הערכה של מקונן אוניברסלי הפוכה תגובת שרשרת פולימראז לאיתור של Lyssaviruses

Summary

פאן-lyssavirus וירוס שעתוק הפוכה התגובה שרשרת פותחה כדי לזהות במיוחד את כל lyssavirus ידוע. אימות באמצעות דגימות מוח של כלבת ממינים שונים של בעלי חיים הראו כי שיטה זו יש רגישות וספציפיות שוות ערך לבדיקת נוגדן הפלורסנט הסטנדרטית וניתן להשתמש בה לאבחון כלבת שגרתית.

Abstract

כדי לזהות וירוס כלבת ומינים אחרים של הסוג Lyssavirus בתוך המשפחה התמס שריר, הפאן-lyssavirus מקונן הפוך תגובת שרשרת פולימראז (מקונן RT-PCR) פותחה כדי לזהות את האזור שימור של הגנים הנואופלפרוטאין (N) של ליסביזירוסים. השיטה מחילה הפוכה שעתוק (RT) באמצעות RNA ויראלי כמו תבנית ו oligo (dT)₁₅ ו הבוחנים אקראיים כמו התחל לסנתז את ה-DNA המשלים ויראלי (cdna). לאחר מכן, cDNA ויראלי משמש תבנית כדי להגביר 845 bp N מקטע גנים בסיבוב הראשון של ה-PCR באמצעות התחל החיצוני, ואחריו ה-PCR מקונן השני להגביר את הסופי 371 bp קטע באמצעות התחל הפנימי. שיטה זו יכולה לזהות שיטות גנטיות שונות של וירוסי כלבת (RABV). האימות, שימוש 9,624 דגימות מוח של שמונה מינים בעלי חיים ביתיים ב 10 שנים של אבחון כלבת קלינית ומעקב בסין, הראו כי השיטה יש 100% רגישות ו 99.97% ספציפיות בהשוואה עם פלורסנט ישירה מבחן נוגדן (FAT), השיטה הסטנדרטית זהב המומלצת על ידי ארגון הבריאות העולמי (מי) והארגון העולמי לבריאות בעלי חיים (OIE). בנוסף, השיטה יכולה במיוחד להגביר את המוקד המיועד N גן של 15 מאושרים אחרים ושני מינים lyssavirus הרומן בדוח 10 של הוועד הבינלאומי על טקסונומיה של וירוסים (ICTV) כפי שוערך על ידי זיהוי חיקוי של מסונתז . גן הפלזמה של כל הנגיפים השיטה מספקת חלופה נוחה ל-FAT עבור אבחון כלבת ואושרה כסטנדרט לאומי (GB/T36789-2018) של סין.

Introduction

כלבת היא מחלה zoonotic עולמית הנגרמת על ידי וירוסים בתוך הסוג Lyssavirus¹. Lyssaviruses (משפחה תמסשליליות) הם חד שליליים וירוסי RNA עם הגנום כ 12 kb המקודד חמישה חלבונים: N, פוספופפרוטאין (P), חלבון מטריצה (M), גליקופרוטאין (G), וחלבון גדול או פולימראז (L). מבוסס על רצפי נוקלאוטיד של N הגן, המרחק הגנטי, ודפוסי אנטיגניים, lyssaviruses חולקו 16 מינים, המורכב וירוס כלבת הקלאסי (RABV) ואת הקשורים לכלבת וירוסים (RRV): לאגוס וירוס בת (LBV), וירוס Duvenhage (DUVV ), וירוס מוקדי (מוקדי), העטלף האירופי lyssavirus 1 (EBLV-1), העטלף האירופי lyssavirus 2 (EBLV-2), העטלף האוסטרלי lyssavirus (ABLV), וירוס (ARAV), וירוס Ikoma (IKOV), Bokeloh בת lyssavirus (BBLV), בובת ליסביו וירוס (GBLV), Irkut וירוס (IRKUT), קוג'וירוס (ח'ו), וירוס עטלף קווקזי מערבי (WCBV), וירוס שמעוני בת (שימב), וליידה בת ליסביסוירוס (לואלין)². לאחרונה, שתי lyssaviruses נוספים זוהו: Kotalahti בת lyssaviruses (KBLV) בודד מן העטלף של ברנדט (Myotisברנטי) בפינלנד ב 2017³ ו-lyssaviruses ירוס בת טייוואן (twblv) מבודד pipistrellllllllllllllll Pipistrellus abramus) בטייוואן, סין בשנת 2016 – 2017⁴.

כל היונקים רגישים לכלבת; עם זאת, לא נגעים פתוגנוניים ברוטו או שלטים קליניים ספציפיים לאפשר זיהוי שלה, ואבחון יכול להתבצע רק במעבדה⁵. השיטה הנפוצה ביותר לאבחון כלבת היא השומן, שנחשב לסטנדרט הזהב של האדם והשני, שניהם^5,6. אף על פי כן, השומן יכול לייצר תוצאות לא מהימנות על בדיקות רקמה במוח בירידה/אוטומטית. בנוסף, לא ניתן להשתמש בו כדי לאבחן דגימות נוזלים ביולוגיים כגון נוזל שדרתי (שדרתי), רוק ושתן, ובכך מנעה במידה רבה את התעסוקה שלו באבחון הנתיחה⁷. בדיקות האבחון הקונבנציונליות המקובלות, כגון בדיקת הזיהום בתרבות רקמת הכלבת (RTCIT) ובדיקת החיסון לעכבר (MIT), דורשות מספר ימים⁶, חיסרון גדול כאשר אבחון מהיר חיוני.

בדיקות אבחון מולקולריות שונות (לדוגמה, זיהוי רנ א ויראלי על-ידי RT-PCR, התפקוד החיסוני המקושר ל-pcr, בתוך היברידיזציה, ו-PCR בזמן אמת) משמשים כטכניקות מהירות ורגישות לאבחון כלבת⁸. RT-PCR מומלץ כיום על ידי OIE עבור אבחון כלבת שגרתית, ו המופילו (ח נ) PCR מתואר במדריך OIE של בדיקות אבחון וחיסונים עבור חיות יבשתי כדי לזהות את כל lyssaviruses⁵. כאן אנו מתארים הפאן-lyssavirus מקונן RT-PCR, אשר מאפשר זיהוי ספציפי ורגיש של כל 18 lyssavirus מינים להשוות או לחרוג שהושג על ידי השומן. העיקרון של השיטה הוא RT של RNA היעד (אזור שימור של גן lyssavirus N) לתוך cDNA, ואחריו הגברה של cDNA על ידי שני סיבובים של ה-PCR. CDNA עובר את ה-PCR העגול הראשון עם התחל החיצוני כדי להגביר רסיס bp 845; לאחר מכן, ה-PCR העגול השני משתמש במוצר ה-PCR העגול הראשון כתבנית כדי להגביר רסיס של 371 bp עם התחל הפנימי. שני סיבובים של ה-PCR מגבירים באופן משמעותי את רגישות הצורה.

Protocol

השימוש בעכברים בפרוטוקול זה אושר על ידי הוועדה המנהלית לרווחת בעלי חיים של המכון לרפואה וטרינרית צבאית, האקדמיה למדעי הרפואה הצבאית, סין (טיפול בבעלי חיים מעבדה ושימוש באישור הוועדה, היתר מספר JSY-DW-2010-02). כל ההנחיות המוסדיים והמנחים הלאומיים לטיפול ולשימוש בבעלי חיים מעבדתיים הופעלו.

1. הפקת רנ א

1. לחלץ RNA מרקמת המוח החשודה, העור ביופסיות, רוק, או שדרתי או מתרבות תא הנגועים RABV, באמצעות guanidinium isothiocyanate-פנול-כלורופורם מבוססי שיטות מיצוי או מסחרית ויראלי מסחרי הפקת ערכות. השתמש ב-RNA המוכן מיד או אחסן אותו ב-80 ° c עד הצורך.

2. שעתוק הפוכה של ה-RNA הנגיפי

1. הסר את הריאגנטים RT המפורטים בטבלה 1 מן המקפיא, לשמור אותם על הקרח, להפשיר ומערבולת אותם לפני השימוש.
2. הכינו 12 μL של שילוב התגובה RT בצינור 0.2 mL PCR עם ריאגנטים המפורטים בטבלה 1. אפשר וריאציות ליטוף על ידי הכנת נפח של מיקס מאסטר לפחות גודל תגובה אחד גדול מהנדרש.
3. הוסף 8 μL לדוגמה, RNA שליטה חיובית או שליטה שלילית בתמהיל התגובות RT בתוך תחנת עבודה PCR בחדר תבנית. השליטה החיובית RT הוא RNA שחולצו מן התרבות התאית נגוע במתח RABV קבוע קורות חיים -11 (האתגר וירוס רגיל -11) ומאוחסן ב-80 ° c. הפקד השלילי מכיל RNase-חינם ddH₂O.
4. מערבבים את התוכן של צינורות RT על ידי vortexing; לאחר מכן, צנטריפוגה בקצרה.
5. לטעון את הצינורות התגובה לתוך הציקלאה תרמית. הגדר את תוכנית הסינתזה של cDNA בתנאים הבאים: 42 ° c עבור 90 דקות, 95 ° c עבור 5 דקות, ו-4 ° c בהמתנה. הגדר את עוצמת התגובה ל -20 μL. הפעל את הפעלת RT.

3. ה-PCR העגול הראשון

1. שמרו על החומרים המולקולארית המפורטים בטבלה 2 על הקרח בחדר נקי עד השימוש; אז, להפשיר ולערבולת אותם.
2. הכינו את המיקס הראשון של ה-PCR בצינור 0.2 mL עם הריאגנטים הרשום בטבלה 2.
3. הוסף מדגם 2 μL של cDNA או פלבאמצע לתערובת ה-PCR העגולה הראשונה בתוך תחנת עבודה של PCR בחדר תבנית. הבקרה החיובית של ה-PCR מהווה את קורות החיים 11 cDNA שהוכנו כאמור בשלב 2.3 עבור שיטת RT לעיל. הבקרה השלילית של ה-PCR היא.
4. העבירו את הצינורות החתומים לציקלור תרמי של PCR ומחזור באמצעות הפרמטרים המפורטים בטבלה 3.

4. PCR הסיבוב השני

1. הכינו את שילוב ה-PCR השני בסיבוב בצינור 0.2 mL באמצעות הריאגנטים הרשום בטבלה 4.
2. הוסף 2 μL של מוצר ה-PCR הראשון בסיבוב לתוך המיקס השני של PCR. בנוסף, הכללת ddH₂O כפקד שלילי של ה-PCR העגול השני.
3. בצע את הרכיבה התרמית PCR באמצעות אותם פרמטרים כפי שניתן בשלב 3.4.

5. ניתוח מוצרי ה-PCR על ידי אלקטרופורזה על ג'ל לצמח

1. להכין 1.5% agarose ג'ל על ידי הוספת 1.5 g של agarose ל 100 mL של טריס-אצטט-EDTA (טה) והמסת אותו ביסודיות על ידי חימום אותו במיקרוגל.
2. הוסף אתידיום ברומיד (EB) (בריכוז סופי של 0.01%) או החלפת EB מסחרית אחרת. יוצקים את ג'ל לתוך העובש ולהשאיר אותו לגבש בטמפרטורת הסביבה לפחות 30 דקות.
3. הכן את דגימות הטעינה על ידי ערבוב 5 μL של כל מוצר PCR עם 1 μL של מאגר טעינת 6x.
4. טען את הדגימות ואת סמן ה-DNA המתאים בנפרד לתוך הבארות ולהפעיל את ג'ל עבור כ 30-45 דקות ב 120 V עד קו הצבע הוא כ 75%-80% למטה את הג.
5. כבה את החשמל, נתק את האלקטרודות ממקור החשמל ולאחר מכן, הוצא את הג בזהירות מהתיבה ג'ל.
6. השתמש ג'ל UV המתעד המכשיר כדי להמחיש ולצלם את קטעי ה-DNA.

6. אפיון מקונן-PCR

1. 6.1. ספציפיות ורגישות לגילוי של 18 ליסביסווירוסים
   1. הזמנת 18 מסחרי הפלסטיק המכיל את כל N הגן המלא של כל lyssavirus (16 מינים ICTV ושני מינים הרומן) עבור ה-PCR.
   2. חשב את מספר ההעתק של הפלסמיד באמצעות המספר של אבוגדרו (N_A) והנוסחה הבאה.
      [(g/μL באמצע DNA)/(אורך פלארמיד ב bp x 660)] x 6.022 x 10²³ = מספר מולקולות/μl
   3. הכנת פתרונות מניות (2.24 x 10⁹ מולקולות/μl) של כל 18 הפלמידים ב ddh₂O.
   4. בצע 9 10-מדלל סידוריים מקפלים של כל 18 הפלמידים ב ddH₂O. לדלל 10 μl של כל מלאי פלסטלינה עם 90 Μl של ddh₂O. מערבולת וצנטריפוגה לזמן קצר.
   5. בצע הגברה של ה-PCR כמתואר בסעיפים 3-5.
   6. לנתח את הספציפיות ואת הרגישות של ה-PCR המקונן על ידי זיהוי סדרה של הפלמידים lyssavirus ירוס.
2. קביעת הממד מילת הזווית ל איזה
   1. כוונן את סיכוייו של זן וירוס כלבת קורות חיים 11 התרבות תא כדי 10^5.5 tcid₅₀/ml (וירוס סיכוייו נקבע על פי המדריך oie)⁵.
   2. ביצוע 5 10-מדלל סידוריים מקפלים של קורות חיים -11 (פתרון המניה הוא 10^5.5 tcid₅₀/ml) כפי שמתואר בשלב 6.1.4.
   3. בצע את חילוץ ה-RNA ואת הליכי הגברה מקוננים RT-PCR של כל מדלל ויראלי כפי שמתואר בסעיפים 1-5.
3. Compar סון מ את ה RT-PCR מקונן עם "תקן זהב" שומן
   1. בדוק את כל הדגימות הקליניות על ידי מקונן RT-PCR, ולאחר מכן, לאשר את התוצאות עם השומן⁵ ו-N גן שרשור רצף⁹.
   2. השתמש בנתונים מנורמל עבור ניתוח סטטיסטי עם SAS 9.1. השתמש במבחן קאפה ובמבחן צ'י-בריבוע של מק להשוואה סטטיסטית של בדיקות האבחון (הפקודה SAS: הליך freq; שולחן/מסכים). חשב רווחי ביטחון בהנחה abinomial הפצה.
4. הערכת היעילות בבדיקת דגימות מירידה
   1. לחשוף שתי דגימות מוח קליני מאושרות של כלבים בכלבת בשעה 37 ° c.
   2. מטפל בשתי הדגימות בכל יום של חשיפה ב 37 ° c על ידי מקונן RT-PCR, FAT, ו-MIT⁵.

Results

תוצאות של RT-PCR מקונן כדי לזהות 18 lyssavirus מינים מוצגים באיור 1. כל הפקדים החיוביים של ה-PCR הראו את התוצאה הצפויה 845 bp ב-1-ו-371 bp בהגברה השנייה של הסיבוב, ללא להקה בשליטה השלילית. כל 18 lyssaviruses הפיק 845 ו/או 371 להקות bp, המציין כי RT-PCR מקונן זיהה את כל 18 lyssaviruses. הגברה יעילה של שישה כדורים בשני סיבובים של ה-PCR, אבל שניים, כלומר ARAV ו-IKOV, הגברה באחד או בשני של ה-PCR. הרגישות של השיטה מגוונת בזיהוי של הפלמידים lyssavirus שונים, עם מגבלות החל 2.24 x 10⁰ כדי...

Discussion

כיום, RABV הוא וירוס מרכזי האחראי על כמעט כל כלבת האדם והחיה בסין, כמו גם במדינות אחרות. בנוסף, משתנה IRKV זוהה לראשונה מ- Murina leucogaster במחוז ג'ילין בצפון מזרח סין ב 2012¹⁰, והיא דווחה כדי לגרום למותו של כלב במחוז ליאונינג ב 2017¹¹. לאחרונה, הרומן lyssavirus, TWBLV, זוהה גם מתוך עטלף פיפיסטרלי יפני בטייוואן, סין בשנת 2017. תוצאות אלה מרמזות על גילוי יעיל של lyssaviruses אחרים חשוב גם כדי למנוע את הנפילה של העטלף המועברות lyssaviruses. בהקשר זה, פאן-l...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 ופעמים; TAE		שונים
6 ופעמים; מאגר טעינה	TakaRa	9156
Agarose	US Everbright® Inc	A-2015-100g
ddH2O	שונים
DL 2,000 סמן	Takara	3427A
dNTPs (10 מ"מ	TakaRa	4019
dNTPs (2.5 מ"מ	TakaRa	4030
מערכת אלקטרופורזה	Tanon	EPS300
Ex-Taq (5 מ"מ; L)	TakaRa	RR001
מערכת הדמיית ג'ל	UVITEC	קורא
			מיקרוצנטיפוגה
M-MLV הפוך טרנסקריפטאז (200 IU/µ L)	TakaRa	2641A
NanoDrop 1000 ספקטרופוטומטר	Thermoscientific	ND1000
Oligo (dT)15	TakaRa	3805
PCR מכונת	BIO-RAD	T100
PCR צינורות	שונים
בנאמנות גבוהה DNA Polymearase	NEW ENGLAND BioLabs	M0530S
Pipettors
Different Random Primer	TakaRa	3801
RNase Inhibitor (40 IU/µ L)	TakaRa	2313A
ddH ללא RNase2O	TakaRa	9102
Taq Buffer (10&)	TakaRa	9152A
טיפים	שונים
מערבולת מערבולת	שונים