מאמר שיטה

נוהל הפעלה רגיל של מעקב וירוס של אוכלוסיית העטלף בטייוואן

DOI:

10.3791/59421

⸱

27 באוגוסט 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Animal Health Research Institute, Council of Agriculture, Executive Yuan, 2Institute of Ecology and Evolutionary Biology, National Taiwan University, 3Bat Conservation Society of Taipei

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מציג נוהל הפעלה מעבדה סטנדרטית עבור בדיקות אבחון של אנטיגנים lyssavirus ירוס בעטלפים בטייוואן.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

וירוסים בתוך הסוג lyssavirus הם zoonotic פתוגנים, ולפחות שבעה מינים lyssavirus קשורים למקרים אנושיים. בגלל עטלפים הם מאגרי הטבע של רוב lyssaviruses, תוכנית מעקב lyssaviruses של עטלפים נערך בטייוואן מאז 2008 כדי להבין את האקולוגיה של וירוסים אלה עטלפים. בתוכנית זו, ארגונים לא ממשלתיים לשימור ומרכזים מקומיים לבקרת מחלות בעלי חיים שיתפו פעולה לאיסוף עטלפים מתים או עטלפים המתים מחולשה או ממחלות. רקמות המוח של עטלפים הושגו באמצעות נקרופסי ונתון לבדיקה אנטי פלואורסצנט פלורסנט ישירה (FAT) והפוכה תמלול שרשרת פולימראז (RT-PCR) לאיתור של אנטיגנים lyssavirus וחומצות גרעין. עבור ה-FAT, מומלץ לפחות שתי שערי מעלה של אבחון כלבת. עבור ה-RT-PCR, שני סטים של התחל (JW12/N165-146, N113F/N304R) משמשים כדי להגביר רצף חלקי של הגן הנואופפרוטאין ליקיה. תוכנית ההשגחה הזאת עוקבת אחר. וירוסים וסוכני zoonotic אחרים בעטלפים טייוואן בת lyssavirus נמצא בשני מקרים של pipistrelllllllllllllllllllllllllllllllllllla ממצאים אלה צריכים ליידע את הציבור, אנשי הבריאות, ומדענים של הסיכונים הפוטנציאליים של יצירת קשר עם עטלפים וחיות בר אחרות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

וירוסים בתוך הסוג Lyssavirus הם zoonotic פתוגנים. יש לפחות שבעה מינים ליסביסםקשורים למקרים אנושיים1. בנוסף 16 מינים בסוג זה1,2,3, טייוואן בת lyssavirus (twblv)4 ו kotalahti בת lyssavirus ירוס5 זוהו לאחרונה עטלפים, אבל המצבים הטקמיים שלהם עדיין לא להיקבע.

עטלפים הם המארחים הטבעיים של מרבית lyssaviruses, למעט מוקדי lyssaviruses וירוס ikoma, אשר עדיין לא זוהו בכל עטלפים1,2,3....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. אמצעי זהירות בטיחות בטיפול בווירוסים

  1. ודא כי כל עובדי המעבדה המטפלים בדגימות העטלף מקבלים טיפול טרוםחשיפה לכלבתמניעה. לעקוב אחר רמות נוגדן הכלבת של העובדים מראש ולבחון אותם מחדש כל 6 חודשים17. הטיפול החיסון נגד כלבת נדרש עבור אלה שרמות הנוגדן שלהם נמוך מ 0.5 IU/mL17.
  2. בהתאם לתקנות אבטחה טיחות של המדינה שבה המעבדה ממוקמת, להבטיח כי ההליכים הבאים מבוצעים במעבדות ברמה אבטחה טיחות מתאימה (למשל, bsl-2 מעבדות בטייוואן ו bsl-3 מעבדות באוסטרליה), וכי עובדים מוסמכים כיום ללבוש ציוד הגנה אישית נאותה18.
    הערה: חיסון נגד כלבת מספק מעט ללא הגנה מפני וירוסים השייכי....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מ 2014 עד מאי 2017, 332 בת גוויות מ -13 מינים נאספו עבור מעקב. . שני בדיקות חיוביות במקרה העטלף הראשון, את הרושם המוח נבדק שלילי באמצעות שומן עם אחד המסחרי FITC מצועם כלבת נגד נוגדנים (איור 2), בעוד RT-בדיקות העסקת כל אחת מערכות התחל (JW12/N165-146, N113F/N304R) הניב תוצאות חיוביות (איור 3). רצף של 428 bp של אמפליקון (מוגבר עם N113F/N304R והמכיל את הגן החלקי של נואופלפרוטאין) הושג. הרצף שלו היה נתון לביצוע שאילתות הפיצוץ של מסד הנתונים GenBank. התוצאה הראתה כי ה.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הליך זה תקן מעבדה הפעלה (SOP) מספק תהליך טורי לבדיקת דגימות עטלף לנוכחות של אנטיגנים lyssavirus בטייוואן. השלבים העיקריים כוללים את התעסוקה של FAT ו RT-PCR. הבחירה של דגימות מתאימות ובידוד מוצלח של הנגיף הם גם חשובים. בנוסף, פתרון בעיות מסוימות נערך במהלך הניטור של lyssaviruses העטלף. ההבדל העיקרי היה בעלי החיים המטרה. בתחילה (2008 – 2009), חיות היעד של מעקבים העטלף lyssavirus ירוס היו עטלפים חיים, אשר נלכדו באי Kinmen בטייוואן ולאחר מכן נבדק על lyssavirus לאחר המתת חסד. רוב העטלפים הלכודים היו בריאים ובלתי צפויים לשאת l.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין קונפליקטים של עניין מוצהר.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לטיין-צ'נג לי, יי טאנג לין, צ'יה-ג'ונג טסאי, ו-Ya-Lan Li על עזרתם במהלך המחקר. מחקר זה היה נתמך על ידי גרנט no 107AS-8.7.1-BQ-B2 (1) מן הלשכה של בעלי חיים ובריאות הצמח בידוד, מועצת החקלאות, ההנהלה יואן, טייוואן.

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2.5% טריפסין (10x)ג'יבקו15090046טריפסין
25 ס"מ2 בקבוקגריינר ביו-וואן690160
אצטוןHoneywell32201-1L
אגרוז IVWR מדעי החיים97062-250
אלכוהולניהון שיאקו ריאגנטNS-32294
AMV טרנסקריפטאז הפוךפרומגהM5101
אנטיביוטיקה-אנטי-פטריית(100X) Gibco15240-062MEM-10
להבבראוןBA215
צנטריפוגהאפנדורף5424R
מערכת כימיהTOP BIO CO.צינור איסוף MGIS-21-C2-1M
צינורQiagen990381
SSI2341-SO
שקופית כיסויMuto Pure chemical Co., LTD.24505
מנתח DNAApplied Biosystems3700XL
סרום בקר עובריGibco10437028MEM-10
FITC אנטי כלבת מונוקוליןשבטי Fujirebio Diagnostic Inc.800-092נוגדנים נגד כלבת מצומדים FITC: מגיב B
שקופית זכוכית בציפוי טפלון ארבע בארותThermo Fisher Scientific30-86H-WHITE
מערכת אלקטרופורזה ג'למדע ראשיMJ-105-R
HBSS (1x)חממת טריפסין Gibco14175095
ASTECSCA-165DS
מיקרוסקופ הפוךאולימפוסIX71
L-גלוטמין 200 מ"מ (100x)GibcoA2916801MEM-10
LIGHT DIAGNOSTICS מגיב שומןכלבת EMD Millipore Corporation5100נוגדנים נגד כלבת מצומדים FITC: מגיב A
MagNA Pure Compact InstrumentRoche03731146001
MagNA Pure Compact NA Isolation Kit 1Roche03730964001
MEM (10x)Gibco11430030MEM-10
MEM NEAA (100x)Gibco11140050MEM-10
MEM תמיסת ויטמיןGibco11120052MEM-10
NaHCO3Merck1.06329.0500MEM-10
מחטTerumoNN*2332R9
PBSMedicago09-8912-100
סינתזת פריימרMission Biotech
RNasin מעכב ריבונוקלאזPromegaN2111
שירות ריצוףMission Biotech
SlideThermo ScientificAA00008032E00MNT10
נתרן פירובט (100 מ"מ)Gibco11360070MEM-10
חרוזי נירוסטהQIAGEN69989
כרית סופגת סטרילית3M1604T-2
מסנן מזרקNalgene171-0045
Taq פולימראזJMR HoldingsJMR-801
Thermal cyclerApplied Biosystems2720
TissueLyser IIQIAGEN85300
מדכא לשוןHONJER CO., LTD.
פינצטהטניסון מכשירים רפואיים פיתוח ושות', בע"מA0601
טילוזין טרטרטסיגמאT6271-10GMEM-10
איסוף 122246

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kuzmin, I. V. Basic facts about lyssavirus. Current laboratory techniques in rabies diagnosis, research, and prevention, volume 1. Rupprecht, C. E., Nagarajan, T. , Elsevier. California. 3-21 (2014).
  2. Aréchiga Ceballos, N., et al. Novel lyssavirus in bat, Spain. Emerging Infectious Diseases....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

RT PCRJW12 N165 146

מאמרים קשורים