הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

תבנית-המופעל חמצוני ושתיל עיכוב הצמיחה שתילה Assays באריידרופסיס thaliana

13.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59437

⸱

21 במאי 2019

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Queen's University

במאמר זה

סיכום

נייר זה מתאר שתי שיטות לכמת את התגובות ההגנה באריידאופזיס thaliana בעקבות החשיפה elicitors החיסונית: פרץ חמצוני חולף, ואת עיכוב צמיחת שתיל.

תקציר

צמחים התפתחו מערכת חיסונית חזקה לתפוס פתוגנים ולהגן מפני מחלה. נייר זה מתאר שתי מטרות שניתן להשתמש בהן כדי למדוד את כוחה של הפעלה חיסונית באריידאופזיס thaliana בעקבות הטיפול עם מולקולות מעורר. מוצג הראשון הוא שיטה ללכידת התפרצות חמצוני במהירות ודינמית, אשר ניתן לפקח באמצעות שיטת הלומירול מבוסס. השני הוא שיטה המתארת כיצד למדוד החיסונית המושרה עיכוב של צמיחת שתיל. פרוטוקולים אלה הם מהירים ואמינים, אינם דורשים הכשרה או ציוד מיוחדים, והם משמשים רבות כדי להבין את הבסיס הגנטי של חסינות הצמח.

מבוא

כדי לתפוס ולהגן מפני פתוגנים, הצמחים התפתחו ממברנה מאוגד הזיהוי דפוסים קולטנים (PRRs) המאתרות מולקולות מיקרוביאלית שימור מחוץ לתא המכונה תבניות מולקולריות הקשורות חיידק (MAMPs)1. הכריכה של mamps כדי קנצוני שלהם prrs יוזם חלבון קינאז-בתיווך איתות החיסונית וכתוצאה מכך עמידות מחלת ספקטרום רחב2. אחת התשובות המוקדם ביותר בעקבות הפעלת PRR הוא זרחון והפעלה של ממברנה בלתי נפרד פלזמה פרץ הומואוקסידאז log (RBOH) חלבונים אשר מזרז את הייצור של מינים חמצן תגובתי לחילוץ (ROS)3 , 4. ROS לשחק תפקיד חשוב בהקמת התנגדות למחלות, משחק הן כמו שליחים משניים להפיץ איתות החיסונית, כמו גם סוכנים מיקרוביאלית ישיר5. התצפית הראשונה של פרץ חמצוני מחוסן מפני החיסון המתואר באמצעות פקעות תפוחי אדמה של קורות חיים. רישירי אחרי Phytophthora ... הפקה ROS כבר הוערך מינים צמחים מספר שימוש בדיסקי העלה7, הבולם התרבויות התאים8, ו protoplasts6. המתואר כאן היא שיטה פשוטה עבור הפקת דפוס-הפקה של רוס מופעל דיסקים של העלים של arabidopsis thaliana (arabidopsis).

כתגובה לתפיסה mamp, מופעל חלבונים rboh לזרז את הייצור של רדיקלים סופראוקסיד (O2-), רדיקלים הידרוקסיל (• או), ו סינגתן חמצן (1o2) המומרים חמצן מימן (H2o 2) בחלל החילוץ9. H2O2 ניתן לכמת על-ידי הלומירול מבוססי כימובסנס בנוכחות של הסוכן האוקסיגון חזרת peroxidase (hrp)10. HRP מחמצן2o2 יצירת יון הידרוקסיד (הו-או) וגז חמצן (O2) אשר מגיבים עם הלומירול כדי לייצר ביניים לא יציבה המשחרר פוטון של אור10. פליטת פוטון ניתן לכמת כיחידות אור יחסית (rlus) באמצעות קורא מיקרופלייט או צמידה מסוגל לזהות לומינסנציה, אשר הפכו להיות חלקים סטנדרטיים של ציוד במעבדות המולקולרית ביותר. על ידי מדידת האור המיוצר על פני מרווח 40-60 דקות, פרץ חמצוני חולף ניתן לזהות כבר מוקדם ככל 2-5 דקות לאחר הטיפול הפקה, לשיא ב 10-20 דקות, וחזרה לרמות בסיס אחרי ~ 60 דקות11. האור המצטבר שהופק במהלך הזמן הזה יכול לשמש כמדד של כוח החיסון המתאים להפעלת חלבונים RBOH12. באופן נוח, שיטת הפעולה אינה דורשת ציוד מיוחד או הכנה לדוגמה מסורבלת.

לשיא זמן קצר לאחר זיהוי MAMP, פרץ חמצוני נחשב תגובה חיסונית מוקדמת, יחד עם הפעלה MAMP וייצור אתילן5. מאוחר יותר תגובות החיסון כוללות תכנות משנה, הסגר שיניים, ולהוריד את התצהיר2,5. חשיפה ממושכת למחברי הפרלמנט מפעילה באופן שוטף את האיתות החיסוני אנרגטית-יקר הנובע מעיכוב צמיחת הצמח, הרומז על סחר בין פיתוח לחסינות13. תבנית-המופעל שתיל הצמיחה עיכוב (sgi) משמש רבות כדי להעריך את הפלט החיסונית ב arabidopsis והיה אינטגרלי לזיהוי של מספר רכיבים מרכזיים של איתות החיסון כולל prrs14,15 ,בן 16 לכן, הנייר הזה בנוסף מציג את התשובה עבור מדגם מופעל SGI ב Arabidopsis, לפיו שתילים גדלים בצלחות רב-היטב המכילים מדיה רגילה או מדיה בתוספת מעורר החיסון עבור 8-12 ימים ולאחר מכן שקלת תוך שימוש בקנה מידה אנליטי.

כדי להדגים כיצד ROS ו sgi בחני ניתן להשתמש כדי לפקח על prr בתיווך איתות, שלושה גנוטיפים המייצגים פלטי החיסונית משתנים נבחרו: (1) סוג פראי arabidopsis ההצטרפות קולומביה (Col-0), (2) הדומיננטי-שלילי bak1-5 מוטציה שבה רב תפקודי prr שיתוף קולטן brassinosteroid 1-הקשורים קינאז 1 (BAK1) הוא שאינו פונקציונלי איתות החיסונית17,18, ו (3) המוטציה cpk28-1 , אשר חסרה את ה קינאז חלבון משועבד לחלבונים בחלבון (CPK28) ומציג תגובות מוגברת למערכת החיסונית19,20. ROS ו sgi בחני מוצגים בתגובה מלאכותית המיוצר elf18 פפטיד אפירופה של התארכות בקטריאלי פקטור Tu (EF-tu), מזוהה arabidopsis על ידי הקולטן prr EF-tu (efr)15. פרוטוקולים אלה ניתן להשתמש עם elicitors החיסונית אחרים כגון כותל חלבון בקטריאלי לתנועתיות14 או אנדוגני הצמח מקבל חלבונים (atpeps)16, עם זאת, יש לציין כי תגובתיות הצמח שונה בהתאם ל . מעורר21 יחד, ROS ו sgi בחני יכול לשמש הערכה מהירה וכמותית של תגובות prr מוקדם ומאוחר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. זיהוי פרץ של רוס בדיסקי העלה Arabidopsis בעקבות ההעצמה החיסונית

  1. גידול ואחזקה של צמחים.
    1. כדי לסנכרן את הנביטה , הזרעים האראבאכופזיס באמצעות השעיית כ 50 זרעים ב 1 מ ל סטרילי 0.1% אגר [w/v] ולאחסן ב 4 ° צ' (ללא אור) עבור 3-4 ימים.
      הערה: Stratify שליטה ברקע סוג פראי (לדוגמה, Col-0) ו-גנוטיפים עם פלטי המערכת החיסונית גבוהה ונמוכה (לדוגמה, cpk28-1 ו -bak1-5, בהתאמה) כדי לשמש כפקדים פנימיים.
    2. לזרוע זרעים על הקרקע ולנבוט בתנאים הסטנדרטיים של יום קצר (22 ° c, 10 h אור, 150 mE/m2/s האור בעוצמה, ו 65-70% לחות יחסית).
    3. לאחר כ 7 ימים, השתמש מלקחיים להשתלות שתילים בודדים לסירים חדשים, מופרדים על ידי לפחות 4 ס מ כדי לאפשר פיתוח שושנת מלא. השתלת 6-12 שתילים לכל גנוטיפ וחזרה לתנאים הסטנדרטיים של היום הקצר. המים באופן קבוע צמחים להפרות (1 g/L של 20-20-20 דשן כל 2 שבועות).
  2. לאסוף דיסקי עלים ב 96-היטב צלחות עבור התאוששות לילה.
    1. ב 4-5 שבועות לאחר נביטה (איור 1A), להשתמש חדה 4 מ"מ ביופסיה באגרוף להסרת דיסק עלה אחד לכל צמח, הימנעות באמצע וריד ולהיות זהיר כדי להגביל את הפצע (איור 1a). מניחים דיסקים עלים בצלחת 96-ולומילומטר הכולל 100 μL של ddH2O עם הצד השני פונה כלפי מעלה כדי למנוע התייבשות22 (איור 1c). אם הערכת elicitors מרובים, להסיר את התקליטור 1 עלה מאותו עלה עבור כל טיפול באמצעות.
      הערה: עלים לדוגמה המורחבים לחלוטין, שלישי עד חמישי מראש הוורשה, ובערך בגודל ובגיל זהה להגבלת השונות. במידת האפשר, גזור דיסקי עלים במחצית באמצעות להב גילוח לפני התאוששות לילה, כמו זה מגדיל את פני השטח חשוף לקבלת פתרון23.
    2. לשחזר את הלילה בטמפרטורת החדר כדי למנוע את ההפרעה של ROS המיוצר על ידי פצועים במהלך אוסף דיסק עלה. לכסות את הצלחות עם מכסה כדי למנוע אידוי.
  3. בצע את הטיפול הפקת ולמדוד הייצור של ROS.
    1. התוכנית הקורא לוחית לפני הוספת פתרון התגובה, כמו זה יהיה להקטין את הזמן בין התפרצות הפריצה של רוס ואת המידות הראשונות שנרשמו. השתמש בתוכנה מסחרית המתאימה לקורא הצלחות. במקרה שלנו ( עיין בתוכן העניינים), לחץ על הגדרות ובחר את מחסנית LUM96 ואת סוג הקריאה הקינטית. לחץ על הקטגוריה ' קרא אזור ' וגרור כדי לבחור קבוצת משנה של בארות או את כל הלוח שייקרא. תחת הכרטיסייה PMT ו-אופטיקה , הגדר את זמן השילוב ל-1,000 Ms. תחת הכרטיסיה תזמון , הגדר את הזמן הקצוב הכולל ל-40-60 דקות ואת המרווח ל-2 דקות.
    2. מסירים מים מכל הבאר בעזרת פיפטה רב-ערוצית.
      הערה: אין לנקב דיסקים עלה, כי זה עלול לגרום ללחץ פצועים ולגרום ליותר משתנה ROS התפוקות.
    3. להכין פתרון התגובה המכילה 100 μM לומייול, 10 μg/mL HRP, ואת הריכוז הרצוי של מעורר (למשל: elf18 ב 1 ננומטר, 10 ננומטר, 100 nM, או 1,000 nM) ב-מעוקר ddH2O באמצעות 10 מ"ל של פתרון עבור 1 96-באר צלחת.
      הערה: התמוססות הפפטידים בצינורות בכריכה נמוכה2O בצינוריות מחייב לעשות מלאי של 10 מ"מ, הקפאת הבזק בנוזל N2, ואחסן ב-80 ° c. כאשר מוכן לשימוש, לדלל את המניות בבית השני סטרילי2O כדי ליצור 100 μm עבודה מלאי וחנות ב-20 ° c.
    4. השתמש בצינורות מרובי ערוצים כדי לוותר על 100 μL של תערובת התגובה לכל טוב, הוספת הפתרון לכל הדיסקים עלים של אותו טיפול באותו זמן22. כלול תגובת שליטה (לא מעורר) עבור כל גנוטיפ כדי להעריך את רמות ה-ROS הבזליים בהעדר מעורר. מיד למדוד את פליטת האור עבור כל אורכי גל בספקטרום גלוי באמצעות קורא מיקרופלייט.
      הערה: הכינו והחילו את פתרון התגובה תחת אור נמוך, כמו הלומירול ו-HRP הם ריאגנטים רגיש לאור. המשיכו לעקוב אחרי הקרח או ב-20 ° c, אלא אם כן בשימוש.
    5. מדידת פליטת האור עם 1,000 ms זמן האינטגרציה ב 2 דקות מרווחי מעל התקופה 40-60 דקות בקורא מיקרופלייט כדי ללכוד את פרץ חמצוני דינאמי (איור 1D).
      הערה: השתמש בזמן שילוב ארוך יותר כדי לשפר את רגישות התיקון11, תוך הקפדה על כל הדגימות בצלחת 96-באר ניתן למדוד בתוך מרווח אחד.
  4. . פרשנות נתונים
    1. עבור כל גנוטיפ, השתמש ביישום גיליון אלקטרוני כדי לחשב את ספירת הפוטון הממוצעת ואת השגיאה הסטנדרטית בכל נקודת זמן, ולהציג את הייצור של ROS כפונקציה של זמן באמצעות מזימת פיזור.
      figure-protocol-1
      כאשר t = בכל פעם שאתה מצביע
    2. לחילופין, לסכם את ספירות פוטון עבור כל דיסק עלה ולהציג את הממוצע של ערכים אלה עבור כל גנוטיפ באמצעות גרף בר עם קווי שגיאה סטנדרטיים או תיבת והחלקה העלילה.
      figure-protocol-2

2. שתיל שיטת עיכוב הצמיחה

  1. מעקר זרעים ומחזיר על לוחות מורראשיג ו Skoog (MS).
    1. הכן סטרילי חצי כוח (0.5 x) MS בינונית (2.16 g/L) המכיל 0.8% אגר [w/v]. שופכים מדיה ללוחות (90 x 15 מ"מ) במכסה זרימה למינארי.
    2. לחטא כ 100 זרעים בצינור מיקרוצנטריפוגה על ידי כביסה עם 1 מ ל של 70% אתנול עבור 2 דקות ולהסיר על ידי השאיפה. הוסף 1 מ ל של 40% אקונומיקה ו רוק בעדינות עבור 17 דקות בטמפרטורת החדר. להסיר אקונומיקה על ידי שאיפה ולשטוף שלוש פעמים 1 מ ל של מים סטריליים עבור 5 דקות. השהה מחדש 1 מ ל של סטרילי 0.1% אגר.
      הערה: לחלופין, השתמש בפרוטוקול העיקור בזרעי הגז כלור24.
    3. מחזירה כ-100 זרעים לכל גנוטיפ על לוחות MS אגר באמצעות פיפטה וחותם עם סרט מיקרונקבובית במכסה של זרם למינארי.
      הערה: הימנע הצבת זרעים בקרבת זה יהיה להפוך שתילים השתילים קשה מאוחר יותר.
    4. הזרעים stratify על ידי הצבת צלחות ב 4 ° צ' (אין אור) עבור 3-4 ימים כדי לסנכרן נביטה (איור 2A).
  2. השתלת שתילים לתוך 48-לוחיות הרישוי המכילות את הנוגדנים החיסונית.
    1. לאחר ריבוד, להעביר לוחות לאור בתנאי יום קצר (22 ° צ', 10 h אור, 150 mE/m2/s בעוצמת האור, ו 65-70% לחות יחסית) עבור 3-4 ימים כדי לאפשר נביטה.
    2. במכסה של זרם למינארי, הכינו מדים פפטיד (0 ננומטר, 1 ננומטר, 10 ננומטר, 100 nM, 1,000 nM) במדיה סטרילית של 0.5 x MS המכיל 1% סוכרוז [w/v], באמצעות 25 מ ל של MS עבור כל הצלחת 48-באר. להכין צלחות על ידי pipetting 500 μL של MS בינונית נוזלית או MS בינונית המכילה פפטידים לכל טוב. אם הוא זמין, השתמש בצינורות חוזרים להכנת הצלחות כדי לזרז את התהליך.
      הערה: עבור כל גנוטיפ, לגדל שתילים ב-MS ללא הגיוני לחשבון עבור כל הבדלים הטבועות בצמיחה נבט.
    3. שימוש מלקחיים סטרילי השתלת בזהירות אחד שתיל לכל טוב של אותו גודל וגיל, להבטיח כי אין נזק שתיל או שבירה לשורש וכי השורש הוא השקוע במדיה. עבור כל גנוטיפ, השתלה מינימום של 6-8 שתילים לתוך כל דילול פפטיד (איור 2B).
      הערה: שתילי להשתלות 4 ימים לאחר נביטה, כמו שורשים קצרים קל יותר לתמרן, ושתילים ישנים עשויים להניב תוצאות מיטביות פחות.
    4. איטום צלחות עם סרט מיקרונקבוביות ולחזור לאור בתנאים סטנדרטיים של יום קצר (22 ° c, 10 h אור, 150 mE/m2/s בעוצמת האור, ו 65-70% לחות יחסית). אפשר לשתילים לצמוח במשך 8-12 ימים.
  3. קביעת אחוז עיכוב בגדילה.
    1. בזהירות להסיר שתילים מ 48-צלחות טוב ויבש על ידי מגבת נייר. שוקלים שתילים בקנה מידה אנליטי ומתעדים ערכים. אם הוא זמין, השתמש בקנה מידה אנליטי המצויד בפלט USB כדי להקליט ערכי משקל טריים בגיליון אלקטרוני. לפני שתלי שקילה, לצלם תמונה כדי להציג חזותית עיכוב גדילה (איור 2C).
    2. קביעת אחוז הגידול בעיכוב של שתילים מטופלים שטופלו לעומת שתילים גדל MS בלבד (איור 2D) כדלקמן:
      figure-protocol-3
    3. התווה נתונים באמצעות גרף עמודות עם קווי שגיאה סטנדרטיים או שימוש בתיבה והחלקת מזימה כדי להציג בצורה טובה יותר את השונות הבין-ניסויית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מוטציה cpk28-119,25 ו bak1-517,18 צמחים שימשו כדי להפגין תוצאות צפויות עבור גנוטיפים עם תגובות החיסון גבוה ונמוך, בהתאמה, בפרץ חמצוני ו sgi בחני יחסית לבקרת רקע פראי (Col-0). כדי להעריך אפקטים תלויי-מינון, השתמשו בסדרת דילול פפטיד בעלת 10 מקפלים (1-1000 ננומטר) של elf18. כצפוי, cpk28-1 שורות הפונקציה היה מצטבר גבוה יותר (איור...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

נייר זה מתאר שתי שיטות לגבי התגובה החיסונית המופעל דפוס ב Arabidopsis, המציע גישות כמותיים להערכת התפוקה החיסונית ללא שימוש בציוד מיוחד. בשילוב, מופעלת תבנית ROS ו SGI ניתן להשתמש כדי להעריך את התגובות מוקדם ומאוחר לתפיסת חיידק, בהתאמה.

המגבלה העיקרית של שיטת פרץ חמצוני היא שינויים. מסיבות שאינן מובנות לחלוטין, RLUs מוחלטים לעתים קרובות שונים על ידי סדר גודל בין ניסויים. מכיוון שבין ההבדלים בניסוי הוא גבוה, מומלץ לכלול פקדי התייחסות פנימיים עם high (למשל, cpk28-1) נמוך (למשל<...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תודות

העבודה במעבדה שלנו ממומנת באמצעות המועצה הטבעית של משאבי מחקר והנדסה של קנדה (NSERC) תוכנית דיסקברי, הקרן הקנדית לחדשנות ג'ון R. אוונס קרן מנהיג, ואוניברסיטת המלכה. KS והוא נתמך על ידי מלגות דו-מושביים אונטריו ובוגר NSERC קנדה מלגות לסטודנטים של מאסטר (CGS-M).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
20-20-20 דשןPlant Prod10529מערבבים 1 גרם/ליטר במים ומורחים על הצמחים כל שבועיים לצמיחה אופטימלית.
4 מ"מ Biopsy PunchMedical Mart232-33-34-Pניתן להשתמש גם בסט בור שעם עם שטח פנים של 0.125 ס"מ^2.
צלחות סטריליות 48 בארות עם מכסהSigma-AldrichCLS3548
סולם אנליטי עם טיוטה SheidVWRVWR-225ACכל סולם אנליטי סטנדרטי יכול לשמש לבדיקות התחלת צמיחה, עם זאת, פלט מחשב ישיר הוא אופטימלי.
BioHit mLine Mechanical 12 פיפטה רב-ערוצית (30-300 uL)Sartorius725240ניתן להשתמש בכל פיפטה רב-ערוצית, כמו גם בצינור בודד במידת הצורך.
elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)EZ Biolabcp7211מאחסן פפטיד מלאי של 10 מ"מ ב-80C בצינורות קשירת חלבון נמוכים. לאחר ההפשרה, אחסן מלאי עבודה של 100 uM בטמפרטורה של -20C.
מלקחייםפישר סיינטיפיק22-327379
חזרת פרוקסידאזסיגמא-אולדריץ'P6782מתמוססים במים טהורים. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס והרחק מאור.
לומינולסיגמא-אולדריץ'A8511מתמוסס ב-DMSO. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס והרחק מאור.
Murisage and Skoog Basal SaltsCedarlane LabsMSP09-100LTחנות ב-4C.
SoilSunGrow HorticultureSunshine Mix #1ניתן להשתמש גם בסוגי קרקע אחרים לגידול Arabidopsis. מערבבים עם מים בעת מילוי סירים.
SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader עם מודול LUMהתקנים מולקולרייםחייבים לבקש הצעת מחירכל קורא צלחות המסוגל לזהות זוהר יכול לשמש לבדיקות אלה.
סוכרוזסיגמא-אולדריץ'S0389-1KGיש לאחסן בטמפרטורת החדר.
צלחות פוליסטירן לבן 96 בארותפישר סיינטיפיק07-200-589

מקורות

  1. Couto, D. E., Zipfel, C. Regulation of pattern recognition receptor signalling in plants. Nature Reviews Immunology. 16, 537-552 (2016).
  2. Boller, T., Felix, G. A Renaissance of Elicitors: Perception of Microbe-Associated Molecular Patterns and Danger Signals by Pattern-Recognition Receptors. Annual Review of Plant Biology. 60, 379-406 (2009).
  3. Marino, D., Dunand, C., Puppo, A., Pauly, N. A burst of plant NADPH oxidases. Trends in Plant Science. 56 (8), 1472-1480 (2012).
  4. Kadota, Y., Shirasu, K., Zipfel, C. Regulation of the NADPH Oxidase RBOHD during Plant Immunity. Plant and Cell Physiology. 56 (8), 1472-1480 (2015).
  5. Yu, X., Feng, B., He, P., Shan, L. From chaos to harmony: responses and signaling upon microbial pattern recognition. Annual Review of Phytopathology. 55, 109-137 (2017).
  6. Doke, N. Involvement of superoxide anion generation in the hypersensitive response of potato tuber tissues to infection with an incompatible race of Phytophthora infestans and to the hyphal wall components. Physiological Plant Pathology. 23 (3), 345-357 (1983).
  7. Bindschedler, L. V., et al. Peroxidase-dependent apoplastic oxidative burst in Arabidopsis required for pathogen resistance. The Plant Journal. 47 (6), 851-863 (2006).
  8. Keppler, L. D. Active Oxygen Production During a Bacteria-Induced Hypersensitive Reaction in Tobacco Suspension Cells. Phytopathology. 110 (3), 759-763 (1989).
  9. Wrzaczek, M., Brosché, M., Kangasjärvi, J. ROS signaling loops - production, perception, regulation. Current Opinion in Plant Biology. 16 (5), 575-582 (2013).
  10. Warm, E., Laties, G. G. Quantification of hydrogen peroxide in plant extracts by the chemiluminescence reaction with luminol. Phytochemistry. 21 (4), 827-831 (1982).
  11. Trujillo, M. Analysis of the lmmunity-Related Oxidative Bursts by a Luminol-Based Assay. Methods in Molecular Biology. 1398, 323-329 (2016).
  12. Nühse, T. S., Bottrill, A. R., Jones, A. M. E., Peck, S. C. Quantitative phosphoproteomic analysis of plasma membrane proteins reveals regulatory mechanisms of plant innate immune responses. The Plant Journal. 51 (5), 931-940 (2007).
  13. Belkhadir, Y., Yang, L., Hetzel, J., Dangl, J. L., Chory, J. The growth-defense pivot: Crisis management in plants mediated by LRR-RK surface receptors. Trends in Biochemical Sciences. 39 (10), 447-456 (2014).
  14. Gómez-Gómez, L., Felix, G., Boller, T. A single locus determines sensitivity to bacterial flagellin in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 18 (3), 277-284 (1999).
  15. Zipfel, C., et al. Perception of the Bacterial PAMP EF-Tu by the Receptor EFR Restricts Agrobacterium-Mediated Transformation. Cell. 125 (4), 749-760 (2006).
  16. Krol, E., et al. Perception of the Arabidopsis danger signal peptide 1 involves the pattern recognition receptor AtPEPR1 and its close homologue AtPEPR2. Journal of Biological Chemistry. 285 (18), 13471-13479 (2010).
  17. Schwessinger, B., et al. Phosphorylation-dependent differential regulation of plant growth, cell death, and innate immunity by the regulatory receptor-like kinase BAK1. PLoS Genetics. 7 (4), e1002046(2011).
  18. Roux, M., et al. The Arabidopsis Leucine-Rich Repeat Receptor-Like Kinases BAK1/SERK3 and BKK1/SERK4 Are Required for Innate Immunity to Hemibiotrophic and Biotrophic Pathogens. The Plant Cell. 23 (6), 2440-2455 (2011).
  19. Monaghan, J., et al. The calcium-dependent protein kinase CPK28 buffers plant immunity and regulates BIK1 turnover. Cell Host and Microbe. 16 (5), 605-615 (2014).
  20. Wang, J., et al. A Regulatory Module Controlling Homeostasis of a Plant Immune Kinase. Molecular Cell. 69 (3), 493-504 (2018).
  21. Mott, G. A., et al. Genomic screens identify a new phytobacterial microbe-associated molecular pattern and the cognate Arabidopsis receptor-like kinase that mediates its immune elicitation. Genome Biology. 17, 98(2016).
  22. Sang, Y., Macho, A. P. Analysis of PAMP-Triggered ROS Burst in Plant Immunity. Methods in Molecular Biology. 1578, 143-153 (2017).
  23. Smith, J. M., Heese, A. Rapid bioassay to measure early reactive oxygen species production in Arabidopsis leave tissue in response to living Pseudomonas syringae. Plant Methods. 10 (1), 6(2014).
  24. Lindsey, B. E., Rivero, L., Calhoun, C. S., Grotewold, E., Brkljacic, J. Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds. Journal of Visualized Experiments. 128, (2017).
  25. Matschi, S., Werner, S., Schulze, W. X., Legen, J., Hilger, H. H., Romeis, T. Function of calcium-dependent protein kinase CPK28 of Arabidopsis thaliana in plant stem elongation and vascular development. The Plant Journal. 73 (6), 883-896 (2013).
  26. Felix, G., Duran, J. D., Volko, S., Boller, T. Plants have a sensitive perception system for the most conserved domain of bacterial flagellin. The Plant Journal. 18 (3), 265-276 (2002).
  27. Kunze, G., Zipfel, C., Robatzek, S., Niehaus, K., Boller, T., Felix, G. The N Terminus of Bacterial Elongation Factor Tu Elicits Innate Immunity in Arabidopsis Plants. The Plant Cell. 16 (12), 3496-3507 (2004).
  28. Zipfel, C., et al. Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception. Nature. 428 (6984), 764-767 (2004).
  29. Mur, L. A. J., Kenton, P., Draper, J. In planta measurements of oxidative bursts elicited by avirulent and virulent bacterial pathogens suggests that H2O2 is insufficient to elicit cell death in tobacco. Plant, Cell and Environment. 28 (4), 548-561 (2005).
  30. Kobayashi, M., et al. Calcium-dependent protein kinases regulate the production of reactive oxygen species by potato NADPH oxidase. The Plant Cell. 19 (3), 1065-1080 (2007).
  31. Yoshioka, H., et al. Induction of Plant gp91 phox Homolog by Fungal Cell Wall, Arachidonic Acid, and Salicylic Acid in Potato. Molecular Plant-Microbe Interactions. 14 (6), 725-736 (2001).
  32. Klauser, D., Flury, P., Boller, T., Bartels, S. Several MAMPs, including chitin fragments, enhance AtPep-triggered oxidative burst independently of wounding. Plant Signaling and Behavior. 8 (9), e25346(2013).
  33. El Gueddari, N. E., Rauchhaus, U., Moerschbacher, B. M., Deising, H. B. Developmentally regulated conversion of surface-exposed chitin to chitosan in cell walls of plant pathogenic fungi. New Phytologist. 156 (1), 103-112 (2002).
  34. Daiber, A., et al. Detection of superoxide and peroxynitrite in model systems and mitochondria by the luminol analogue L-012. Free Radical Research. 38 (3), 259-269 (2004).
  35. Bauer, Z., Gómez-Gómez, L., Boller, T., Felix, G. Sensitivity of Different Ecotypes and Mutants of Arabidopsis thaliana toward the Bacterial Elicitor Flagellin Correlates with the Presence of Receptor-binding Sites. Journal of Biological Chemistry. 276 (49), 45669-45676 (2001).
  36. Vetter, M. M., et al. Flagellin perception varies quantitatively in arabidopsis thaliana and its relatives. Molecular Biology and Evolution. 29 (6), 1655-1667 (2012).
  37. Chinchilla, D. The Arabidopsis Receptor Kinase FLS2 Binds flg22 and Determines the Specificity of Flagellin Perception. The Plant Cell. 18 (2), 465-476 (2006).
  38. Lloyd, S. R., Schoonbeek, H., Trick, M., Zipfel, C., Ridout, C. J. Methods to Study PAMP-Triggered Immunity in Brassica Species. Molecular Plant-Microbe Interactions. 27 (3), 286-295 (2014).
  39. Clarke, C., Vinatzer, B. Characterizing the Immune-Eliciting Activity of Putative Microbe-Associated Molecular Patterns in Tomato. Methods in Molecular Biology. 1578, 249-261 (2017).
  40. Gimenez-Ibanez, S., Hann, D. R., Chang, J. H., Segonzac, C., Boller, T., Rathjen, J. P. Differential Suppression of Nicotiana benthamiana Innate Immune Responses by Transiently Expressed Pseudomonas syringae Type III Effectors. Frontiers in Plant Science. 9, 688(2018).
  41. Wei, Y., et al. The Ralstonia solanacearum csp22 peptide, but not flagellin-derived peptides, is perceived by plants from the Solanaceae family. Plant Biotechnology Journal. 16 (7), 1349-1362 (2018).
  42. Melcher, R. L. J., Moerschbacher, B. M. An improved microtiter plate assay to monitor the oxidative burst in monocot and dicot plant cell suspension cultures. Plant Methods. 12, 5(2016).
  43. Perraki, A., et al. Phosphocode-dependent functional dichotomy of a common co-receptor in plant signalling. Nature. 561 (7722), 248-252 (2018).
  44. Yamaguchi, K., Kawasaki, T. Chitin-Triggered MAPK Activation and ROS Generation in Rice Suspension-Cultured Cells. Methods in Molecular Biology. 1578, 309-316 (2017).
  45. Ortmann, I., Conrath, U., Moerschbacher, B. M. Exopolysaccharides of Pantoea agglomerans have different priming and eliciting activities in suspension-cultured cells of monocots and dicots. FEBS Letters. 580 (18), 4491-4494 (2006).
  46. Ortmann, I., Sumowski, G., Bauknecht, H., Moerschbacher, B. M. Establishment of a reliable protocol for the quantification of an oxidative burst in suspension-cultured wheat cells upon elicitation. Physiological and Molecular Plant Pathology. 64 (5), 227-232 (2004).
  47. Dos Santos, A. L. W., El Gueddari, N. E., Trombotto, S., Moerschbacher, B. M. Partially acetylated chitosan oligo- and polymers induce an oxidative burst in suspension cultured cells of the gymnosperm Araucaria angustifolia. Biomacromolecules. 9 (12), 3411-3415 (2008).
  48. Bressendorff, S., Rasmussen, M., Petersen, M., Mundy, J. Chitin-Induced Responses in the Moss Physcomitrella patens. Methods in Molecular Biology. , 317-324 (2017).
  49. Lloyd, S. R., Ridout, C. J., Schoonbeek, H. Methods to Quantify PAMP-Triggered Oxidative Burst, MAP Kinase Phosphorylation, Gene Expression, and Lignification in Brassicas. Methods in Molecular Biology. 1578, 325-335 (2017).
  50. Gómez-Gómez, L., Boller, T. FLS2: An LRR Receptor-like Kinase involved in the perception of the bacterial elicitor flagellin in Arabidopsis. Molecular Cell. 5 (6), 1003-1011 (2000).
  51. Li, J., et al. Specific ER quality control components required for biogenesis of the plant innate immune receptor EFR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15973-15978 (2009).
  52. Lu, X., et al. Uncoupling of sustained MAMP receptor signaling from early outputs in an Arabidopsis endoplasmic reticulum glucosidase II allele. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (52), 22522-22527 (2009).
  53. Nekrasov, V., et al. Control of the pattern-recognition receptor EFR by an ER protein complex in plant immunity. EMBO Journal. 28 (21), 3428-3438 (2009).
  54. Boutrot, F., et al. Direct transcriptional control of the Arabidopsis immune receptor FLS2 by the ethylene-dependent transcription factors EIN3 and EIL1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (32), 14502-14507 (2010).
  55. Kadota, Y., et al. Direct Regulation of the NADPH Oxidase RBOHD by the PRR-Associated Kinase BIK1 during Plant Immunity. Molecular Cell. 54 (1), 43-55 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

MAP Kinase
תבנית-המופעל חמצוני ושתיל עיכוב הצמיחה שתילה Assays באריידרופסיס thaliana
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.