסיגמא-אולדריץ'M2773MgSO4-7H2O
MEM חומצות אמינו לא חיוניותקורנינג 25-025-Clכיסוי מיקרוסקופ NEAA
זכוכיתפישר מדעי12-542-C25 x 25x 0.15 מ"מ תלושי כיסוי
Mm-Nanog-O2-C2 RNAscope ProbeAdvanced Cell Diagnostics501891-C2Nanog Probe
Mm-Pou5f1-O1-C3 RNAscope ProbeAdvanced Cell Diagnostics501611-C3Pou5f1 Probe
MOPSSigma-AldrichM3183
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148Paraformaldehyde
PES 0.22 um ממברנה סטריליתMillex-GPSLGP033RS0.22 um מסננים
פוליוויניל פירולידוןסיגמא-אולדריץ'P0930PVP
אשלגן כלוריסיגמא-אולדריץ'60128KCl
אשלגן פוספט מונו-בסיסיסיגמא-אולדריץ'60218KH2PO4
מגיב אנטי-דהייה זהבProlong invitrogenP36934מגיב אנטי-דהייה ללא DAPI
RNAscope DAPIאבחון תאים מתקדם320858DAPI
RNAscope FL AMP 1מגבר320852 אבחון תאים מתקדם
RNAscope FL AMP 2מגבר320853 אבחון תאים מתקדם
RNAscope FL AMP 3מתקדם מגבר 320854 אבחון תאים3
RNAscope FL AMP 4 ALT מגבר320855אבחון תאים מתקדם4 ALT A
RNAscope FL AMP 4 ALT B320856אבחון תאים מתקדם4 ALT B
RNAscope FL AMP 4 ALT C320857 אבחון תאים מתקדם4 ALT C
RNAscope ערכת ריאגנטים לזיהוי פלואורסצנטיאבחון תאים מתקדם320851ערכת ריאגנט FISH
בדיקת RNAscope בדיקה 3-plex בקרה שליליתאבחון תאים מתקדם320871בקרה שלילית
3-plex בקרה חיוביתאבחון תאים מתקדם320881בקרה חיובית
RNAscope בדיקה מדללאבחון תאים מתקדם300041בדיקה מדלל
RNAscope פרוטאז IIIאבחון תאים מתקדם322337פרוטאז III
RNAscope פרוטאז III & ערכת ריאגנטים IVאבחון תאים מתקדם322340ערכת פרוטאז
FISH RNAscope פרוטאז IVאבחון תאים מתקדם322336מחט פרוטאז IV
S/S עם Luer Hub 30GComponent Supply Co.NE-301PL-50מחט קהה 30 מד
נתרן ביקרבונטסיגמא-אולדריץ'S6297NaHCO3
נתרן כלוריסיגמא-אולדריץ'S6191NaCl
נתרן הידרוקסידסיגמא-אולדריץ'306576NaOH
נתרן פירובט, > = 99%סיגמא-אולדריץ'P5280תמיסת פירובט
6 באר צלחתAgtechincD18צלחת 6 באר
טאוריןסיגמא-אולדריץ'T8691
צלחת תרבית רקמותפלקון קורנינג353002צלחת 60 מ"מ
טריטון X-100סיגמא-אולדריץ'X100טריטון X-100
1 2 מגבר מגבר בדיקה RNAscope טאורין

מקורות

  1. Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (16), 9236-9241 (1999).
  2. MacK, E. M., Smith, J. E., Kurz, S. G., Wood, J. R. CAMP-dependent regulation of ovulatory response genes is amplified by IGF1 due to synergistic effects on Akt phosphorylation and NF-kB transcription factors. Reproduction. 144 (5), 595-602 (2012).
  3. Xie, F., Timme, K. A., Wood, J. R. Using Single Molecule mRNA Fluorescent in Situ Hybridization (RNA-FISH) to Quantify mRNAs in Individual Murine Oocytes and Embryos. Scientific Reports. 8 (1), 7930(2018).
  4. Ruebel, M. L., et al. Obesity modulates inflammation and lipidmetabolism oocyte gene expression: A single-cell transcriptome perspective. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 102 (6), 2029-2038 (2017).
  5. Borensztein, M., Syx, L., Servant, N., Heard, E. Mouse Oocyte Development. 1818, 51-65 (2018).
  6. Jansova, D., Tetkova, A., Koncicka, M., Kubelka, M., Susor, A. Localization of RNA and translation in the mammalian oocyte and embryo. PLoS ONE. 13 (3), 1-25 (2018).
  7. Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-611 (2001).
  8. Wang, F., et al. RNAscope: A novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
  9. Itzkovitz, S., van Oudenaarden, A. Validating transcripts with probes and imaging technology. Nature Methods. 8 (4), S12-S19 (2011).
  10. Derti, A., et al. ProbeDesigner: for the design of probesets for branched DNA (bDNA) signal amplification assays. Bioinformatics. 15 (5), 348-355 (1999).
  11. Larson, B., Malayter, D., Shure, M. Multiplexed Detection of Cytokine Cancer Biomarkers using Fluorescence RNA In Situ Hybridization and Cellular Imaging. BioTek Application Notes. , https://www.biotek.com/resources/application-notes/multiplexed-detection-of-cytokine-cancer-biomarkers-using-fluorescence-rna-in-situ-hybridization-and-cellular-imaging/ 1-5 (2016).
  12. Buxbaum, A. R., Wu, B., Singer, R. H. Single β-Actin mRNA Detection in Neurons Reveals a Mechanism for Regulating Its Translatability. Science. 343 (6169), 419-422 (2014).
  13. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophysical Journal. 82 (5), 2775-2783 (2002).
  14. Herrick, J. R., Paik, T., Strauss, K. J., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. Building a better mouse embryo assay: effects of mouse strain and in vitro maturation on sensitivity to contaminants of the culture environment. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (2), 237-245 (2016).
  15. Pohlmeier, W. E., Xie, F., Kurz, S. G., Lu, N., Wood, J. R. Progressive obesity alters the steroidogenic response to ovulatory stimulation and increases the abundance of mRNAs stored in the ovulated oocyte. Molecular Reproduction and Development. 81 (8), 735-747 (2014).
  16. Xie, F., Anderson, C. L., Timme, K. R., Kurz, S. G., Fernando, S. C., Wood, J. R. Obesity-dependent increases in oocyte mRNAs are associated with increases in proinflammatory signaling and gut microbial abundance of lachnospiraceae in female mice. Endocrinology. 157 (4), 1630-1643 (2016).
  17. Hirao, Y., Yanagimachi, R. Detrimental effect of visible light on meiosis of mammalian eggs in vitro. Journal of Experimental Zoology. , (1978).
  18. Takenaka, M., Horiuchi, T., Yanagimachi, R. Effects of light on development of mammalian zygotes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (36), 14293-14293 (2007).
  19. Komminoth, P., Werner, M. Target and signal amplification: Approaches to increase the sensitivity of in situ hybridization. Histochemistry and Cell Biology. 108 (4-5), 325-333 (1997).
  20. Hornick, J. E., Duncan, F. E., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Multiple follicle culture supports primary follicle growth through paracrine-acting signals. Reproduction. 145 (1), 19-32 (2013).
  21. Vlasova-St. Louis, I., Bohjanen, P. Feedback Regulation of Kinase Signaling Pathways by AREs and GREs. Cells. 5 (1), 4(2016).
  22. Gilbert, C., Svejstrup, J. Q. RNA Immunoprecipitation for Determining RNA-Protein Associations In Vivo. Current Protocols in Molecular Biology. 75 (1), 27.4.1-27.4.11 (2006).
  23. Kwon, S., Chin, K., Nederlof, M., Gray, J. W. Quantitative, in situ analysis of mRNAs and proteins with subcellular resolution. Scientific Reports. 7 (1), 16459(2017).
  24. Voigt, F., et al. Single-Molecule Quantification of Translation-Dependent Association of mRNAs with the Endoplasmic Reticulum. Cell Reports. 21 (13), 3740-3753 (2017).
  25. Halstead, J. M., Wilbertz, J. H., Wippich, F., Lionnet, T., Ephrussi, A., Chao, J. A. TRICK: A Single-Molecule Method for Imaging the First Round of Translation in Living Cells and Animals. Methods in Enzymology. 572, Elsevier Inc. (2016).
  26. Cookson, W., Liang, L., Abecasis, G., Moffatt, M., Lathrop, M. Mapping complex disease traits with global gene expression. Nature Reviews Genetics. 10 (3), 184-194 (2009).
  27. Houle, D., Govindaraju, D. R., Omholt, S. Phenomics: the next challenge. Nature Reviews Genetics. 11, 855(2010).
  28. Freimer, N., Sabatti, C. The Human Phenome Project. Nature Genetics. 34, 15(2003).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

FISHmRNAFluorescence In Situ HybridizationOocyte PermeabilizationmRNA
השימוש יחיד מולקולה פלורסנט ב באתרו הכלאה (SM-דג) כדי mRNAs Quantify ו Localize ב Oocytes מאתר
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.