מאמר שיטה

סינתזה Functionalization, איפיון חלקיקים הסיליקון הנקבובי Fusogenic למסירה Oligonucleotide

DOI:

10.3791/59440

⸱

16 באפריל 2019

 , 
1Materials Science and Engineering Program, University of California, San Diego, 2Department of Chemistry and Biochemistry, University of California, San Diego

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נדגים את הסינתזה של חלקיקים fusogenic הסיליקון הנקבובי למסירה oligonucleotide במבחנה, ויוו יעיל. הסיליקון הנקבובי חלקיקים נטענים עם siRNA ליצירת הליבה, שהטיחה מאת fusogenic שומנים דרך ההבלטה כדי ליצור את הקליפה. Functionalization moiety מיקוד איפיון חלקיקים הינם כלולים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עם כניסתו של טיפול גנטי, הפך התפתחות מערכת משלוחים יעיל ויוו נוקלאוטיד-המטען של ייבוא מקביל. Fusogenic הסיליקון הנקבובי חלקיקים (F-pSiNPs) הראו לאחרונה גבוהה ג'ין ויוו להשתיק היעילות עקב שלה oligonucleotide גבוהה טעינה קיבולת ועל מסלול ייחודי ספיגת הסלולר זה מונע אנדוציטוזה. הסינתזה של F-pSiNPs הוא תהליך רב שלבי הכולל: טעינת ואיטום (1) oligonucleotide דים על נקבוביות הסיליקון; (2) ציפוי סימולטני ושינוי של fusogenic שומנים סביב הליבות הסיליקון הנקבובי; (3) ההטיה של פילוח פפטידים ושטיפת להסיר את עודף oligonucleotide, סיליקון פסולת ופפטיד. האחידות בגודל של החלקיק מאופיין על ידי פיזור אור דינאמי, מבנהו ליבה-קליפה ניתן לבירור על ידי במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים. תפיסה fusogenic מאומתת על-ידי טעינת lipophilic לצבוע, 1, 1'-dioctadecyl-3,3, 3', פרכלורט 3'-tetramethylindocarbocyanine (DiI), לתוך fusogenic שכבה ליפידית וטיפול זה לתאים במבחנה להתבונן על קרום פלזמה מכתים לעומת endocytic localizations. המטרה ואת ויוו ג'ין שתיקה efficacies היו בעבר לכמת במודל של עכברים של דלקת ריאות Staphylococcus aureus , שבו פפטיד מיקוד צפוי לעזור F-pSiNPs לבית לאתר של זיהום. מעבר היישום שלה ב- S. aureus זיהום, מערכת F-pSiNP עשוי לשמש כדי לספק כל oligonucleotide עבור ריפוי גנטי של מגוון רחב של מחלות, כולל זיהומים נגיפיים, סרטן ומחלות אוטואימוניות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ריפוי גנטי ממיקרו ביטוי גנים ספציפיים כדי לקבל תוצאה טיפולית. כלים רבים עבור ג'ין אפנון יש כבר גילה ולמד, כולל הפרעות חומצה ריבונוקלאית (RNAi) באמצעות oligonucleotides (למשל, קצר מפריעות RNA (siRNA)1,2, microRNA (miRNA)3,4 ), ה-DNA פלסמידים5,6, nucleases (למשל, אצבע אבץ, TALENS)7,8, ו CRISPR/Cas9 מערכות9,10. בזמן של הכלי כל מנגנון פעולה שונה, כל הכלים צריך להגיע הציטופלסמה של התא או את הגרעין להיות פעילים. ככזה, בעוד כלים אלה הוכיחו לזירוז השפעה משמעותית של הכוח ויסות גנים במבחנה, היעילות ויוו סובל מכשולים חוץ-תאית, תאיים. בשל העובדה כי הכלים הם ממקור ביולוגי, אנזימים רבים, מערכות סליקה קיים בגוף שלנו יש את היכולת להשפיל או להסיר את מולקולות זרות11. אפילו במקרה כי הכלים להגיע לתא המטרה, הם סובלים אנדוציטוזה; מצב של ספיגת הסלולר מבצע אנקפסולציה, מלכודות הכלים בשלפוחית כמו קיבה חומצי לבזות או לגרש את הכלים מחוץ לתאים. למעשה, מחקרים הראו כי השומנים חלקיקים הם endocytosed ויה macropinocytosis, שממנו הם כ- 70% siRNA exocytosed את התאים בתוך 24 שעות של ספיגת12,13. רוב siRNA הנותרים הם השפיל דרך השביל lysosomal, ולהשיג בסופו של דבר רק 1-2% של siRNA המוסיפה בתחילה את התא עם חלקיקים endosomal לברוח העלול לעבור RNAi13,14 .

לאחרונה פיתחנו fusogenic הסיליקון הנקבובי חלקיקים (F-pSiNPs) בעלות של הליבה siRNA טעון מורכב הסיליקון הנקבובי חלקיקים, ו fusogenic השומנים מעטפת15. F-pSiNPs מציגים שלושה יתרונות עיקריים על פני מערכות אחרות oligonucleotide המקובלת: (1) ליפופרוטאין fusogenic ציפוי המאפשר את החלקיקים לעקוף אנדוציטוזה ולספק את כל המטען ישירות בציטופלסמה תא (לעומת % 1-2 מושגת על-ידי endocytosed חלקיקים13,14) (איור 1); (2) הטעינה מסה גבוהה של siRNA ב pSiNPs (> 20% wt לעומת wt 1-15% על ידי מערכות קונבנציונלי)15, אשר במהירות לבזות בציטופלסמה (פעם החלקיקים הליבה לשפוך את ציפוי השומנים דרך ספיגת fusogenic) כדי לשחרר את siRNA; (3) מיקוד פפטיד ההטיה של יונת סלקטיבית כדי הרצוי סוגי תאים ויוו.

מערכת F-pSiNP הוכיחה משמעותית ג'ין להשתיק יעילות (> גופית; 95% > 80% ויוו) ואת האפקט הטיפולי עוקבות במודל של עכברים קטלנית של S. aureus דלקת ריאות; התוצאות אשר פורסמו בעבר15. עם זאת, המבנה המורכב של מערכת F-pSiNP דורש התייחסות רגישה ואופטימיזציה מכויל כדי ליצור חלקיקים אחיד ויציב. לפיכך, מטרת עבודה זו היא להציג פרוטוקול יסודי, וכן אסטרטגיות אופטימיזציה עבור סינתזה, functionalization, אפיון של F-pSiNPs כדי לשמש יישוב מסירת siRNAs לאפקט שתיקה ג'ין חזק.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. סינתזה של הסיליקון הנקבובי חלקיקים (pSINPs)

התראה: תמיד באמצעי זהירות כאשר עובדים עם חומצה הידרופלואורית (HF). בצע את כל מדריכי בטיחות על פי גיליון הנתונים שלו בטיחות (מרחביות), לטפל בכימיקלים המכילים HF בשכונה fume בה ללבוש ציוד מגן אישי המתאים (עיקרון השוויון הפוליטי; כפפות כפול עם כפפות בוטיל מבחוץ, בוטיל סינר עם חלוק המעבדה מתחת, הפנים מגן עם משקפי בטיחות מתחת.) כל אוניברסיטאות, מעבדות R & D דורשים הכשרה ספציפית על בטיחות HF לפני השימוש. אל תנסו לעבוד עם HF ללא אישור מראש של רכז בטיחות מעבדה המקומי שלך, כנדרש אמצעי בטיחות נוספים לא המתוארים כאן.

  1. אופן ההכנה של פתרונות תחריט
    1. כדי להפוך את הפתרון HF 3:1 עבור חריטה (בשימוש צעדים 1.3 ו 1.4), מילוי פלסטיק סיים את גליל עם 30 מ של מימית HF 48% ו- 10 מ"ל אתנול מוחלט (EtOH). הפתרון חייב להיות כלול בתוכו פלסטיק צפיפות גבוהה (HDPE, למשל), כמו HF מתמוסס זכוכית.
    2. כדי להפוך 1:29 HF פתרון להמראה (שלב בשימוש 1.5), מילוי פלסטיק סיים את גליל עם 1 מ"ל של HF 48% מימית, 29 מיליליטר אתנול מוחלטת. הפתרון חייב להיות כלול בתוכו פלסטיק צפיפות גבוהה (HDPE, למשל), כמו HF מתמוסס זכוכית.
    3. להפוך את הפתרון קו 1 מ' ב 10% EtOH לפירוק עודף pSi (בשימוש צעדים 1.3 ו 1.5).
  2. הגדרת תא איכול
    1. טפלון לחרוט התא עם 8.6 ס"מ2 לחרוט טוב (אזור מחושב על ידי מדידת הקוטר של משטח סיליקון זמין עבור תצריב בתוך o-ring חישוב השטח מאת A = πr2), במקום יורד (איור 2 א): (1) טפלון התא העליון; (2 o-ring); (3) יצירה ברבע של הגביש יחיד (1 0 0) - אוריינטציה p + + - סוג הסיליקון וופל חתוך לרבעים (באמצעות םימולהי רחוס); (4) רדיד אלומיניום; (5) התא טפלון הבסיס עם ברגים התהדקה בעדינות כדי למנוע דליפה.
    2. למלא את הבאר EtOH. קחו מגבון והכנס לתוך הבקיע באמצע טפלון תא, בסיס. אם המחיקה יבש על הסרת, התא איכול אטומה. אם מרטיבים התא דולף, להדק הברגים עוד יותר עד אטום.
  3. אלקטרופוליש כשהפחד סיליקון
    1. להכניס את התא איכול שהורכב ברדס fume.
    2. למלא את הבאר 10 מ"ל של פתרון HF 3:1.
    3. להתחבר להוביל חיובי רדיד האלומיניום (אלקטרודה) מהתא איכול וחבר להוביל שלילי הסליל פלטינה (האלקטרודה הנגד) טובל את הפתרון HF 3:1 של התא איכול כדי להשלים את המעגל (איור 2b).
    4. הפעל קבוע הנוכחית ב- 50 ס מ מא-2 60 s. פעם לחרוט סיימו, הסר את התא של המעגל, לשטוף את HF 3:1 בזהירות באמצעות מזרק. לשטוף עם EtOH שלוש פעמים.
    5. להתמוסס השכבה חרוט על-ידי מילוי הבאר לאט עם 10 מ של 1 מ' KOH. המתן עד שמבעבע שוככת.
    6. לשטוף את קו עם מים שלוש פעמים, ולאחר מכן עם EtOH שלוש פעמים.
  4. Electrochemically תצריב שכבות נקבובי לתוך הסיליקון וופל
    1. לרוץ על חילופין של גל מרובע, עם current density התחתון של אמא/cm 502 עבור 0.6 s, צפיפות זרם גבוהה של אמא/cm 4002 עבור 0.36 s חוזר על עצמו עבור 500 מחזורי.
    2. פעם לחרוט סיימו, הסר את התא של המעגל, לשטוף את HF 3:1 בזהירות באמצעות מזרק. לשטוף עם EtOH שלוש פעמים.
  5. הרמת-off השכבה נקבובי מ כשהפחד סיליקון
    1. למלא את הבאר עם 10 מ ל 1:29 HF פתרון.
    2. הפעל קבוע של אמא/cm 3.72 בשביל 250 s. פעם לחרוט סיימו, הסר את התא של המעגל. השכבה pSi עשויים להיות גלויים אדוות המציין ניתוק כשהפחד סיליקון גבישי. בעדינות לשטוף 1:29 HF פתרון ולשטוף עם EtOH שלוש פעמים ולאחר מכן עם מים שלוש פעמים.
    3. בחוזקה באמצעות טיפ פיפטה, לפצח את היקף השכבה pSi עבור ניתוק מוחלט. שימוש EtOH, לאסוף שברי pSi (צ'יפס) טפלון לחרוט תא לתוך סירה במשקל. להעביר את האסימונים בקבוקון זכוכית. האסימונים pSi עשוי להישמר בטמפרטורת החדר EtOH מעל 6 חודשים לאחסון.
    4. להתמוסס כל הסיליקון הנקבובי הנותרים על כשהפחד באמצעות מילוי הבאר לאט עם 10 מ של 1 מ' KOH. המתן עד שמבעבע שוככת.
    5. לשטוף את קו עם מים שלוש פעמים, ולאחר מכן עם EtOH שלוש פעמים.
    6. חזור על שלבים 1.3-1.5 עד עובי וופל כולו היה חרוט.
  6. Sonicating נקבובי שכבות על היווצרות nanoparticle
    1. החלף את הממס של המיכל זכוכית המכילה שבבי pSi החל EtOH 2 מ של מים DI.
    2. בחוזקה לסגור את הפקק, לאטום באמצעות מצלמות-מיקרוסקופים.
    3. מקום הזכוכית בקבוקון באמבט sonicator והחזיקה כך עוצמת הקול של שבבי pSi לגמרי שקוע מתחת לפני השטח.
    4. Sonicate במשך 12 שעות-35 קילו-הרץ והכוח RF של 48W. כדי למנוע אובדן מים משמעותי במהלך sonication, במקום על סטריליות מלא מים, הפוך כך פתיחת הבקבוק נוגע השטח של האמבט במים.
    5. מניחים את המבחנה זכוכית על משטח שטוח עבור h 1 לאפשר חלקיקים גדולים יותר להתיישב בחלק התחתון. לאסוף את תגובת שיקוע באמצעות פיפטה; ההשעיה מכיל pSiNPs תת-100 ננומטר.

2. הכנת הסרט השומנים fusogenic

  1. אופן ההכנה של פתרונות מניות של השומנים
    1. בשכונה fume, לעשות 10 מ"ג/מ"ל מניות של שומנים על ידי לחות DMPC, DSPE-פג-מל ושומנים DOTAP ב כלורופורם. פתרונות מניות אלה נשמרות ב-20 ° C עד 6 חודשים תחת חותם חזק מצלמות-מיקרוסקופים.
  2. בעשיית הסרט השומנים fusogenic
    הערה: fusogenic עשוי של ליפידים, DMPC, DSPE-יתד, DOTAP, על היחס טוחנת של 76.2:3.8:20 ו- 96.2:3.8:0, בהתאמה.
    1. בבקבוקון זכוכית, לערבב μL 72.55 של DMPC, μL 15.16 של DSPE-יתד μL 19.63 של DOTAP על ידי pipetting.
    2. אופציונלי: פלורסנט labelling של ציפוי השומנים, בנוסף להוסיף 20 µL של DiI מומס EtOH-ריכוז של 1 מ"ג/מ"ל.
    3. הכנס את המבחנה ברדס fume עם כובע רופף כדי לאפשר את הכלורופורם מתמוססות בן לילה. הסרט מיובשים יהיה מעונן חומר דמוי ג'ל קשה בתחתית המבחנה.

3. טעינת ואיטום של siRNA ב- pSiNPs

  1. הכנת סידן כלורי טעינת מניות
    1. להמיס 1.11 גר' CaCl2 ב- 10 מ"ל של מים RNAse-חופשית כדי ליצור פתרון2 CaCl 2 מ'.
    2. Centrifuge הפתרון > 10,000 x g עבור 1 דקות ליישב מצרפי ולאסוף את תגובת שיקוע באמצעות פיפטה של. לחלופין, לסנן את הפתרון דרך מסנן 0.22 מיקרומטר.
  2. הכנת siRNA טעינת מניות
    1. מימה או לדלל את siRNA מיקרומטר 150 במים נטולי RNAse. פתרון מניות זה ייתכן aliquoted, נשמרים קפואים ב-20 ° C למשך 30 ימים לפחות נתון כי זה אינו עובר מחזורים ההקפאה בתדירות גבוהה-הפשרה.
  3. טעינה של siRNA ב pSiNPs עם סידן כלורי
    1. הכנת אמבט sonication קר.
    2. תחת 15 דקות ultrasonication, בעדינות פיפטה 150 µL של siRNA ו- 700 µL של 2 M CaCl2 לתוך 150 µL של pSiNP. הקפד להשאיר את המכסה של הצינור microcentrifuge פתוח לדור גז.
    3. הסר את הצינור המכיל 1 מ"ל של סידן טעון siRNA מצופה pSiNPs מ sonicator.

4. ציפוי שנטענו siRNA pSiNPs עם fusogenic שומנים

  1. הכנת ערכת ההבלטה ליפוזום
    1. למלא גביע רחב במים DI. להשרות פוליקרבונט 1 קרום (200 ננומטר נקבוביות), וכן תומך מסנן 4 מאת צף אותם על פני המים. להרכיב את הקיט ההבלטה ליפוזום לפי הוראות היצרן
  2. לחות הסרט ליפיד עם pSiNps טעון siRNA
    1. מימה הסרט השומנים מיובשים בבקבוקון זכוכית עם 1 מיליליטר של סידן טעון siRNA מצופה pSiNPs המתקבל שלב 3.3.3. פיפטה עד כל הסרט שומנים לקחתם מתחתית המבחנה יש מעורבבות פתרון הומוגני מעונן.
    2. במקום בר מלהיב מגנטי בבקבוקון זכוכית, ומניחים את הצנצנת על גבי צלחת חמה לחמם את החלקיקים 40 ° צ' (או מספיק גבוה מעל שלב שינוי הטמפרטורה של ליפידים כדי לשמור על ליפידים בשלב גביש נוזלי יותר fluidic) בעוד מגנטית זע הפתרון עבור 20 דקות.
  3. הבלטת ממד של pSiNPs מצופים השומנים לבקרת גודל
    1. וביופסיה 1 מ"ל של פתרון מצופים השומנים pSiNP-siRNA במזרק ההבלטה. הכנס של מזרק ריק בצד אחד של המתקן, ואת המזרק מלא בצד השני.
    2. להתחיל ההבלטה דוחף את הבוכנה לאט לדחוף את החלקיקים של מזרק אחד, דרך קרום פוליקרבונט, ועל לתוך האחר. חזור על פי 20. אם הבוכנה תקוע, ייתכן סתומות את המסנן ואת קרום. לפרק את המתקן ולהחליף תומך ממברנה וסינון. אם הבעיה נמשכת, לדלל את החלקיקים עד סתימת לניהול.
    3. לאסוף את החלקיקים מעוקם לתוך צינור microcentrifuge.

5. ההטיה של מיקוד פפטידים

  1. Conjugating פפטיד מיקוד כדי ציפוי השומנים
    1. הכינו המניה פפטיד עם 1 מ"ג/מ"ל פפטיד ריכוז במים נטולי RNAse.
    2. ב microcentrifuge הצינור המכיל fusogenic מצופים השומנים pSiNPs, להוסיף 100 µL של 1 מ"ג/מ"ל פפטיד מניות, pipet בעדינות. שמור את הצינור סטטי בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות (לחלופין, > 2 h ב 4 ° C).
    3. כדי להסיר את עודף פפטיד או siRNA וחומרים אחרים בלתי פעילים, לשטוף במסנן צנטריפוגלי 30 kDa מאת ספינינג בשעה x 5,000 g ב- 25 ° C עבור 1 ח' צנטריפוגה עוד פעמיים עם 1 מ"ל של PBS תחת אותה הגדרה.
    4. Resuspend את pSiNPs מצופים השומנים fusogenic מצומדת-פפטיד הסופי ב- PBS ב הריכוז הרצויה. החלקיקים ניתן עכשיו aliquoted וקפואים ב-80 מעלות צלזיוס לאחסון לפחות 30 ימים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שילוב מוצלח של fusogenic pSiNPs צריך לייצר פתרון הומוגני, כמעצמה (איור 3 א). כשל כדי למטב את היחס ואת ריכוז של pSiNPs: siRNA: CaCl2 עשוי להוביל צבירה בעת טעינת (איור 3b). כל החלקיקים הם extruded דרך ממברנות 200 ננומטר, קוטר hydrodynamic הממוצע pSiNPs fusogenic נמדדת DLS צריך להיות כ-200 nm, ו- mV פוטנציאל זטה הממוצע כ +7 כמוצג באיור4. לאחר שינוי פני השטח עם מיקוד פפטידים, הקוטר הכולל צריך ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סינתזה של חלקיקים הסיליקון הנקבובי מוצג באיור5. השלב הקריטי בסינתזה של fusogenic pSiNPs הוא שלב ההעמסה (שלב 3). אם הנך מסכם חלקיקים fusogenic שלאחר סינתזה (איור 3), הסיבה לכך יכול להיות בגלל הבאות: (1) סידן כלורי המניה לא הוכן למשל, ולכן שלב 3.1.2 יש בקפידה עקב או מעודן; או (2) היחס בין pSiNP: siRNA: CaCl2 או את הריכוז של אחד או יותר שלושת המרכיבים לא ייתכן אופטימלית. אופטימיזציה מחדש החל מריכוז2 CaCl הוא הציע (למשל, שינוי 2 מ' 1 מ' או 3 מ'...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MJS הוא מייסד מדעי ספינקר החיים, inc., ויש לו אינטרס הון החברה.  למרות המענק הזה זוהתה לניהול ניגוד עניינים המבוסס על הטווח הכולל של הפרויקט ואת התועלת הפוטנציאלית שלה כדי ספינקר החיים, inc., ממצאי המחקר כללו בפרסום מסוים זה לא בהכרח מתייחסת לאינטרסים של הספינקר החיים, inc. תנאי ההסדר הזה יש כבר נבדקו, שאושרו על-ידי אוניברסיטת קליפורניה, סן דייגו מדיניותה ניגוד אינטרסים. מחברים אחרים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכת על ידי מכוני הבריאות הלאומיים דרך חוזה # R01 AI132413-01.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אבקת 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)אבקת Avanti Polar Lipids850345P
1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (מלח כלוריד) (DOTAP)אבקתAvanti Polar Lipids890890P
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide (פוליאתילן גליקול)-2000] (מלח אמוניום) (DSPE-PEG(2000) Maleimide)אוונטי ליפידים קוטביים880126Pרדיד
אלומיניוםVWR International, LLC12175-001
סידן כלורי (CaCl2)ספקטרוםC1977נטול מים, כדורי
כלורופורםפישר סיינטיפיקC6061
מחשבDellDimension 9200כל מחשב עם חריץ לכרטיס PCI מקובל
Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine perchlorate ('DiI'; DiIC18(3)))LifeTechnologiesD3911
אתנול (EtOH)UCSD Store111200 הוכחה
לחומצה הידרופלורית (HF)VWR International, LLCMK264008 טוהר: 48%
Keithley 2651a מד מקורKeithley2651A
LabVIEWNational Instrumentsתוכנית לדוגמה זמינה בכתובת: http://sailorgroup.ucsd.edu/sofware/
LysoTracker Green DND-26Thermo Fisher ScientificL7526
סט שחול ליפוזום עם בלוק חימוםAvanti Polar Lipids610000
Microcon-30kDa צנטריפוגלי יחידת סינוןEMD MilliporeMRCF0R030
טבעת OChemGlassCG-305-220
מלח חוצץ פוספט (PBS)Thermo Fisher Scientific10010-049
סליל פלטינהVWR International, LLCAA10285-BU
אשלגן הידרוקסיד (KOH)Fisher ScientificP250-3
פרוסתסיליקוןSiltronixמותאמת אישית
siRNADharmaconהזמנה מותאמת אישיתIRF5, sense 5'-dTdT-CUG CAG AGA AUA ACC CUG A-dTdT-3' ו-antisense 5'-dTdT UCA GGG UUC UCU GCA G dTdT-3'
SonicatorVWR International, LLC97043-960
מיקוד פפטיד (CRV)CPC מדעירצף הזמנה מותאם אישיתCRVLRSGSC; נעשה מחזורי על ידי קשר דיסולפיד בין שרשראות הצד של שתי שאריות הציסטאין
תחריט תא טפלוןממשק ביצועים חומרים, בע"מ.מותאמת אישית
של מים מזוקקים ללא DNase/RNase תרמו פישר סיינטיפיק10977015
אבקה הזמנה הזמנה

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ryther, R. C. C., Flynt, A. S., Phillips Iii, J. A., Patton, J. G. siRNA therapeutics: big potential from small RNAs. Gene Therapy. 12, 5(2004).
  2. Scherman, D., Rousseau, A., Bigey, P., Escriou, V. Genetic pharmacology: progresses in siRNA delivery and therapeutic applications. Gene Therapy. 24, 151(2017).
  3. Broderick, J. A., Zamore, P. D. MicroRNA therapeutics. Gene Therapy. 18, 1104(2011).
  4. Geisler, A., Fechner, H. MicroRNA-regulated viral vectors for gene therapy. World Journal of Experimental Medicine. 6 (2), 37-54 (2016).
  5. Williams, P. D., Kingston, P. A. Plasmid-mediated gene therapy for cardiovascular disease. Cardiovascular Research. 91 (4), 565-576 (2011).
  6. Ferreira, G. N. M., Monteiro, G. A., Prazeres, D. M. F., Cabral, J. M. S. Downstream processing of plasmid DNA for gene therapy and DNA vaccine applications. Trends in Biotechnology. 18 (9), 380-388 (2000).
  7. Shim, G., et al. Therapeutic gene editing: delivery and regulatory perspectives. Acta Pharmacologica Sinica. 38, 738(2017).
  8. Carlson, D. F., Fahrenkrug, S. C., Hackett, P. B. Targeting DNA With Fingers and TALENs. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1, (2012).
  9. Dai, W. -J., et al. CRISPR-Cas9 for in vivo Gene Therapy: Promise and Hurdles. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 5, e349(2016).
  10. Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communications. 9 (1), 1911(2018).
  11. Houseley, J., Tollervey, D. The Many Pathways of RNA Degradation. Cell. 136 (4), 763-776 (2009).
  12. Sahay, G., et al. Efficiency of siRNA delivery by lipid nanoparticles is limited by endocytic recycling. Nature Biotechnology. 31 (7), 653-658 (2013).
  13. Wang, Y., Huang, L. A window onto siRNA delivery. Nature Biotechnology. 31 (7), 611-612 (2013).
  14. Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nature Biotechnology. 31 (7), 638-646 (2013).
  15. Kim, B., et al. Immunogene therapy with fusogenic nanoparticles modulates macrophage response to Staphylococcus aureus. Nature Communications. 9 (1), 1969(2018).
  16. Zhang, X., et al. Targeted Disruption of G0/G1 Switch Gene 2 Enhances Adipose Lipolysis, Alters Hepatic Energy Balance, and Alleviates High-Fat Diet–Induced Liver Steatosis. Diabetes. 63 (3), 934-946 (2014).
  17. Schlosser, K., Taha, M., Deng, Y., Stewart, D. J. Systemic delivery of MicroRNA mimics with polyethylenimine elevates pulmonary microRNA levels, but lacks pulmonary selectivity. Pulmonary Circulation. 8 (1), 2045893217750613(2018).
  18. Komarov, A. P., et al. Functional genetics-directed identification of novel pharmacological inhibitors of FAS- and TNF-dependent apoptosis that protect mice from acute liver failure. Cell Death & Disease. 7, e2145(2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

siRNA

מאמרים קשורים