כאן, אנו מציגים פרוטוקול Cas9 מבוסס exon23 מחיקה כדי לשחזר ביטוי הדיסטרופין ב-iPSC מ Dmdmdx העכבר הנגזר פיברוהפיצוצים ולהבדיל ישירות iPSCs לתוך תאים מיוגניים מיוגנים (mpc) באמצעות ט-על מערכת ההפעלה myod.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
CRISPR/Cas9 טכנולוגיה בשחזור הדיסטרופין ביטוי בשריר iPSC-נגזר ושלתי
במאמר זה
סיכום
תקציר
ניוון שרירים duchenne (DMD) היא מחלה מתקדמת חמורה שרירים נגרמת על ידי מוטציות הגן הדיסטרופין, אשר בסופו של דבר מוביל לתשישות של תאים שריר קדמון. באשכולות באופן קבוע הכולל מרווח מחדש palindromic חוזר/CRISPR-הקשורים 9 (CRISPR/Cas9) לעריכת גנים יש את הפוטנציאל לשחזר את הביטוי של הגן הדיסטרופין. אוטוולוגי המושרה תאי גזע רב-עוצמה (iPSCs)-בתאי שריר נגזר (MPC) יכול לחדש את בריכת גזע/מחולל קדמון, לתקן נזק, ולמנוע סיבוכים נוספים ב-DMD ללא גרימת תגובה חיסונית. במחקר זה, אנו מציגים שילוב של CRISPR/Cas9 ו-iPSC שאינם משולבים טכנולוגיות להשיג ושלתי שרירים עם ביטוי חלבון הדיסטרופין התאושש. בקצרה, אנו משתמשים בווקטור שאינו שילוב של סנדאי כדי ליצור קו iPSC מתוך פיברותקיעות העורי של עכברMdx dmd. לאחר מכן אנו משתמשים באסטרטגיית המחיקה CRISPR/Cas9 כדי לשחזר את הביטוי הדיסטרופין באמצעות הצטרפות לא הומוולוגי של גן הדיסטרופין ממוסגר מחדש. לאחר אימות PCR של exon23 דלדול בשלוש מושבות מ 94 לאסוף מושבות iPSC, אנו להבדיל iPSC לתוך MPC על ידי דוקסיציקלין (חמצון)-ביטוי המושרה של MyoD, גורם שעתוק מפתח לשחק תפקיד משמעותי בוויסות בידול שריר. התוצאות שלנו מציגות את הכדאיות של שימוש באסטרטגיית מחיקה CRISPR/Cas9 כדי לשחזר את הביטוי הדיסטרופין ב-iPSC-נגזר MPC, אשר יש פוטנציאל משמעותי לפיתוח טיפולים עתידיים לטיפול DMD.
מבוא
ניוון שרירים duchenne (DMD) הוא אחד הdystrophies השרירים הנפוצים ביותר והוא מאופיין על ידי העדר הדיסטרופין, המשפיעים על 1 של כ 5,000 בנים יילוד ברחבי העולם1. הפסד של הדיסטרופין הפונקציה גן תוצאות פגמים שרירים מבניים המוביל ניוון מתקדם מיואיים1,2. רקומביננטי adeno-הקשורים וירוס (rAAV)-תיווך מערכת הריפוי גנטי נבדק כדי לשחזר את ביטוי הדיסטרופין ולשפר את תפקוד השריר, כגון החלפת גנים באמצעות מיקרו-הdystrophins (μ-Dys). עם זאת, הגישה raav מחייב זריקות חוזרות כדי לקיים את הביטוי של חלבון פונקציונלי3,4. לכן, אנחנו צריכים אסטרטגיה שיכולה....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל טיפול בבעלי חיים והליכים כירורגיים בוצעו על ידי פרוטוקול שאושר על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים באוניברסיטת אוגוסטה (IACUC). לעכברים הואכלו דיאטה סטנדרטית. ומים ליסיביות
1. בידוד של העכבר הראשי פיברוהפיצוצים מתוך עכברים מבוגרים Dmdmdx
- המתת חסד של מבוגרים Dmdmdx עכברים (זכר, 2 חודשים) על ידי CO2 חנק וכריתת האונה על פי iacuc אושרה על ידי המכללה הרפואית של גאורגיה, אוניברסיטת אוגוסטה. חותכים את הזנב עם אזמל סטרילי במצב סטרילי תחת המכסה המנוע. לשטוף את הזנב עם 70% אתנול עבור 5 דקות, ולאחר מכן לשטוף עם מלוחים סטרילי מאגור פוספט (PBS) בצלחת 6 ס מ.
- קלף את העור הזנב על ידי חתך חד מהבסיס....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הקמת מערכת העור של Dmdmdx שמקורם ipsc. הדגמנו את היעילות של יצירת העכבר iPSCs מ Dmd מעכבריםmdx נגזר העור פיברופיצוץ באמצעות שילוב חינם וקטורים תכנות. איור 1A הפגינו כי המראה של תא גזע עובריים (ESC)-כמו מושבות בשלושה שבועות לאחר ההדבקה. אנו מעריכים את היעילות של האינדוקציה iPSC ידי לחיות פוספספטאז אלקליין (AP) הכתם; איור 1B מראה שאחוזי התאים של AP-חיוביים היו סביב 1.8% על-ידי ניתוח facs. SSEA1, Lin28, Nanog, OCT4 ו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
ניוון שרירים duchenne (dmd) היא מחלה תורשתית הרסנית בסופו של דבר מאופיין על ידי חוסר של הדיסטרופין, המוביל ניוון שרירים פרוגרסיבי1,2. התוצאות שלנו להפגין הדיסטרופין המשוחזר הביטוי הגן בתוך Dmdmdx ipsc-נגזר בתאי הקדמון על ידי הגישה של CRISPR/Cas9-תיווך exon23 מחיקה. לגישה זו יש שלושה יתרונות.
ראשון, שיצרנו iPSCs מ Dmdmdx העכבר נגזר פיברופיצוצים באמצעות וקטור RNA שאינו משולב. מגוון של שיטות פותחו כדי ליצור iPSCs, כג.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
. למחברים אין מה לגלות
תודות
טאנג וינטרוב תמכו בחלקם על ידי NIH-AR070029, NIH-HL086555, NIH-HL134354.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מכשירים כירורגיים | |||
| מחט 31 מד | שונים | ||
| חתך חד | אמנים שונים | ||
| אזמלים סטריליים | שונים | ||
| פינצטה | אמנים שונים | ||
| מדיום פיברובלסטים (עבור 100 מ"ל של מדיום שלם) | מספר קטלוגי | של החברה | נפח |
| 2-מרקפטואתנול (55 מ"ל | Gibco | 21-985-023 | 0.1 מ"ל |
| אנטיביוטיקה אנטי-פטריית 100x | CORNING | MT30004CI | 1 מ"ל |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - גלוקוז גבוה | SIGMA | D6429 | 87 מ"ל |
| עוברי סרום בקר מאופיין | HyClone | SH30396.03 | 10 מ"ל |
| תמיסת L-גלוטמין | SIGMA | G7513 | 1 מ"ל |
| MEM תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות (100x) | Gibco | 11140076 | של 1 מ"ל |
| (עבור 500 מ"ל של תמיסה מלאה) | מספר קטלוגי | של החברה | סרום |
| עוף | נפח Gibco | 16110-082 | 5 מ"ל |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | 186 מ"ג |
| תמיסת | עד 500 מ"ל | ||
| טריפסין (2.5%) | תרמו | 15090046 | 5 מ"ל |
| מדיום גידול mES (עבור 500 מ"ל של תמיסה מלאה) | מספר קטלוגי | של החברה | נפח |
| 2-מרקפטואתנול (55 מ"מ) | Gibco | 21-985-023 | 0.5 מ"ל |
| אנטיביוטיקה אנטי-מיקוטית 100x | CORNING | MT30004CI | 5 מ"ל |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - גלוקוז גבוה | SIGMA | D6429 | 408.5 מ"ל |
| סרום בקר עוברי | HyClone | SH30396.03 | 75 מ"ל |
| תמיסת L-גלוטמין | SIGMA | G7513 | 5 מ"ל |
| עכבר רקומביננטי לוקמיה גורם מעכב (LIF), 0.5 x 106 U/mL | EMD Millipore Corp | CS210511 | 500 μ |
| תוסף מעכב L MEK/GS3 EMD | Millipore Corp | CS210510-500UL | 500 μ L |
| MEM תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות (100x) | Gibco | 11140076 | 5 מ"ל |
| אין לאחסן את המדיה הסלולרית ES יותר מ-4 שבועות ועם מעכבים לא יותר משבועיים. | |||
| <חזק>mES בינוני קפוא (עבור 50 מ"ל של תמיסה מלאה) | <חזק>חברה | <חזק>מספר קטלוגי | ><חזק>נפח |
| דימתיל סולפוקסיד (DMSO) | SIGMA | D2650 | 5 מ"ל |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - גלוקוז גבוה | SIGMA | D6429 | 24.9 מ"ל |
| סרום בקר עוברי מאופיין | HyClone | SH30396.03 | 25 מ"ל |
| עכבר רקומביננטי לוקמיה גורם מעכב (LIF), 0.5 x 106 U/mL | EMD Millipore Corp | CS210511 | 50 μ L |
| שם החומר/ציוד | מספר קטלוגי | של החברה | RRID |
| 0.05% טריפסין/0.53 מ"מ EDTA | CORNING | 25-052-CI | |
| 4% Paraformaldehyde | Thermo scientific | J19943-k2 | |
| תמיסת Accutase | SIGMA | A6964 | תמיסת ניתוק תאים |
| AgeI-HF | NEB | R3552L | |
| Alexa488-מצומד עז-אנטי-עכבר | נוגדן Invitrogen | A32723 | AB_2633275 |
| Alexa488-מצומד עז-אנטי-ארנב נוגדן | Invitrogen | A32731 | |
| עז-אנטי-ארנב | Invitrogen | A32732 | |
| AB_2633281-Anti-AFP | Thermo scientific | RB-365-A1 | |
| AB_59574 אנטי-&אלפא;-חלק אקטין שריר (D4K9N) XP | CST | 19245S | AB_2734735 |
| אנטי דיסטרופין | תרמו | PA5-32388 | AB_2549858 |
| אנטי-LIN28A (D1A1A) XP | CST | 8641S | |
| AB_10997528 אנטי-MYH2 | DSHB | mAb2F7 | AB_1157865 |
| אנטי-Nanog-XP | CST | 8822S | AB_11217637 |
| אנטי-Oct-4A (D6C8T) | CST | 83932S | AB_2721046 |
| אנטי-Sox2 | abcam | ab97959 | AB_2341193 |
| נגד SSEA1(MC480) | CST | 4744s | |
| AB_1264258 אנטי-TH (H-196) | סנטה קרוז | sc-14007 | AB_671397 |
| אלקליין פוספטאז כתם חי (500x) | Thermo | A14353 | |
| Blasticidin S | Sigma-Aldrich | 203350 | |
| BsmBI/Esp3I | NEB | R0580L/R0734L | |
| קרבניצילין | Millipore | 205805-250MG | |
| קולגנאז IV | תאגיד וורת'ינגטון ביוכימיה | LS004189 | |
| תאים מוכשרים | TakaRa | 636763 | |
| CutSmart | NEB | B7204S | |
| CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Thermo | A16517 | |
| DirectPCR מגיב ליזה (תא) | VIAGEN BIOTECH | 302-C | |
| Dispase (1 U/mL) | STEMCELL Technologies | 7923 | |
| דוקסיציקלין הידרוכלוריד | פישר ביו-ריאגנטים | BP26535 | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101L | |
| פיברונקטין פלזמה בקר | SIGMA | F1141 | |
| ערכת מיצוי ג'ל QIAEX II (500) | QIAGEN | 20051 | |
| ג'לטין מעור חזיר, סוג A | SIGMA | G1890 | |
| מדיום הרכבה קשיח נגד דהייה עם וקטור DAPI | H-1500 | ||
| Hygromycin B (50 מ"ג/מ"ל) | Invitrogen | 10687010 | |
| הזרקת קטמין HCL | הנרי שיין בריאות בעלי חיים | 45822 | |
| KpnI-HF | NEB | R3142L | |
| lenti-CRISPRv2-blast | Addgene | 83480 | |
| lenti-Guide-Hygro-iRFP670 | Addgene | 99377 | |
| Lipofectamin 3000 Transfection Kit | Invitrogen | L3000015 | |
| LV-TRE-VP64-mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 | Addgene | 60625 | |
| LV-TRE-VP16 עכבר MyoD-T2A-dsRedExpress2 | Addgene | 60626 | |
| עכבר על עכבר (M.O.M.) ערכת בייסיק | וקטור | BMK-2202 | |
| NotI-HF | NEB | R3189L | |
| Opti-MEM I מדיה סרום מופחתת | ThermoFisher | 31985070 | |
| פוליאתילן גליקול 4,000 | אלפא Aesar | AAA161510B | |
| פוליברן | SIGMA | TR1003 | |
| Corning BioCoat פולי-D-ליזין/למינין תרבית שקופית | CORNING | CB354688 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | ThermoFisher | A25742 | |
| PrimeSTAR Max Premix | TakaRa | R045 | |
| Proteinase K | VIAGEN BIOTECH | 507-PKP | |
| Puromycin Dihydrochloride | MP Biomedicals | ICN19453980 | |
| qPCR Lentivirus ערכת טיטרציה | abm | LV900 | |
| ערכת קשירה מהירה | NEB | M2200S | |
| QIAprep ספין Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | |
| QIAGEN פלסמיד פלוס ערכת מידי (100) | QIAGEN | 12945 | |
| RevertAid RT ערכת תמלול הפוך | תרמו מדעי | K1691 | |
| RNAzol RT | , INC | RN 190 | |
| T4 DNA Ligase מאגר תגובה | NEB | B0202S | |
| T4 פולינוקלאוטיד קינאז | NEB | M0201S | |
| מרק נהדר שונה | פישר BioReagents | BP9729-600 | |
| ViralBoost Reagent (500x) | ALSTEM | VB100 |
מקורות
- Mendell, J. R., et al. Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Annals of Neurology. 71 (3), 304-313 (2012).
- Batchelor, C. L., Winder, S. J. Sparks, signals and shock absorbers: how dystrophin loss cause....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
