מאמר שיטה

מעקב משופר כלבת באמצעות מבחן אימונוהיסטוכימיה ישירה מהירה

10.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59416

⸱

30 באפריל 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Animal and Plant Health Inspection Service (APHIS), Wildlife Services, Knoxville, TN, United States Department of Agriculture (USDA), 2Animal and Plant Health Inspection Service (APHIS), Wildlife Services, Sutton, MA, United States Department of Agriculture (USDA), 3Animal and Plant Health Inspection Service (APHIS), Wildlife Services, Milton, FL, United States Department of Agriculture (USDA), 4Animal and Plant Health Inspection Service (APHIS), Wildlife Services, Concord, NH, United States Department of Agriculture (USDA), 5Lyssa LLC

במאמר זה

סיכום

מבחן אימונוהיסטוכימיה מהירה ישירה (DRIT) מציע ארגון עולמי לבריאות בעלי חיים וארגון הבריאות העולמי (OIE/מי) המזוהה נגד נוגדן פלורסנט ישירה (DFA) מבחן לאבחון כלבת. בדיקה זו מאפשרת יישומים מבוססי שדה שניתן לבצע בתוך כ 1 שעות על רשמים במוח באמצעות מיקרוסקופ אור.

תקציר

מעקב מבוסס מעבדה הוא אינטגרלי עבור מניעת כלבת, שליטה וניהול מאמצים. בעוד DFA הוא תקן זהב לאבחון כלבת, יש צורך לאמת טכניקות אבחון נוספות כדי לשפר את מעקב הכלבת, במיוחד במדינות מתפתחות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול סטנדרטי עבור ה-DRIT כאפשרות בדיקה חלופית, מעבדה או מבוססת שדה המשתמשת במיקרוסקופ אור לעומת DFA. טביעות מגע של רקמת המוח שנאספו מבעלי חיים חשודים קבועים ב 10% פורמאלין מאגור. The DRIT משתמש וירוס כלבת-שבטיים ספציפי או נוגדנים שבטיים (מצופנים ל biotin), אנזים streptavidin-peroxidase, וכתבת כרומוגן (כגון מרחריל 3-אמינו -9-ethylcarle) כדי לזהות הכללות ויראליות בתוך הרקמה הנגועה. בתוך 1 h, דגימת רקמות המוח ניתן לבחון ולהתפרש על ידי DRIT. הערכה של מוחות בעלי חיים חשוד נבדק מתוך מגוון רחב של מינים בצפון אמריקה, אסיה, אפריקה, ואירופה מומחשים רגישות גבוהה וספציפיות על ידי DRIT מתקרב 100% עם תוצאות לעומת DFA. מאז 2005, התוכנית של משרד החקלאות של מחלקת שירותי בעלי חיים בארה ב ביצעה בקנה מידה גדול של מאמצים משופרים לכלבת באמצעות ה-DRIT כדי לבחון > דגימות שנאספו מחיות בר בתחומי ניהול אסטרטגי של כלבת . ה-DRIT מספק כלי רב עוצמה וחסכוני לאבחון כלבת, שניתן להשתמש בו על ידי מעבדות וביולוגים שדות כדי לשפר את הפיקוח, תוכניות המניעה והבקרה הנוכחיות של הכלבת.

מבוא

בעוד dfa הוא המבחן הנפוץ ביותר עבור אבחון כלבת שגרתית1, העלות של רכישת ושמירה על מיקרוסקופ פלורסנט יכול להיות מגביל למדינות מתפתחות2,3,4 ועבור רחבה, תוכניות מעקב משופרות בקנה מידה גדול של כלבת3,4. בנוסף, DFA דורש את היכולת להכניס דגימות למקרר במהלך קיבעון לבין הדגימות דגירה מעל טמפרטורת הסביבה במהלך התגובות נוגדנים-אנטיגן, אשר יכול להיות משוכה משמעותית במדינות ללא תשתית מתאימה. בהתאם למגבלות הקשורות לבדיקות DFA מודרניות, ההשפעה הגלובלית של כלבת כבר מזמן לא העריכו את5.

בהקשר זה, יש צורך לאמת טכניקות אבחון נוספות כדי לשפר את מעקב הכלבת ברחבי העולם, בעיקר במדינות מתפתחות. פרוטוקול DRIT המוצג כאן מציע חלופה בדיקה מעבדה או מבוססת על שדה DFA המשתמשת מיקרוסקופ אור אינו דורש קירור או מעבדה דגירה במהלך המבחן6. ה-DRIT ו-DFA דומים בכך ששתי הטכניקות משתמשות בטביעות מגע של דגימות מוח שנאספו מחיות שעשויות להיות בעלי כלבת-נגוע. עם זאת, השלב הראשון של ה-DRIT משתמש בפורמאלין כקיבעון היסטורי לדגימות, המבטלת את נגיף הכלבת. זה מספק שיפור ביולוגי משמעותי על האצטון המשמש כדי לתקן דגימות בפרוטוקול DFA3, אשר חשוב לא רק במעבדה, אבל אולי אפילו יותר בסביבות מעבדה מבוססי שדה או מבוזר. עד היום, drit מראה רגישות וספציפיות שווה dfa2,7,8,9.

מאז 2005, התוכנית של משרד החקלאות האמריקאית ביצעה מאמצים משופרים בתחום הכלבת בצפון אמריקה תוך שימוש ב-DRIT כחלק מתוכנית הניהול המקיפה של כלבת החיות10. מעקב משופר כלבת משמש כהשלמה לחשיפה מבוססת על בריאות הציבור מעקב ובדיקות בעיקר חיות מיני-טורף מינים, כולל דביבונים (לוטור לובל), בואשים פסים (מפיטיס מפיטיס), שועלים אפורים ( שועלים אדומים (וולפסי), וזאביערבות (כלב לאטטרנס) שלא היו מעורבים בחשיפה אנושית או בעלת חיים במשפחה. גוויות בעלי חיים המשמשות בבדיקות הוגשו לשירות משרד החקלאות באמצעות מאמצי מעקב משופרים וכללה מינים וקטוריים של כלבת שאינם: משחק מסוכן או מוזר; נמצא מת, נהרג כביש או מטרד; ואינם משויכים לחשיפה לבעלי חיים אנושיים או ביתיים. DRIT מספק מבחן אבחון כלבת שיכול להיות מועסק על ידי ביולוגים שדה מאומנים עם ניסיון קטן או לא מעבדה כדי לשפר את הפיקוח על הכלבת ולהפחית את הנטל הפיננסי ואת עומס העבודה של מעבדות אבחון בריאות הציבור10. הכשרה DRIT בסיסית עבור עובדי התחום של משרד החקלאות בדרך כלל לוקח 1.5 כדי 2 ימים, אשר כולל כ 4 h של הוראת כיתה כיסוי עקרונות בסיסיים של biosafety טיחות, שיטות איסוף לדוגמה ואת תהליכי DRIT, כמו גם > 8 h של זמן המעבדה מתנהל במבחן. הזדמנויות הכשרה היו זמינים משרד החקלאות ומפעילי התוכנית דרך המרכזים לבקרת מחלות ומניעה (CDC), LYSSA LLC, ואת המכון Wistar.

בתחומי הניהול האסטרטגי, משרד החקלאות הבין בודק למעלה מ-94,000 דגימות חיות הבר באמצעות DRIT וזיהה יותר מ-1,850 דגימות נגוע בכלבת, כי היה סביר להניח שאינם מזוהים להסתמך רק על חשיפה מבוססת בריאות הציבור של חיות חשוד. מעקב משופר של מידע כלבת שסופקו על-ידי תוצאות DRIT הם קריטיים לספק הזמן מלאה יותר וייצוג מרחבי של כלבת על הנוף לתמיכה של תוכניות חיסון אוראלי לכלבת עבור חיות בר ברחבי ארה ב10, . בסדר, 11 באופן דומה, סוכנויות חיות הבר מחוזי בקנדה שילבו DRIT לתוך קנה מידה גדול כלבת חיות מעקב מאמצי בשילוב עם תוכניות בריאות הציבור שלהם עם הצלחה8. הן משרד החקלאות ותוכניות המעקב הקנדי DRIT השתמשו במעבדות התייחסות לאומיות כדי לאשר כלבת על ידי DFA ולבצע משתנה ויראלי הקלדה כראוי8. יתר על כן, ביולוגים משרד החקלאות לשלוח 10% של דגימות שליליות עבור אישור DFA להפנות מעבדות ומאז 2008, השתתפו בדיקות מיומנות DRIT השנתי שסופקו על ידי המעבדה הממלכתית של ויסקונסין היגיינה, כחלק סטנדרטי אמצעי הבטחת איכות.

מטרת שיטה זו היא להציע גישה חלופית לבדיקות אבחון כלבת שניתן לבצע במעבדות מבוזרות, בתחום, או באזורים ללא גישה שגרתית למיקרוסקופיה אלקטרונית.

פרוטוקול

כל אדם המבצע בדיקות אבחון כלבת צריך לקבל סדרת חיסון טרום חשיפה לכלבת כלבת ולעבור הערכת נוגדנים שוטפת לאבחון, עם החיסון המאיץ לפי הצורך. אנשים שאינם מחיסונים לא צריכים להיכנס למעבדות או אזורים שבהם עבודה כזאת מתנהלת. כל מניפולציה של רקמות ושקופיות צריך להתבצע כדי לא ניקה נוזלים או לייצר חלקיקים מוטס. בגדי מנדפים אינם נדרשים, אך בזמן האפשרי הם יכולים לספק הגנה נוספת מפני ריחות, ectop, ושברי עצמות. מינימום ציוד מגן אישי, כולל כפפות והגנה על העין, יש לענוד בכל עת במהלך איסוף ובדיקות לדוגמה.

1. איסוף גזע המוח

  1. לאסוף דגימות המוח או מיד על אוסף גווייה או לוודא כי הגוויות ממוקמות מקפיאים לאחסון עד בדיקות מאוחרות יותר. אם הגוויות של בעלי חיים קפואות, הפשרת בטמפרטורת הסביבה לפני איסוף המוח בשביל להקל על האיסוף. בנסיבות מסוימות, הדגימות נאספים ישירות מחיה קפואה.
  2. עבור בעלי חיים שנאספו טרי או שהיו מופשרים לטמפרטורת הסביבה, מיקום החיה פרקדן על משטח שטוח עם עמוד השדרה הצווארי מעט מסובב לכיוון הבוחן. על ההיבט הצדדי. של עמוד השדרה הצווארי
    1. לגוויות שעדיין קפואות לחלוטין, הציבו את מיקום החיה כמתואר לעיל, אם מעשי. השתמש מסורים, סכינים, מזמרה עצם או ציוד דומה כדי להפריד לחלוטין את הראש מהגוף.
      הערה: כל הציוד שבשימוש אינו צריך להתנקות ביסודיות בין דגימות.
  3. באמצעות להב אזמל, לעשות חתך ברמה של מפרק atlanto-העורף על ההיבט הגחוני, חיתוך דרך כל השכבות של השריר ורקמות רכות, כולל קנה הנשימה ואת הוושט. המשך עד שהוא מקורב להיבט הקדמי של חוליות עמוד השדרה הצווארי. עבור רקמה קפואה, השתמש להב אזמל כדי להסיר את כל השכבות הנותרות של רקמת השריר והרקמה הרכה כדי לחשוף את מגנום foramen.
  4. הזיזו את ראשו של בעל החיים לשלוחה של טווח הסיום עד שגבעול המוח יהיה גלוי. השתמש להב אזמל כדי להסיר את כל המוח נראה לעין/מערכת העצבים המרכזית (CN) רקמות לדיגום. לדוגמה קפואה, השתמש בלהב אזמל כדי להסיר את החלק הגדול מרקמת המוח הקפואה והפנימית ככל האפשר מתוך הגולגולת.
  5. מניחים את דגימות המוח במיכל בלתי שביר (כלומר, משחה מתכת פח, בקבוקון ההקפאה, וכו ') ותווית בהתאם.
  6. ודא כי דגימות גזע המוח נבדקים מיד לאחר איסוף באמצעות מבחן DRIT, קירור (4 ° c) עד 24 שעות לפני בדיקה, או קפוא (-20 ° c) עד הזמן של בדיקה אם הבדיקה יתקיים יותר מ 24 שעות לאחר איסוף המדגם.

2. הכנת חומרים ל-DRIT

  1. הגדרת 10 מנות מכתים שקופיות (איור 1)
    הערה: צביעת מנות עמוקים מספיק כדי לאפשר טבילה מלאה של שקופית (קוטר 96 מ"מ, גובה 72 מ"מ, עומק 42 מ"מ, נפח 250 mL). מיכל בן 6
    1. מילוי מנה 1 עם באגירה 10% פוספט. החלף את פורמלין לאחר הפעלת שני מבחנים או שבועי.
    2. מילוי מנות 2, 4, ו 5 עם מלוחים באגירה פוספט עם 1% רצף-80 (TPBS). החלף עם TPBS טרי לפני כל בדיקה.
    3. . מילוי צלחת 3 עם 3% חמצן מימן . תחליף מי חמצן לפני כל בדיקה
    4. ממלאים את הכלים 6, 8, 9, ו -10 עם מים מזוקקים או מוהים. להחליף מים לפני כל בדיקה.
    5. מילוי צלחת 7 עם הניסוח זימים המטאוקסילין2 מדולל ביחס 1:1 במים מזוקקים6. החלף את המטאוקסילין לאחר הפעלת 2 בדיקות או שבועי.
      הערה: על פי פרוטוקול DRIT המקורי שפותחה על ידי ה-CDC12, יחס 1:2 של זימים המטאוקסילין למים ניתן להשתמש אם כתמים הנגד הוא כהה מדי.
  2. הכנת פתרון מניות של אמינו-אתילקרזולה (AEC)
    1. באמצעות פיפטה זכוכית, מקום 5 מ ל של N, N-diמתילפימיד במיכל זכוכית.
    2. להוסיף 1 20 mg לוח של 3-אמינו -9-ethylcarבזולה ולנער עד התפרקה לחלוטין. סמן את הצנצנת באמצעות "AEC stock" ואת התאריך שבו ביצע המניה.
      הערה: פתרון מניות AEC ניתן לאחסן תחת קירור (4 ° c) ומשמש 1-2 חודשים.
  3. הכנת דילול העבודה של AEC
    1. הוסף 7 מ ל של מאגר אצטט ל 15 מ ל זונדה צנטריפוגה.
    2. באמצעות פיפטה זכוכית, להוסיף 0.5 mL של פתרון מניות AEC לשפופרת צנטריפוגה.
    3. הוסף 0.075 mL של 3% חמצן מימן לצינור.
    4. לסנן את הפתרון עם מזרק 10 מ ל באמצעות פילטר מזרק 0.45 יקרומטר.
      הערה: דילול העבודה AEC יש ליצור רק לפני כל מבחן DRIT כפי שהוא יציב רק עבור 2-3 h.

3. בדיקת אימונוהיסטוכימיה ישירה מהירה

  1. תווית מיקרוסקופ זכוכית שקופיות עם מספר ייחודי עבור כל דגימה באמצעות הכתם הוכחה, עמיד למים, סמן דיו קבוע.
    1. באמצעות להב אזמל, להסיר את גזע המוח מן המיכל ומניחים על מגבת נייר. בעדינות למחוק את כל עודף של נוזל, דם, או פרווה עם מגבת נייר שנייה כדי לחשוף רק את רקמת גזע המוח13. במקרה הצורך, החלק את רקמת המוח כדי לחשוף חתך רוחב.
    2. גע בעדינות מאוד את שקופית המיקרוסקופ לחתך הצלב של רקמת גזע המוח. לגעת בשקופית כדי המוח בנקודות מספר ללא תנועה לרוחב כדי לאפשר אזורים מרובים של גזע המוח להיות מועברים שקופית13. ודא שרק 1 או 2 שכבות של תאים מועברים מרקמת המוח לשקופית בנגיעה עדינה. אין צורך בסוכן לצרף את רקמת המוח לשקופיות. כלול הן שליטה חיובית ושלילית בכל הפעלה של DRIT.
  2. תנו לשקופיות להתייבש באוויר במשך כ -5 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. הישאב את השקופיות ב-10% במאגר האגירה עבור 10 דקות (מנה 1).
  4. הסר את השקופיות מפורמאלין וטבול-שטוף בתמיסה של TPBS (מנה 2).
  5. לטבול את השקופיות 3% חמצן מימן עבור 10 דקות (צלחת 3).
  6. הסר את השקופיות מתחמוצת המימן ושטוף מטבל ב TPBS טרי (צלחת 4). לאחר הסרת חמצן עודף מימן, למקם את השקופיות TPBS טרי (צלחת 5) ולעבוד עם שקופית אחת בכל פעם, בעוד השקופיות האחרות להישאר שקוע ב TPBS.
  7. קח את השקופיות מ TPBS (מנה 5) אחד בכל פעם, להתנער ולמחוק מאגר עודף, ולהניח על מגבת נייר לחלח על ספסל במעבדה, כבסיס של "חדר לחות". באמצעות הפיפטה, ירידה מספיק נוגדן וירוס הראשי נגד כלבת על כל שקופית כדי לכסות את רקמת ה-CN. הנחת השקופיות למשך 10 דקות בחדר הלחות (כלומר, כיסוי שקופיות עם לוחות היטב או כיסוי פשוט אחר בזמן שהם מונחים על מגבת נייר הרטובה) בטמפרטורת החדר (איור 2).
  8. הסר את השקופיות מחדר הלחות, טלטל ומלא את העודף המשלים, ושטוף את השקופיות ב-TPBS (שימוש חוזר באותו TPBS במנה 5).
  9. עבודה עם שקופית אחת בכל פעם, בעוד שאחרים נשארים שקועים ב-TPBS-משתמשים בפיפטה כדי להוריד מספיק streptavidin-peroxidase קומפלקס כדי לכסות את רקמת ה-CN. מודקון בחדר הלחות במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  10. הסר את השקופיות מחדר הלחות, טלטל ומחק את מורכבות העודפים, ושטוף את השקופיות ב-TPBS (מנה 5).
  11. עבודה עם שקופית אחת בכל פעם, לנער ולמחוק מאגר עודף, בעוד אחרים נשארים שקוע TPBS-להשתמש בצנרת כדי להוריד מספיק AEC (הכנה מוסבר לעיל ויש לעשות מיד לפני השימוש) כדי לכסות את רקמת ה-CN. מודקון בחדר הלחות במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  12. מטבל-לשטוף את השקופיות במים מזוקקים (צלחת 6).
  13. מניחים את השקופיות בכתם נגד של זימים המטאוקסילין (מדולל 1:1 עם מים מזוקקים) עבור 2 דקות (צלחת 7).
  14. לשטוף מיד לטבול את כל השקופיות מים מזוקקים (צלחת 8). חזרו פעמיים עם מים מתוקים בכל פעם (מנות 9 ו -10).
  15. עבודה עם שקופית אחת בכל פעם, בעוד שאחרים נשארים שקועים במים מזוקקים (מנה 10) — מטלטל ומוריד את המים העודפים ומשתמשים במדיום מסיסים במים כדי לצרף שובר כיסוי.
  16. השתמש במיקרוסקופ אור עם מטרה 20x כדי להציג את השקופיות ואת המטרה 40x אם הבדיקה הקרובה נחוצה.

תוצאות

תוצאות חיוביות של DRIT להראות אדום תאיים ויראלי הכללות שיכולות להשתנות בצורה ובגודל (איור 3) בתוך הציטופלסמה של גופים תא כחלחל. ההכללות מופיעות חלקות עם שוליים בהירים מאוד ואזור מרכזי פחות מוכתם באופן אינטנסיבי. העוצמה והתפלגות האנטיגן נרשמים בעת זיהוי הכללות. העוצמה מדורגת מ-+ 4 ל-+ 1. שקופית השליטה החיובית צריכה להיות בעלת ברק מגנטה אינטנסיבי ומבריק, המכונה בעוצמה של +4. אובדן קל של צבע יכול להתרחש במיוחד כאשר טיפול לדוגמה לא היה אופטימלי (כלומר, רקמה לדוגמה יש מפורקת מעט) ואת אלה יש לציון כמו +3. כתם עמום במידה ניכרת מדורגת כמו + 2 כדי + 1, לא נחשב אבחון עבור זיהום וירוס בכלבת והוא מתויג כמו לא מוגדר.

בנוסף, התפלגות אנטיגן מדורגת מ + 4 ל + 1 עם + 4 המייצג התפלגות אנטיגן מורכב שפע של הכללות גדולות וקטנות שונות בגודל וצורה, וההווה בכל שדה (או כמעט כל שדה) של השקפה בתוך רקמת ה-CN . התרשמות ממגע לפקד החיובי יש בדרך כלל התפלגות אנטיגן + 4. התפלגות אנטיגן של +3 תוקצה כאשר יש הכללות במגוון גדלים ברוב התחומים, אך לא בכל תחומי התצוגה. אם נמצאו הכללות ב-10%-50% משדות המיקרוסקופ, מוקצית התפלגות אנטיגן + 2. כאשר נמצאו הכללות ב-< 10% משדות המיקרוסקופ, מוקצית התפלגות אנטיגן +1.

רוב רקמת מערכת החשמל עם נגיף הכלבת נוכח הצגת הכללות ויראליות אופייני מדורגים כמו +3 או +4 התפלגות אנטיגן. אם התוצאות מציינות את האינטנסיביות + 2 או +1 או את התפלגות האנטיגן + 2 או +1, המדגם מוצהר על בדיקת "לא מוגדר" ובדיקה חוזרת מוצדקת. אם לאותה דגימה יש תוצאת בדיקה לא מוגדר, יש לשלוח את המדגם למעבדת ייחוס עבור DFA או בדיקות confirmatory קשורות.

דגימת בדיקה באמצעות DRIT נחשב שלילי עבור אנטיגנים וירוס כלבת לאחר שקופית המכילה את רקמת ה-CN נסרקה בהגדלה של 200X או יותר ואין הכללות וירוסים טיפוסי מזוהים (איור 4). דגימות שליליות מפגינות תאים כחלחלים. עם כתמים קטנים או לא ספציפיים

figure-results-1
איור 1: ההתקנה של 10 מנות הצביעת השקופית עם ריאגנטים לבדיקה. המנות מסומנות בשם מגיב בסדר הדרוש כדי לעקוב אחר הפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: חדר לחות פשוט שנוצר עם מגבת נייר רטובה ולוחות תרבות תא.  תא לחות פשוט באמצעות מגבת נייר רטובה ולוחות תרבות התא מאפשר יישום מבוסס שדה.  אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: שקופיות הנציג של כלבת הכללות ויראליות חיוביות עם אינטנסיביות 4 ו +4 התפלגות אנטיגן. (A and B) להראות חיובי כלבת ויראלי הכללות ב 200x הגדלה. (C ו -D) להראות חיובי כלבת ויראלי הכללות ב 400 x הגדלה. קנה מידה ברים = 5 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: שקופיות מייצגות של דגימות שליליות ללא הכללות ויראליות של כלבת. (A ו- B) מראים דגימות שליליות עבור הכללות ויראליות של כלבת בהגדלה של 200 x. (C ו -D) מראים דגימות שליליות להכללות של כלבת בהגדלה של 400 x. קנה מידה ברים = 5 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: תמונות מייצגות של מתקני בדיקות DRIT בשימוש של משרד החקלאות. (א) מתקן בדיקה ניידת בטריילר סגור להובלה. (ב) הרכב בשעות הפנאי הותאם לבדיקת drit. (ג) drit בדיקת מתקן בשיתוף עם מעבדה באוניברסיטה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

DRIT היא שיטה גמישה המתאימה מבוסס שדה מעקב כדי לזהות את הנוכחות של וירוס כלבת כי ניתן להשתמש באזורי מעבדה מבוזרים. אמנם ניתן לבצע את הבדיקה כולה בהגדרה מבוססת שדה כגון על החלל הפנימי של משאית, זה אידיאלי יש מקום קטן, מקורה מוקדש DRIT בשל כימיקלים, ציוד אחסון בעיות האספקה. בנוסף, הקפדה על כל החוקים הפדרליים, המדינה והמקומיים, והתקנות לשימוש כימי ולסילוק החומרים חייבים להיחשב. כיום, משרד החקלאות האמריקנית מציע 15 מתקני DRIT כדי לבדוק דגימות מ -17 מדינות. מתקני משרד החקלאות הלאומית drit הוקמו בשיתוף עם האוניברסיטה ומעבדות בריאות הציבור המדיני, בחדרים מיועדים בתוך מתקנים גדולים ובטריילרים סגורים כי כבר הפכו והומרו לשמש יחידות בדיקה ניידות ב אירוע של תגובת התפרצות חירום שבה בדיקה משופרת של מעקב אחר כלבת עם זמן הטיפול המיידי הוא קריטי (איור 5).

בעוד הבדיקה הצליחה באמצעות חומר בדיקת גזע של איכות משתנה, רקמת המוח טרי ללא התפרקות רקמות הוא אופטימלי. כמו ריקבון, התייבשות, או ניזול מתרחשת, איכות לדוגמה פוחתת הבדיקה עשויה לגלות מכתים יותר לא ספציפי אשר יכול לבלבל את התוצאות. התבוננות זו דומה בין DFA לבין DRIT2. יש לאסוף את המוח במהירות האפשרית ולאחר מכן לאחסנם מוקפאים (-20 ° c) עד לבדיקה.

בדרך כלל, רוב מתקני משרד החקלאות מ 12 עד 24 שקופיות בבת אחת במהלך הפעלת DRIT, כולל אחד שליטה חיובית ושליטה אחת שלילית כי אושרו באמצעות DFA. פקדים חיוביים ושליליים מספקים נקודת התייחסות לכל הפעלה של DRIT כדי לוודא שהבדיקה הצליחה ולאשר אם השאלות המפרטיביות עולות על שקופיות הבדיקה. אם מדגם לא נקבע כתוצאה חיובית ברורה או שלילית, הוא מתויג כקבוע ונבדק פעם שנייה על-ידי DRIT. אם דוגמה זו אינה חיובית ברורה או שלילית לאחר שני בדיקות DRIT, הוא נשלח למעבדת התייחסות DFA או בדיקות קשורות.

כמו בכל מבחן אבחון, ' צרות ירי ' הוא שימושי עם ממצאים בלתי צפויים. לדוגמה, אם הפעלת DRIT אינה מצליחה (כלומר, הפקד החיובי אינו מוצג +3 או + 4 כתמים והפצת אנטיגן), ודאו שכל הכימיקלים והחומרים הכימיים לא פגו. מצאנו באמצעות בקבוק חדש שנפתח של תחמוצת מימן במינימום של פעם בשבוע הוא שימושי כדי לסייע למנוע מכתים לא ספציפיים דרך חמצון של רקמת המוח. בנוסף, אנו ממליצים להחליף מאגר אצטט לפחות פעם אחת בכל שנה לכל הפחות, ללא קשר לתאריך התפוגה של התווית.

ישנם מספר יתרונות של DRIT על DFA כולל עלויות נמוכות יותר, היכולת לבצע את הבדיקה מחוץ למעבדה מרכזית, צורך רק מיקרוסקופ אור במקום מיקרוסקופ פלורסנט, ואת תהליך האימונים פשוט יחסית עבור אנשים מנהל וקורא. את המבחן2,3,4 יתרונות אלה, ביחד עם רגישות וספציפיות של drit הדומות dfa2,7,8,9 כבר הוכיחו כי הבדיקה משמש כלי חשוב בקנה מידה רחב תוכניות מעקב משופרות כלבת8,10 בצפון אמריקה. בנוסף, DRIT יש פוטנציאל לאפשר מעקב מוגבר ובדיקות יותר בקשה במדינות מתפתחות או אזורים אחרים עם משאבים מוגבלים, במיוחד לאחר OIE האחרונות/מי הדרכה כמבחן מומלץ.

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

אנו מכירים את כל אנשי משרד החקלאות שירותי חיות הבר שאספו בעבר דגימות מעקב משופרות כלבת וניהלו את ה-DRIT לאבחון כלבת. כמו כן, אנו מכירים את הפעילים הרבים העוזרים לנו באוסף מעקב משופר עם כלבת. אנו מודים גם למרכזים לבקרת מחלות ומניעתן ולמכון וויסטאר לגישה לריאגנטים קריטי הנדרש לבצע את ה-DRIT ולספק הזדמנויות הכשרה. בנוסף, אנו מעריכים את האבחון הconfirmatory והסיוע הטכני המסופקים על-ידי המרכז לבקרת מחלות ומניעתן ועל ידי מרכז וודסוורת ' עם משרד הבריאות של מדינת ניו יורק. השימוש במוצרים מסחריים מיועד למטרות השוואה בלבד ואינו מהווה תמיכה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
3-אמינו-9-אתילקרבזול (טבליות AEC; 50 יחידות)סיגמא אולדריץ' (https://www.sigmaaldrich.com/)A6926
מאגר אצטט, 0.1M, 5.2 pH, 32 אונקיותPoly Scientific R& D Corp. (https://www.polyrnd.com/)s140
Ag Tek MiniScalpel, PN110, לא סטרילי #10, 40 לחבילהPatterson Veterinary (https://www.pattersonvet.com/)PN110ציוד משלים להדפסת מגע; זמין גם דרך Clipper Distributing (http://www.clipperdist.net/)
BD Luer-Lok מזרק חד פעמי ללא מחט, 10 סמ"קFisher Scientific (חלק מ-Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)14-823-2ABD מספר יצרן 309604
מיקרוסקופ אור דו-עיני עם ראש Seidentopf או שווה ערךמספר ספקים
כחול מלבני סילוק בדירוג UN-rated מיכל, אריזות 5Gברלין (https://www.berlinpackaging.com/)1147T01BLUציוד משלים לאחסון/סילוק פסולת כימית (תמיסת המטוקסילין ו-AEC של זימים)
כיסוי מרובעת ומלבנית של קורנינג, 24x60Fisher Scientific (חלק מ-Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)12-553-465מספר יצרן קורנינג 2975246
טיפים לפיפט התאמה אוניברסלית של קורנינג: מתלה, לא סטרילי (1-200ul)פישר סיינטיפיק (חלק מ-Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)07-200-300קורנינג מספר יצרן 4863
פלקון 15 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטיים, פוליפרופילןפישר סיינטיפיק (חלק מ-Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)14-959-70Cמספר יצרן קורנינג 352097
Falcon 96-Well Assay Plates (מכסי צלחת תרבית רקמות)Fisher Scientific (חלק מ-Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)08-772-5קורנינג מספר יצרן 353910
Fisher Brand מסנן מזרק 25 מ"מ, ניילון, 0.45 μ m, SterileFisher Scientific (חלק מ-Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)09-719D
Fisher Chemical Gill Method Hematoxylin Stain (Gill-2), 4LFisher Scientific (חלק מ-Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)CS401-1D
Fisherbrand Sharps-A-Gator מיכלי חדים לנקודת שימוש, 5 qtפישר סיינטיפיק (חלק מ-Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)14-827-122ציוד משלים להקמת מעבדה נכונה BSL-2
פלואורו-ג'ל עם Tris Buffer (ג'ל/הר מדיה), 20 מ"לVWR, חלק מ-Avantor (https://vwr.com)102092-122תחליף פלואורו-ג'ל לביו-מדה&סחר; Gel-Mount, Electron Microscopy Sciences
Formalin, Buffered, 10%, 4LFisher Scientific (חלק מ-Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)SF100-4זמין כל אחד או במקרה של 4
Gilson Pipetman P200 Pipet, 50-200 μ LDaigger Scientific (https://www.daigger.com)EF9930E
Hy-Clone Phosphate Buffered Saline, 1x Solution, 1 L (PBS)Fisher Scientific (חלק מ-Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)SH30256LSניתן להשתמש במוצר אבקה יבשה חלופי
מי חמצן, 3%ספקיםכל מקור זמין מסחרית, כגון מותגי בתי מרקחת או חנויות וכו'.
מיקרוסקופ עדשה אובייקטיבי 20x ו-40xספקים
Lysol IC מנקה חיטוי רבעוני, 1GDaigger Scientific (https://www.daigger.com)EF8481חומרים משלימים לחיטוי מעבדה תקין BSL-2
מותג Miltex אזמל חד פעמי גודל 22 (גודל חלופי ל-MiniScalpel)AMD Next (www.amdnext.com)999112314ציוד משלים לטביעות מגע לדוגמה; גודל חלופי ל-Ag Tek MiniScalpel
N,N-Dimethylformamide, אריזת זכוכית ענבר, 500 מ"לFisher Scientific (חלק מ-Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)D119-500
Peroxidase Labeled Streptavidin, 50 מ"לSeraCare (https://www.seracare.com/)5550-0001KPL Immunoassay and KITS מספר סימוכין 71-00-38
אבקת מלח בופר פוספט (חלופה ל פישר נוזלי PBS)סיגמא אולדריץ' (https://www.sigmaaldrich.com/)P3813חייב להיות מוכן במים מזוקקים של 1 ליטר; זמין בכמויות של 1, 10 ו-50 חבילות
נוגדן ראשוני: אנטי-נוקלאופרוטאין פוליקלונלי או קוקטייל של נוגדניםיש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C
PYREX צנרת סרולוגית חד פעמית, זכוכית, סטרילית, סתומה, קורנינג, 1.0 מ"לVWR, חלק מ-Avantor (https://vwr.com)7078D-1VWR מספר יצרן 89091-220
PYREX צנרת סרולוגית חד פעמית, זכוכית, סטרילית, סתומה, קורנינג, 10.0 מ"לVWR, חלק מ-Avantor (https://vwr.com)7078D-10VWR מספר יצרן 89091-106
PYREX צנרת סרולוגית חד פעמית, זכוכית, סטרילית, סתומה, קורנינג, 5.0 מ"לVWR, חלק מ-Avantor (https://vwr.com)7078D-5VWR מספר יצרן 89091-484
Richard-Allan Scientific Gills Hematoxylin Stain No. 2, 1PT (חלופה למעלה)Fisher Scientific (חלק מ-Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)22-050-201Thermo Scientific מספר יצרן 72504
מחזיקי שקופיות, VWR 24 מקומות, חלק מ-Avantor (https://vwr.com)25608-868סאקורה&רג; מספר ספק Finetek 4465; זמין דרך מספר ספקים
קופסאות פח לדוגמה, 1/2 אונקיותVWR, חלק מ-Avantor (https://vwr.com)101412-452ציוד משלים לאחסון דגימות רקמת מוח
טיילור טיימר/שעון דיגיטלי 2-אירועיםספקיםציוד משלים
ערכת צביעת שקופיות רקמות-טקVWR, חלק מאוונטור (https://vwr.com)25608-902סאקורה&רג; מספר ספק Finetek 4551; זמין דרך מספר ספקים
TWEEN 80, פוליאתילן גליקול, 500 מ"לסיגמא אולדריץ' (https://www.sigmaaldrich.com/)P1754זמין גם בנפחים של 25 מ"ל, 1 ליטר ו-1 גרם
VWR FLIP מילוי פיפטות (0.05-100 מ"ל)VWR, חלק מאוונטור (https://vwr.com)53497-055
כפפות בדיקת ניטריל רכות VWR, L (100 לקופסה)VWR, חלק מ-Avantor (https://vwr.com)89038-272ציוד משלים למים PPE מתאימים
, נטול יונים (20 ליטר)VWR, חלק מ-Avantor (https://vwr.com)10806-022
בקבוקוני דגימת זכוכית שקופה של Wheaton, 8 מ"לFisher Scientific (חלק מ-Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)06-408CDWK Life Sciences מספר יצרן 224884
מצופה לבן, שקופיות מיקרוסקופ בדוגמת באר כפולה, 14 מ"מTekdon Incorporated (https://www.tekdon.com/coated-microscope-slides.html)2-140
מיכל סילוק מלבני לבן בתעריף UN,אריזת 5G Berlin (https://www.berlinpackaging.com/)1147T01WHTציוד משלים לאחסון/סילוק פסולת כימית (פורמלין)
זכוכית מרובים מרובים ביוטיניליים נגד נגיף הליסה מרובים

מקורות

  1. Dean, D. J., Abelseth, M. K., Atanasiu, P. Laboratory techniques in rabies. Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Koprowski, H. 23, World Health Organization. eds 88-89 (1996).
  2. Durr, S., et al. Rabies diagnosis for developing countries. PLOS Neglected Tropical Diseases. 2 (3), e206(2008).
  3. Rupprecht, C., et al. Progress in the development of a direct rapid immunohistochemical test for diagnosing rabies. , (2014).
  4. Rupprecht, C. E., et al. Additional Progress in the Development and Application of a Direct, Rapid Immunohistochemical Test for Rabies Diagnosis. Journal of Veterinary Science. 5 (2), (2018).
  5. Coleman, P. G., Fevre, E. M., Cleaveland, S. Estimating the public health impact of rabies. Emerging Infectious Diseases. 10 (1), 140-142 (2004).
  6. Standard Operating Procedure for the Direct Rapid Immunohistochemistry Test (DRIT) for the detection of rabies virus antigens. , Centers for Disease Control and Prevention. (2016).
  7. Lembo, T., et al. Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis. Emerging Infectious Diseases. 12 (2), 310-313 (2006).
  8. Middel, K., Fehlner-Gardiner, C., Pulham, N., Buchanan, T. Incorporating Direct Rapid Immunohistochemical Testing into Large-Scale Wildlife Rabies Surveillance. Tropical Medicine and Infectious Disease. 2 (3), 21(2017).
  9. Coetzer, A., Sabeta, C. T., Markotter, W., Rupprecht, C. E., Nel, L. H. Comparison of biotinylated monoclonal and polyclonal antibodies in an evaluation of a direct rapid immunohistochemical test for the routine diagnosis of rabies in southern Africa. PLOS Neglected Tropical Diseases. 8 (9), e3189(2014).
  10. Kirby, J., et al. Enhanced Rabies Surveillance to Support Effective Oral Rabies Vaccination of Raccoons in the Eastern United States. Tropical Medicine and Infectious Disease. 2 (3), 34(2017).
  11. Slate, D., et al. Oral rabies vaccination in north america: opportunities, complexities, and challenges. PLOS Neglected Tropical Diseases. 3 (12), e549(2009).
  12. Direct Rapid Immunohistochemistry Test (DRIT) protocols. , Available from: https://rabiessurveillanceblueprint.org/Direct-Rapid-Immunohistochemistry?lang=fr (2019).
  13. Khalid, A., Haque, A. Touch Impression Cytology Versus Frozen Section as Intraoperative Consultation Diagnosis. 2, (2004).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Touch ImpressionAECGill s Hematoxylin10TPBS

מאמרים קשורים