מאמר שיטה

CRISPR/Cas9 טכנולוגיה בשחזור הדיסטרופין ביטוי בשריר iPSC-נגזר ושלתי

7.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59432

⸱

14 בספטמבר 2019

 ,  ,  ,  , 
1Medical College of Georgia, Augusta University

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול Cas9 מבוסס exon23 מחיקה כדי לשחזר ביטוי הדיסטרופין ב-iPSC מ Dmdmdx העכבר הנגזר פיברוהפיצוצים ולהבדיל ישירות iPSCs לתוך תאים מיוגניים מיוגנים (mpc) באמצעות ט-על מערכת ההפעלה myod.

תקציר

ניוון שרירים duchenne (DMD) היא מחלה מתקדמת חמורה שרירים נגרמת על ידי מוטציות הגן הדיסטרופין, אשר בסופו של דבר מוביל לתשישות של תאים שריר קדמון. באשכולות באופן קבוע הכולל מרווח מחדש palindromic חוזר/CRISPR-הקשורים 9 (CRISPR/Cas9) לעריכת גנים יש את הפוטנציאל לשחזר את הביטוי של הגן הדיסטרופין. אוטוולוגי המושרה תאי גזע רב-עוצמה (iPSCs)-בתאי שריר נגזר (MPC) יכול לחדש את בריכת גזע/מחולל קדמון, לתקן נזק, ולמנוע סיבוכים נוספים ב-DMD ללא גרימת תגובה חיסונית. במחקר זה, אנו מציגים שילוב של CRISPR/Cas9 ו-iPSC שאינם משולבים טכנולוגיות להשיג ושלתי שרירים עם ביטוי חלבון הדיסטרופין התאושש. בקצרה, אנו משתמשים בווקטור שאינו שילוב של סנדאי כדי ליצור קו iPSC מתוך פיברותקיעות העורי של עכברMdx dmd. לאחר מכן אנו משתמשים באסטרטגיית המחיקה CRISPR/Cas9 כדי לשחזר את הביטוי הדיסטרופין באמצעות הצטרפות לא הומוולוגי של גן הדיסטרופין ממוסגר מחדש. לאחר אימות PCR של exon23 דלדול בשלוש מושבות מ 94 לאסוף מושבות iPSC, אנו להבדיל iPSC לתוך MPC על ידי דוקסיציקלין (חמצון)-ביטוי המושרה של MyoD, גורם שעתוק מפתח לשחק תפקיד משמעותי בוויסות בידול שריר. התוצאות שלנו מציגות את הכדאיות של שימוש באסטרטגיית מחיקה CRISPR/Cas9 כדי לשחזר את הביטוי הדיסטרופין ב-iPSC-נגזר MPC, אשר יש פוטנציאל משמעותי לפיתוח טיפולים עתידיים לטיפול DMD.

מבוא

ניוון שרירים duchenne (DMD) הוא אחד הdystrophies השרירים הנפוצים ביותר והוא מאופיין על ידי העדר הדיסטרופין, המשפיעים על 1 של כ 5,000 בנים יילוד ברחבי העולם1. הפסד של הדיסטרופין הפונקציה גן תוצאות פגמים שרירים מבניים המוביל ניוון מתקדם מיואיים1,2. רקומביננטי adeno-הקשורים וירוס (rAAV)-תיווך מערכת הריפוי גנטי נבדק כדי לשחזר את ביטוי הדיסטרופין ולשפר את תפקוד השריר, כגון החלפת גנים באמצעות מיקרו-הdystrophins (μ-Dys). עם זאת, הגישה raav מחייב זריקות חוזרות כדי לקיים את הביטוי של חלבון פונקציונלי3,4. לכן, אנחנו צריכים אסטרטגיה שיכולה לספק ביעילות ולשחזר לצמיתות הדיסטרופין ביטוי גנטי בחולים עם DMD. העכברהmdx dmd, מודל העכבר עבור dmd, יש מוטציה נקודה ב אקסון 23 של הגן הדיסטרופין המציג מוקדם הפסקת קודון ותוצאות חלבון מעוגל לא פונקציונלי חסר הדיסטרוc מסוף מחייב לתחום. מחקרים שנעשו לאחרונה הפגינו השימוש crispr/Cas9 טכנולוגיה כדי לשחזר ביטוי גנטי הדיסטרופין על ידי תיקון גנטי מדויק או מוטציה אקסון מחיקה של חיה קטנה וגדולה5,6,7. ארוך ואח '8 דיווחו על השיטה לתיקון מוטציה גן הדיסטרופין ב dmdmdx העכבר germline על ידי תיקון homology מכוון (HDR) מבוסס Crispr/Cas9 הגנום עריכה. אל-רפאי ואח '9 דיווח כי raav יכול ביעילות לבלו את מוטציה 23 בעכברים הדיסטרומנוונת. במחקרים אלה, gRNAs עוצבו ב introns 20 ו 23 כדי לגרום כפול נתקע DNA הפסקות, אשר שוחזר באופן חלקי את הביטוי הדיסטרופין לאחר תיקון DNA דרך הצטרפות לא הומוולוגי (NHEJ). אפילו יותר מרגש, אמאסיאני ואח '.10 דיווחו לאחרונה על יעילות והיתכנות של raav-תיווך CRISPR לערוך גנים בשחזור הביטוי הדיסטרופין במודלים כלבים, צעד חיוני ביישום קליני בעתיד.

DMD גם גורם להפרעות תא גזע11. עבור נזק שרירים, בתאי גזע שרירים מגורים לחדש תאי שריר לאחר בידול שריר. עם זאת, מחזורים רצופים של פציעה ותיקון להוביל קיצור של טלומרים בתאי גזע שריר12, ו דלדול מוקדמת של בריכות תאי גזע13,14. לכן, שילוב של טיפול אוטוולוגי בתאי גזע עם עריכת הגנום כדי לשחזר את הביטוי הדיסטרופין יכול להיות גישה מעשית לטיפול DMD. The CRISPR/Cas9 הטכנולוגיה מספקת את האפשרות של יצירת אוטוולוגי גנטית מתוקן בתאי גזע המושרה pluripotent iPSC) עבור התחדשות שרירים תפקודית ולמנוע סיבוכים נוספים של DMD ללא גרימת דחייה החיסונית. עם זאת, iPSCs יש סיכון של היווצרות הגידול, אשר יכול להיות להקלה על ידי הבידול של iPSC לתוך תאים מיוגני קדמון.

בפרוטוקול זה, אנו מתארים את השימוש ללא שילוב וירוס סנדאי כדי לתיכנות מראש באמצעות הפנים של עכבריםMdx dmd לתוך iPSCs ולאחר מכן לשחזר ביטוי הדיסטרופין על ידי CRISPR/Cas9 הגנום מחיקה. לאחר אימות של מחיקה Exon23 ב-iPSC על ידי הגנוטיפים, אנו הבדיל מתוקן הגנום iPSC לתוך ושלתי מיוגניים (MPC) באמצעות בידול מיוגני הנגרמת על ידי MyoD.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל טיפול בבעלי חיים והליכים כירורגיים בוצעו על ידי פרוטוקול שאושר על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים באוניברסיטת אוגוסטה (IACUC). לעכברים הואכלו דיאטה סטנדרטית. ומים ליסיביות

1. בידוד של העכבר הראשי פיברוהפיצוצים מתוך עכברים מבוגרים Dmdmdx

  1. המתת חסד של מבוגרים Dmdmdx עכברים (זכר, 2 חודשים) על ידי CO2 חנק וכריתת האונה על פי iacuc אושרה על ידי המכללה הרפואית של גאורגיה, אוניברסיטת אוגוסטה. חותכים את הזנב עם אזמל סטרילי במצב סטרילי תחת המכסה המנוע. לשטוף את הזנב עם 70% אתנול עבור 5 דקות, ולאחר מכן לשטוף עם מלוחים סטרילי מאגור פוספט (PBS) בצלחת 6 ס מ.
  2. קלף את העור הזנב על ידי חתך חד מהבסיס לקצה הזנב לאורך העור הזנב, ולאחר מכן לקלף בעדינות את העור הזנב עם מספריים. האוהב את העור בגודל של 1 מ"מ3 באמצעות אזמל סטרילי ולהעביר את רקמת העור טחון לצלחת 6 ס"מ בינוני חיוני מינימלי של דולבקה/Ham ' s F12 (dmem/F12) המכיל 0.1% קולגן הרביעי ו-1 U/mL של dispase.
  3. לעכל את רקמת העור בצלחת תרבות עבור 2 h ב 37 ° c בחממה 5% CO2 .
  4. מעיל צלחת 6-באר עם fibronectin ו 0.2% ג'לטין (1 מ ל של fibronectin ב 199 mL של 0.2% ג'לטין; רשימת חומרים) ו הדגירה ב 37 ° c עבור 1 h.
  5. הנתק את רקמת העור מתעכל עם הטיפ 1 mL pipet ולהעביר את הרקמה supernatant לצינור הצנמה סטרילי 15 מ"ל. צנטריפוגה ב 217 x g עבור 3 דקות בטמפרטורת החדר, למחוק את הסופרנטאנט ולהשעות את הגלולה ב 1.5 mL של בינונית פיברובלסט (טבלת חומרים).
  6. התרבות כדורי כולל רקמת עור מתעכל לא מושלם משלב 1.5 על צלחת 6-הבאר מצופה עם fibronectin ו 0.2% ג'לטין משלב 1.4 ב 37 ° c, 5% בחממה2 . החליפו את המדיום 24 שעות לאחר הציפוי הראשוני להסרת תאים שאינם מחוברים, ושנה את המדיום כל 48 h.

2. מתיכנות משני של עור העכבר לתוך iPSCs

  1. יומיים לפני התמרה, לעכל את העכבר העיכול פיברותקיעות משלב 1.6 עם פתרון ניתוק התא (טבלה של חומרים) בחממה 37 ° c עם האווירה מחולל לחות של 5% CO2 עבור 5 דקות.
  2. ספירת תאים באמצעות hemacytometer צנטריפוגה ב 217 x g עבור 3 דקות.
  3. תאי הזרע בצפיפות של 1 עד 2 x 105 תאים לכל טוב על צלחת 6-באר ותרבות עם בינונית פיברוהפיצוץ (לוח חומרים) בחממה 37 ° c עם האווירה לחות של 5% CO2.
  4. ביום התמרה (יום 0), הערכת התאים ולחשב את עוצמת הקול של כל וירוס הנדרש כדי להגיע לריבוי היעד של זיהום (המשרד העצמי) של 5, 5, ו 3 (כלומר, KOS מארה = 5, הhc-Myc ממוי = 5, hKlf4 מוי = 3) לפי המדריך המסחרי.

figure-protocol-1

  1. הפשרת שלושה צינורות סנדאי באמבטיית מים בגודל 37 ° c לחמישה-עשר, והוסיפו את הכרכים המחושבים של כל אחד משלושת צינורות סנדאי ל-1 מ ל של בינונית (שולחן חומרים).
  2. להסיר את המדיום פיברוהפיצוץ משלב 2.3 ולהוסיף את תערובת וירוס מתיכנות לבארות המכילות את התאים. מודיית את התאים לילה בחממה 37 ° c עם האווירה לחות של 5% CO2.
  3. החלף את המדיום עם בינוני בפיברוסט טרי 24 שעות לאחר התמרה. מתרבות את התאים לשבוע אחד. עם החלפת בינוניות בכל יום
  4. הקציר מושפע העכבר הנגוע ביום 7 לאחר התמרה עם 0.05% טריפסין/EDTA ומקום על מנות כי הם מצופים בעבר עם fibronectin ו 0.2% ג'לטין.
  5. התרבות הנגועה בעכבר הנגוע משלב 2.6 באמצעות העכבר המלא מתחלקים תא גזע (ES) הצמיחה בינונית (שולחן החומרים) בחממה 37 ° c עם אווירה מחולל לחות של 5% CO2 ולשנות בינונית מדי יום.
  6. מיום 8, שימו לב לצלחת תחת מיקרוסקופ הפוך בכל יום אחר כדי לזהות את המראה של גושי תאים עם המבנה של העכבר ES.

3. באמצעות פוספספטאז אלקליין לחיות כתם וזרימה cy, לנסות לכמת את יעילות התיכנות

  1. הסר את מדיית התרבות מכל באר ושטוף באמצעות הפקודה DMEM דיה/F-12 עבור 2 עד 3 דקות.
  2. החל 2 מ ל של 1x בסיסי פוספספטאז (AP) חיים כתמים הפתרון העבודה (1:500 דילול ב-DMEM/F-12) אל התאים החסיד, ו דגירה ב 37 ° c חממה עם אווירה מחולל לחות של 5% CO2 עבור 30 דקות.
  3. ולשטוף פעמיים עם ה-PBS. במשך 5 דקות כל אחד
  4. לעכל את התאים עם פתרון הניתוק התא (טבלה של חומרים) בחממה 37 ° c עם האווירה מחולל לחות של 5% CO2 עבור 5 דקות. לבצע את הזרימה cy, נסה לקבוע את יעילות התיכנות מראש.

4. בחירה ואיסוף תאים בעלי מערך ES

  1. בדוק את המושבות משלב 2.8. תחת מיקרוסקופ הפוך
  2. סמן את המושבות בתחתית הצלחת עם סמן אובייקט בדיו עצמית.
  3. החלת טבעות שיבוט משומן כדי לכסות את מושבות התא המסומנות. הוסף 100 μL של 0.05% טריפסין/EDTA לכל טבעת שיבוט ב 37 ° צ' עבור 5 דקות, ולאחר מכן להעביר את התאים מתעכל עם 100 הטיפים μL ל48 היטב לוחיות התרבות המכילות את מדיום הצמיחה של mES.
  4. מודיית את התאים ב 48-היטב לוחיות התרבות ב 37 ° c בחממה עם אווירה מחולל לחות של 5% CO2. מעבר את התאים 6 ס"מ צלחת כאשר הם מגיעים 70% המפגש.
  5. חזור על שלבים 4.3 ו 4.4 במשך כמה פעמים עד מעונות אחיד בצורת שיבוטים מתקבלים.

5. הקפאת iPSCs לקריוגנית

  1. הנתק את iPSCs הנבחר משלב 4.5 עם טריפסין, versene, ו פלזמה אפרוח (TVP; רשימת חומרים) פתרון ב 37 ° c בחממה 5% CO2 עבור 30 דקות.
  2. לאסוף את התאים בצינור והצנטריפוגה של 15 מ ל מעוקר בשעה 217 x g עבור 3 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. משף את הסופרנטאנט ומשהה מחדש את הגלולה ב 2 מ ל של העכבר ES קפוא בינונית (טבלת חומרים) כדי להשיג 1 mL לכל קריובקבוקון.
  4. הוסף תאים לקריוצלוחיות והקפא באמצעות מיכל המקפיא המספק את קצב הצינון הקריטי, החוזר על 1 ° c ומינימום הנדרש לקריופיפריזציה ב-80 ° c למשך הלילה.
  5. העבר מבחנות קפואות. למיכל חנקן נוזלי

6. כתמים אימונולואורונסנציה עבור סמנים תא גזע ב iPSCs

  1. Seed iPSCs משלב 5.1 התרבותי עם mES medium לתוך שקופית קאמרית של 8 שנים מצופה עם פולי-D-ליזין/מלמינציה (לוח חומרים) בצפיפות המתאימה כדי להשיג בין 1 לבין 2 x 104 תאים לכל טוב ו דגירה בחממה 37 ° c עם מ לחות האווירה של 5% CO2 עבור 48 h.
  2. לטבול את השקופיות 4% פורמלדהיד עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לטבול את השקופיות ב-PBS פעמיים עבור 5 דקות בכל פעם.
  3. מקטעים באמצעות העכבר מגיב באמצעותהמוצר (טבלת חומרים), ו 5% סרום עז 1 h בטמפרטורת החדר.
  4. לדלל את הנוגדנים העיקריים מדלל חלבון (העכבר-anti-SSEA1, 1:100, ארנב-anti-ננוg, 1:500; ארנב-anti-POU מחלקה 5 [SOX2], 1:500; ארנב-anti-SRY-box 2 [], 1:500; ארנב נגד לין-28 הומויומן [Lin28A], 1:400) (לוח חומרים). החלת נוגדנים על התאים ו הדגירה ב 4 ° c לילה בחדר מחולל.
  5. להיפטר פתרון הנוגדן העיקרי ולשטוף את השקופיות 3x ב-PBS.
  6. החלת נוגדנים השני (Alexa488-מצושל עז נגד העכבר נוגדן ו Alexa555-מצועם עז-אנטי ארנבת, 1:400 כל אחד) ב M.O.M. חלבון דילול על שקופיות ו-דגירה עבור 45 דקות בטמפרטורת החדר.
  7. שטוף את השקופיות 3 x ב-PBS ו-mount מקטעים עם בינוני הרכבה המכיל 4 ' 6-diamidino-2-פנילילינדול (DAPI).
  8. צלם תמונות עם. מיקרוסקופ קונקונוס

7. חקירת הפלאואון של iPSCs בvivo

  1. הנתק את iPSCs משלב 5.1 לתוך תאים בודדים באמצעות TVP פתרון בחממה 37 ° c עם אווירה מחולל לחות של 5% CO2 עבור 30 דקות.
  2. ספירת תאים באמצעות hemacytometer צנטריפוגה ב 217 x g עבור 3 דקות.
  3. מזליד את supernatant ולהשעות את הגלולה עם מדיום mES בצינור הצנטריפוגה 1.5 mL סטרילי בריכוז של 5 x 105 תאים/30 μl עבור השתלת תא.
  4. הסרת שיער הן הגפיים האחוריות של עכברים חיסוני באמצעות קוצץ שיער.
  5. עכברים מורדם עם קטמין (100 mg/ק"ג) ולנקות את אתר ההזרקה עם 75% אלכוהול.
  6. הכנס 30 μL של iPSC השעיה משלב 7.3 בתוך הבית ה, באמצעות מחט של 31 גר'.
  7. שבועיים לאחר ההזרקה, הקציר הלחץ העכבר ולהטביע בטמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) מתחם, להקפיא הקפאה לחתוך לסעיפים 5-μm15,16.
  8. לתקן מקטעים ב 4% פורמלדהיד עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לשטוף את השקופיות פעמיים ב-PBS עבור 5 דקות בכל פעם.
  9. לחסום את התאים עם 5% סרום עז מדלל חלבון עבור 1 h בטמפרטורת החדר.
  10. הוסף נוגדן ראשוני מדולל (ארנב נגד AFP, 1:50; ארנב נגד SMA, 1:50; ארנב נגד TH, 1:50) לשקופיות ו-מודלת ב 4 ° c לילה בחדר מחולל.
  11. להיפטר פתרון הנוגדן העיקרי, לשטוף את התאים 3x (5 דקות/לשטוף) ב-PBS, להוסיף 1:400 מדולל עז אנטי ארנבת נוגדן לשקופיות, ו דגירה עבור 45 דקות בטמפרטורת החדר.
  12. לשטוף שקופיות 3 x (5 דקות/לשטוף) ב-PBS, ואת מקטעי הר עם בינונית הרכבה המכילה DAPI.

8. בנייה של crispr/Cas9 וקטור מיקוד וקטורי מטרה החוצה הדיסטרופין לאקסון 23

  1. עיצוב שני זוגות של grna oligos מיקוד intron-מוקף הדיסטרופין לאקסון 23 באמצעות http://crispor.tefor.net/crispor.py.
    הערה: הצמדים המתוכננים הם כדלקמן:
    i22sense: 5 '-מדריך למנהל התעשייה-3 '
    i22anti-היגיון: 5 '-מיזוגאוויר C-3 '
    i23sense: 5 '-CACCGAGTAATGTGTCATACCTTCT-3 '
    i23anti-sense: 5 '-AAACAGAAGGTATGACACATTACTC-3 ').
  2. לעכל ולתת לאחר 5 μg של הנגיף הפלסטי (לנטי-CRISPRv2-הפיצוץ [מתנה ממוהאן באבו) ו לנטי-מדריך-Hygro-iRFP670 [מתנה מקריסטן Brennand]) (טבלת חומרים) עם BsmB1/Esp3I עבור 30 דקות ב 37 ° c. עבור 5 μg של פלמידים, להוסיף 3 μL של BsmB1 הגבלת אנזים, 3 μL של מהיר בסיסי פוספספטאז, 6 μL של מאגר תקציר האנזים 10x ו-0.6 μL של 100 mM DTT ב 60 μL התגובה).
  3. לטעון את התגובות על 0.8% agarose ג'ל. הפעל את הג ב-100 עד 150 וולט במשך 30 דקות.
  4. טיהור בתוך ג'ל מתעכל באמצעות ערכת החילוץ ג'ל (טבלת חומרים) ו-elute ב 20 μl של H2O.
  5. זרחניות, והוא מכיל כל זוג של מחלת הגראוונודה המכילה 1 μL של כל מחלת הסידן ב 100 μM, 1 μL של מאגר הדו T4 בגודל 10x, 0.5 μL של T4 פולינוטייז קינאז (PNK), 6.5 μL של ddH2O ב-37 ° צ' למשך 30 דקות, ולאחר מכן 95 ° c עבור 5 דקות ולאחר מכן השיפוע במרחק של 25 ° c ב-5 ° צ'/מינימום.
  6. ליגייט 1:200 דילול של gRNA olig, הגאות לתוך plentiCRISPR V2 הפיצוץ או בשפע מדריך-Hygro-iRFP670. מערבבים 50 ng של BsmB1/Esp3I וקטורים מתעכל עם 1 μl של דופלקס oligo מדולל ו-5 μl של מאגר 2x ליגאז פלוס 1 μl של ליגאז ב 11 מערכת תגובה μl ו-דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  7. לבצע שינוי עם 3 μL של המוצר לקשר לתוך 50 μL תאים מוכשרים (טבלת חומרים) על פי הוראות היצרן.
  8. הפיצו את התאים המוסמכים השתנה בצלחת אגר עם 100 μg/mL carbenicillin ו-דגירה ב 31.5 ° צ' עבור 18 h.
  9. לבחור מושבות עם 10 μL הצנרת סטרילי טיפים ותרבות ב 5 מ ל של ציר מצוין (הטבלה של חומרים) המכיל 100 μg/mL carbenicillin ב 31.5 ° צ', 185 rpm בחממה שייקר עבור 21 h.
  10. לטהר את ה-DNA הפלמיד באמצעות מיני להתכונן ו-midi-להכין ערכות (טבלת חומרים).
  11. אמת את מיני ההכנה המצומצמת על-ידי עיכול הגבלה. עבור 20 התגובות, של מערכת התגובה add 1 μg של ה-DNA באמצע, 2 μL של מאגר התגובה לעכל (הטבלה של חומרים) ו 1 μl של תערובת אנזים הגבלה (0.5 Μl של KPNI-hf ו 0.5 Μl של AGEI-Hf עבור plentiCRISPR V2-הפיצוץ-i22; 0.5 Μl של NOTI-hf ו 0.5 Μl של ecori-hf שפע-מדריך-Hygro-iRFP670-i23). מודיית את מערכת התגובה. בשעה 37 מעלות צלזיוס
  12. לטעון את התגובות על 0.8% agarose ג'ל. הפעל את הג ב-100 עד 150 וולט במשך 30 דקות.
    הערה: הלהקות הנכונות עבור plentiCRISPR V2-הפיצוץ-i22 צריך להיות 622 bp ו 12.2 kb, ואת להקות הנכון שפע-Hygro-iRFP670-i23 צריך להיות 2.6 kb ו 7.1 kb.

9. מארז וקטורי לנטינגיט

  1. תרבות 7 x 105 293ft תאים ב 5 מ ל של מדיה dmem המכיל 10% סרום העובר העוברי בצלחת 6 ס"מ לילה ב 37 ° c, 5% CO2.
  2. להכין קוקטייל (1 μg of plentiCRISPR V2-הפיצוץ-i22 או שפע מדריך-Hygro-iRFP670-i23, 750 ng של האריזה psPAX2 זיווד, 250 ng של pMD2. G מעטפה פלאמיד, ו-5 μL של הזיהום מגיב [טבלת חומרים] ב 100 μl של הסרום מופחת מדיה.
  3. הכינו תערובת של 5 μL של העברה מגיב B (הטבלה של חומרים) ב 100 μl של מדיה מופחתת זיכרון מופחת.
  4. הוסף 100 μL של התערובת מגיב B לתערובת פלאבין בשלב 9.2 ו דגירה עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. הוסף את הקומפלקס DNA-ליפיד (משלב 9.4) dropwise לתאים 293FT. דגירה לילה ב 37 ° צ' עם 5% CO2.
  6. הוספת משפר ייצור וירוסים (500x) (טבלה של חומרים) על כל מנה ביום למחרת ו דגירה עבור 24 h ב 37 ° c, 5% CO2.
  7. לאסוף בינוני מתאים באמצעות פיפטות ביומיים הבאים ולסנן את המדיום באמצעות מסנן 0.45 יקרומטר כדי להסיר את התאים.

10. ריכוז וטיהור של וקטורים מאונגיליים

  1. מזרז וקטור ויראלי במדיום של שלב 9.7 לילה ב 4 ° צ' עם פוליאתילן 5x גליקול 4000 (PEG4000, 8.5% הריכוז הסופי) ו 4 M הנאל 0.4 (הריכוז הסופי M).
  2. צנטריפוגה את התקשורת הנגיפית המכילה את הפתרון PEG4000 ב 2,095 x g ו 4 ° צ' עבור 30 דקות, להסיר ולמחוק את supernatant.
  3. השהה מחדש את כדורי עם 500 μL של סרום מופחת מדיה מופחתת (הנגיף: lenti-CRISPR V2-gRNAi22:1.56 x 108, Lenti-IRFP670-gRNAi23:1.3 x 108, LENTI-crispr v2-שליטה: 3.13 x10,lenti-iRFP670-control: 5.9 x 107 ). חנות at-80 ° צ' עד השימוש.

11. מחיקת אקסון 23 בעכבר iPSCs עם שני rnas מדריך (grnas) ביחד עם Cas9

  1. צלחת העכבר iPSCs משלב 4.5 בצלחת 24-באר מצופה עם fibronectin ו ג'לטין.
  2. לאחר התאים להגיע 50% המפגש, לעבור אל התרבות הטרייה בינונית (העכבר המלא מתחלקים הצמיחה תא גזע בינוני) המכיל 8 μg/mL polybrene).
  3. להוסיף 100 μL של פתרון חלקיק ויראלי משלב 10.3 כולל lenti-CRISPR V2-gRNAi22, lenti-iRFP670-gRNAi23 ושליטה (וקטור ריק: lenti-CRISPR V2, lenti-iRFP670) לעכבר iPSCs. התאים הדגירה 3 ימים ב 37 ° צ' עם 5% CO2.
  4. בחר תאים נגועים באופן בלתי נשכח עם מדיה המכילה 2.5 μg/mL בלאסיפידין ו 100 μg/mL hygromycin B על-ידי קביעת הריכוז המינימלי של בלטות ו hygromycin B נדרש כדי להרוג את התא בלתי נגוע.
    הערה: התאים הנגועים במחלה יוהרגו על ידי בלטות וhygromycin בי.
  5. לעכל את העכבר שנבחר iPSCs עם 0.5 mL של הפתרון TVP כל טוב (24-באר צלחת) ו דגירה תאים עבור 30 דקות ב 37 ° צ' עם 5% CO2.
  6. הנתק את iPSCs לתוך תאים בודדים על ידי ליטוף, לספור תאים עם תא ספירת תאים ולאחר מכן לדלל על 150 תאים בודדים מתעכל עם mES בינונית לתוך 10 ס מ צלחת עבור תרבות ב 37 ° צ' עם 5% CO2.
  7. לאחר כעשרה ימים, לבחור מושבות יחיד תחת מיקרוסקופ הפוך באמצעות 10 μL הצנרת סטרילי טיפים (96 המושבות צריך להיבחר).
  8. להעביר את המושבות שנאסף לתוך 50 μL של הפתרון TVP כל טוב (96-צלחת לוחית, מושבה אחת כל טוב), לעכל ב 37 ° צ' עבור 30 דקות, ולאחר מכן זרע את התאים מתעכל לתוך 2 96-ובכן לוחיות התרבות כדי לשמור על התרבות (אחד עבור הגנוזה).
  9. מודטה בחממה של CO2 ב-37 ° c עד 70% בחיבור.

12. זיהוי מושבות iPSC עם מחיקת exon23

  1. הסר את המדיום בצלחת 96-באר כאשר מושבות התא להגיע 70% המפגש.
  2. הוסף 25 μL של מגיב לפירוק (טבלה של חומרים) המכיל את הפתרון הפרוטאינאז k (1 מ ל של הפרוטאינאז k ב 100 mL של מגיב לפירוק) כל טוב, ולהעביר את ליפוסט לצלחת 96-היטב PCR.
  3. חותם את צלחת ה-PCR ו מודקת את הצלחות ב 55 ° c עבור 30 דקות, ולאחר מכן ב 95 ° c עבור 45 דקות כדי lyse את התאים ואת הספרות הפרוטאינאז K.
  4. בצע תגובת PCR עם 2 μL של ליפוסט משלב 12.3. עבור תגובה 20 μl PCR, להוסיף 2 μl של ליפוסט, 10 μl של 2x DNA פולימראז פריאז (טבלת חומרים), 7 μl of dnase-מים חינם, ו 1 μl של dmd אקסון 23 התחל (שולחן 1).
  5. השתמש בפרמטרים הבאים עבור תגובת ה-PCR: 98 ° c עבור 1 דקות, 35 מחזורים של 98 ° צ' עבור 10 s, 60 ° c עבור 15, 72 ° c עבור 30, והארכה סופית ב-72 ° c עבור 1 דקות.
  6. העמיסו את תגובת ה-PCR. על ג'ל של 2% הפעל את הג ב-100 עד 150 וולט במשך 30 דקות.
  7. בדוק את ג'ל תחת אור UV (יעילות הנוקאאוט הוא 3/94).

13. שימוש במערכת ההפעלה של מערכת MyoD כדי להבדיל במישרין את iPSC לתאי קדמון מיוגניים (MPC)

  1. חבילת LV-TRE-VP64-עכבר MyoD-T2A-dsRedExpress2 ו-LV-TRE-VP16 עכבר MyoD-T2A-dsRedExpress2 (מתנה מצ גרסבאך) (טבלת חומרים) כפי שתוארה בעבר עבור Lenti-CRISPRv2-הפיצוץ ו Lenti-Grna-iRFP670 וקטורים בסעיפים . תשע ועשר
  2. להדביק את העכבר iPSC עם הנגיף-TRE-VP64-MyoD-T2A-dsRed-Express2 או לווירוס-TRE-VP16-MyoD-T2A-dsRedExpress2 כפי שמתואר בעבר ל-lenti-CRISPRv2-הפיצוץ ו lenti-gRNA-iRFP670 וקטורים בשלבים 11.1-ל-18.2.
  3. בחירת תאים עם 1 μg/mL puromycin לאחר שלושה ימים של זיהום כדי לקבל התמרה טהורה של התאים הסלולריים.
  4. הוסף 3 מיקרומטר μg/mL לתוך התקשורת התרבותית (10% FBS Dמאמ) כדי MPC בידול. החלפת בינוני טרי שיושלם עם דוקסיציקלין מדי יומיים.

14. היפוך כמותי שעתוק PCR להערכת בידול שריר דינמי dmd אקסון 22-24 ביטוי

  1. לחלץ RNA הסלולר לאחר 0, 3, 6, ו 10 ימים לאחר הטיפול דוקסיציקלין באמצעות הבידוד RNA מגיב, התהודה להפוך RNA לתוך cDNA באמצעות ערכתהסינתזה הראשוןסטרנד cdna (טבלת חומרים).
  2. עבור מערכת התגובה 20 μl qpcr, להוסיף 1 μl של cdna, 10 μl של מאגר התגובה PCR (טבלת חומרים), 8 μl של DNA H2O, ו 1 μl של תערובת של קדימה והפוך התחל (גליצראלדהיד-3-פוספט דהידרוגנאז [החוצה], שריר השלד [ACTA1 OCT4 ו-dmd exon22, DMD exon23 ו-DMD exon24, ראה טבלה 1).
  3. השתמש בפרמטרים הבאים עבור תגובת ה-PCR: 50 ° c עבור 2 דקות, 95 ° c עבור 2 דקות, 40 מחזורים של 95 ° c עבור 15, 60 ° c במשך 1 דקות, להמיס עקומת בתוך מעלות צלזיוס עד 65.0 ° c, להגדיל 95.0 ° c.

15. immunofluorescence כתמים של שרשרת כבדה רירן 2 (MYH2) וביטוי חלבון הדיסטרופין

  1. לוחית דוקסיציקלין הנגרמת, לנטי-TRE-MyoD תאים שונה משלב 13.4 אל 8-היטב שקופיות התרבות.
  2. תקן תאים ב 4% פורמלדהיד עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן שטוף את השקופיות פעמיים ב-PBS עבור 5 דקות בכל פעם.
  3. לחסום את התאים עם 5% סרום עז מדלל חלבון עבור 1 h בטמפרטורת החדר.
  4. הוסף הארנב נגד הדיסטרופין נוגדן (1:300) ו-MYH2 נוגדן העכבר (1:100) לשקופיות, מודטה ב 4 ° c לילה בחדר מחולל.
  5. להיפטר פתרון הנוגדן העיקרי, לשטוף את התאים 3x (5 דקות/לשטוף) ב-PBS, להוסיף 1:400 מדולל Alexa488-מצושל עז אנטי ארנבת נוגדן ו Alexa555-מצועם אנטי העכבר נוגדן לשקופיות, ו דגירה עבור 45 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. שטוף את השקופיות 3 x (5 דקות/לשטוף) ב-PBS, ואת מקטעי הר עם בינונית הרכבה המכילה DAPI.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הקמת מערכת העור של Dmdmdx שמקורם ipsc. הדגמנו את היעילות של יצירת העכבר iPSCs מ Dmd מעכבריםmdx נגזר העור פיברופיצוץ באמצעות שילוב חינם וקטורים תכנות. איור 1A הפגינו כי המראה של תא גזע עובריים (ESC)-כמו מושבות בשלושה שבועות לאחר ההדבקה. אנו מעריכים את היעילות של האינדוקציה iPSC ידי לחיות פוספספטאז אלקליין (AP) הכתם; איור 1B מראה שאחוזי התאים של AP-חיוביים היו סביב 1.8% על-ידי ניתוח facs. SSEA1, Lin28, Nanog, OCT4 ו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ניוון שרירים duchenne (dmd) היא מחלה תורשתית הרסנית בסופו של דבר מאופיין על ידי חוסר של הדיסטרופין, המוביל ניוון שרירים פרוגרסיבי1,2. התוצאות שלנו להפגין הדיסטרופין המשוחזר הביטוי הגן בתוך Dmdmdx ipsc-נגזר בתאי הקדמון על ידי הגישה של CRISPR/Cas9-תיווך exon23 מחיקה. לגישה זו יש שלושה יתרונות.

ראשון, שיצרנו iPSCs מ Dmdmdx העכבר נגזר פיברופיצוצים באמצעות וקטור RNA שאינו משולב. מגוון של שיטות פותחו כדי ליצור iPSCs, כג...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

טאנג וינטרוב תמכו בחלקם על ידי NIH-AR070029, NIH-HL086555, NIH-HL134354.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מכשירים כירורגיים
מחט 31 מדשונים 
חתך חדאמנים שונים 
אזמלים סטרילייםשונים 
פינצטהאמנים שונים 
מדיום פיברובלסטים (עבור 100 מ"ל של מדיום שלם)מספר קטלוגישל החברהנפח
2-מרקפטואתנול (55 מ"לGibco21-985-0230.1 מ"ל
אנטיביוטיקה אנטי-פטריית 100xCORNINGMT30004CI1 מ"ל
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - גלוקוז גבוהSIGMAD642987 מ"ל
עוברי סרום בקר מאופייןHyCloneSH30396.0310 מ"ל
תמיסת L-גלוטמיןSIGMAG75131 מ"ל
MEM תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות (100x) Gibco11140076של 1 מ"ל
(עבור 500 מ"ל של תמיסה מלאה)מספר קטלוגישל החברהסרום
עוףנפח Gibco16110-0825 מ"ל
EDTASigma-AldrichE6758186 מ"ג
תמיסתעד 500 מ"ל
טריפסין (2.5%)תרמו150900465 מ"ל
מדיום גידול mES (עבור 500 מ"ל של תמיסה מלאה)מספר קטלוגישל החברהנפח
2-מרקפטואתנול (55 מ"מ)Gibco21-985-0230.5 מ"ל
אנטיביוטיקה אנטי-מיקוטית 100xCORNINGMT30004CI5 מ"ל
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - גלוקוז גבוהSIGMAD6429408.5 מ"ל
סרום בקר עוברי HyCloneSH30396.0375 מ"ל
תמיסת L-גלוטמיןSIGMAG75135 מ"ל
עכבר רקומביננטי לוקמיה גורם מעכב (LIF), 0.5 x 106 U/mLEMD Millipore CorpCS210511500 μ
תוסף מעכב L MEK/GS3 EMDMillipore CorpCS210510-500UL500 μ L
MEM תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות (100x) Gibco111400765 מ"ל
אין לאחסן את המדיה הסלולרית ES יותר מ-4 שבועות ועם מעכבים לא יותר משבועיים.
<חזק>mES בינוני קפוא (עבור 50 מ"ל של תמיסה מלאה)<חזק>חברה<חזק>מספר קטלוגי><חזק>נפח
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)SIGMAD26505 מ"ל
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - גלוקוז גבוהSIGMAD642924.9 מ"ל
סרום בקר עוברי מאופייןHyCloneSH30396.0325 מ"ל
עכבר רקומביננטי לוקמיה גורם מעכב (LIF), 0.5 x 106 U/mLEMD Millipore CorpCS21051150 μ L
שם החומר/ציודמספר קטלוגישל החברהRRID
0.05% טריפסין/0.53 מ"מ EDTACORNING25-052-CI
4% ParaformaldehydeThermo scientificJ19943-k2
תמיסת AccutaseSIGMAA6964תמיסת ניתוק תאים
AgeI-HFNEBR3552L
Alexa488-מצומד עז-אנטי-עכברנוגדן InvitrogenA32723AB_2633275
Alexa488-מצומד עז-אנטי-ארנב נוגדןInvitrogenA32731
עז-אנטי-ארנבInvitrogenA32732
AB_2633281-Anti-AFPThermo scientificRB-365-A1
AB_59574 אנטי-&אלפא;-חלק אקטין שריר (D4K9N) XPCST19245SAB_2734735
אנטי דיסטרופיןתרמוPA5-32388AB_2549858
אנטי-LIN28A (D1A1A) XP     CST8641S
AB_10997528 אנטי-MYH2DSHBmAb2F7AB_1157865
אנטי-Nanog-XPCST8822SAB_11217637
אנטי-Oct-4A (D6C8T)CST83932SAB_2721046
אנטי-Sox2abcamab97959AB_2341193
נגד SSEA1(MC480) CST4744s
AB_1264258 אנטי-TH (H-196)סנטה קרוז sc-14007AB_671397
אלקליין פוספטאז כתם חי (500x)ThermoA14353
Blasticidin SSigma-Aldrich203350
BsmBI/Esp3INEBR0580L/R0734L
קרבניציליןMillipore205805-250MG
קולגנאז IV תאגיד וורת'ינגטון ביוכימיהLS004189
תאים מוכשריםTakaRa636763
CutSmart NEBB7204S
CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming KitThermoA16517
DirectPCR מגיב ליזה (תא)VIAGEN BIOTECH302-C
Dispase (1 U/mL)STEMCELL Technologies7923
דוקסיציקלין הידרוכלורידפישר ביו-ריאגנטיםBP26535
EcoRI-HFNEBR3101L
פיברונקטין פלזמה בקרSIGMAF1141
  ערכת מיצוי ג'ל
QIAEX II (500)		QIAGEN20051
ג'לטין מעור חזיר, סוג ASIGMAG1890
מדיום הרכבה קשיח נגד דהייה עם וקטור DAPIH-1500
Hygromycin B (50 מ"ג/מ"ל)Invitrogen10687010
הזרקת קטמין HCLהנרי שיין בריאות בעלי חיים45822
KpnI-HFNEBR3142L
lenti-CRISPRv2-blastAddgene83480
lenti-Guide-Hygro-iRFP670Addgene99377
Lipofectamin 3000 Transfection KitInvitrogenL3000015
LV-TRE-VP64-mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2   Addgene60625
LV-TRE-VP16 עכבר MyoD-T2A-dsRedExpress2Addgene60626
עכבר על עכבר (M.O.M.) ערכת בייסיקוקטורBMK-2202
NotI-HFNEBR3189L
Opti-MEM I מדיה סרום מופחתתThermoFisher31985070
פוליאתילן גליקול 4,000אלפא AesarAAA161510B
פוליברןSIGMATR1003
Corning  BioCoat פולי-D-ליזין/למינין תרבית שקופיתCORNINGCB354688
PowerUp SYBR Green Master MixThermoFisherA25742
PrimeSTAR Max PremixTakaRaR045
Proteinase KVIAGEN BIOTECH507-PKP
Puromycin DihydrochlorideMP BiomedicalsICN19453980
qPCR Lentivirus ערכת טיטרציהabmLV900
ערכת קשירה מהירהNEBM2200S
QIAprep ספין Miniprep Kit (250)QIAGEN27106
QIAGEN פלסמיד פלוס ערכת מידי (100)QIAGEN12945
RevertAid RT ערכת תמלול הפוךתרמו מדעיK1691
RNAzol RT, INCRN 190
T4 DNA Ligase מאגר תגובהNEBB0202S
T4 פולינוקלאוטיד קינאזNEBM0201S
מרק נהדר שונהפישר BioReagentsBP9729-600
ViralBoost Reagent (500x)ALSTEMVB100
) תמיסת TVP מלח חוצצת פוספט AB_2633280-Alexa555-מצומדמרכז מחקר מולקולרי

מקורות

  1. Mendell, J. R., et al. Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Annals of Neurology. 71 (3), 304-313 (2012).
  2. Batchelor, C. L., Winder, S. J. Sparks, signals and shock absorbers: how dystrophin loss causes muscular dystrophy. Trends Cell Biology. 16 (4), 198-205 (2006).
  3. Gregorevic, P., et al. Systemic delivery of genes to striated muscles using adeno-associated viral vectors. Nature Medicine. 10 (8), 828-834 (2004).
  4. Bengtsson, N. E., Seto, J. T., Hall, J. K., Chamberlain, J. S., Odom, G. L. Progress and prospects of gene therapy clinical trials for the muscular dystrophies. Human Molecular Genetics. 25 (R1), R9-R17 (2016).
  5. Tabebordbar, M., et al. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science. 351 (6271), 407-411 (2016).
  6. Long, C., et al. Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy. Science. 351 (6271), 400-403 (2016).
  7. Nelson, C. E., et al. In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 351 (6271), 403-407 (2016).
  8. Long, C., et al. Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated editing of germline DNA. Science. 345 (6201), 1184-1188 (2014).
  9. El Refaey, M., et al. In Vivo Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Cardiac Function in Dystrophic Mice. Circulation Research. 121 (8), 923-929 (2017).
  10. Amoasii, L., et al. Gene editing restores dystrophin expression in a canine model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 362 (6410), 86-91 (2018).
  11. Eisen, B., et al. Electrophysiological abnormalities in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes generated from Duchenne muscular dystrophy patients. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (3), 2125-2135 (2019).
  12. Marion, R. M., et al. Telomeres acquire embryonic stem cell characteristics in induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 4 (2), 141-154 (2009).
  13. Dumont, N. A., et al. Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division. Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).
  14. Sacco, A., et al. Short telomeres and stem cell exhaustion model Duchenne muscular dystrophy in mdx/mTR mice. Cell. 143 (7), 1059-1071 (2010).
  15. Su, X., et al. Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice. Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).
  16. Su, X., et al. Exosome-Derived Dystrophin from Allograft Myogenic Progenitors Improves Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice. Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 412-419 (2018).
  17. Ousterout, D. G., et al. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy. Nature Communications. 6, 6244(2015).
  18. Barde, I., et al. Efficient control of gene expression in the hematopoietic system using a single Tet-on inducible lentiviral vector. Molecular Therapy. 13 (2), 382-390 (2006).
  19. Glass, K. A., et al. Tissue-engineered cartilage with inducible and tunable immunomodulatory properties. Biomaterials. 35 (22), 5921-5931 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

CRISPR Cas923MyoDSendaiPCR

מאמרים קשורים