כאן, אנו מציגים פרוטוקול להערכת תפקודית הריבוי סינפטית באמצעות תיקון שלם-תא קלאמפ אלקטרופיזיולוגיה פרוסות המוח חריפה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הערכה של ריבוי סינפטית באמצעות תאים כל תיקון-קלאמפ אלקטרופיזיולוגיה
במאמר זה
סיכום
תקציר
במערכת העצבים המרכזית, זוג של הנוירונים יוצרים לעתים קרובות מספר קשרים סינפטיים ו/או אתרים שחרור נוירוטרנסמיטר פונקציונלי (ריבוי סינפטית). ריבוי סינפטית היא פלסטיק ושינויים במהלך הפיתוח, בתנאים פיזיולוגיים שונים, להיות דטרמיננטה חשוב עבור היעילות של ההעברה הסינאפסית. כאן, אנחנו חלוקה לרמות ניסויים עבור הערכת מידת הריבוי של הסינפסות הפסקת אל נוירון postsynaptic נתון באמצעות תיקון שלם-תא קלאמפ אלקטרופיזיולוגיה פרוסות המוח חריפה. באופן ספציפי, מתח-קלאמפ הקלטה משמש כדי להשוות את ההבדל בין את משרעת של זרמי postsynaptic סינאפסות ספונטנית (sEPSCs) וזרמים מיניאטורי סינאפסות postsynaptic (mEPSCs). התיאוריה מאחורי שיטה זו הוא כי תשומות מביא כי התערוכה ריבוי יראה sEPSCs גדול, תלויי-פוטנציאל הפעולה בעקבות יציאתו סינכרונית המתרחשת על כל איש קשר סינפטית. לעומת זאת, שחרור ללא תלות פוטנציאל הפעולה (וזה אסינכרוני) יפיק mEPSCs משרעת קטנים יותר. מאמר זה מתאר קבוצה של ניסויים וניתוחים לאפיין את קיומו של ריבוי סינפטית ודן את הדרישות ואת המגבלות של הטכניקה. טכניקה זו ניתן להחיל לחקור כמה שונה התערבויות התנהגותיות, תרופתי או סביבתיים בתחום vivo משפיעים על הארגון של קשרים סינפטיים באזורי מוח שונים.
מבוא
הסינאפסית הוא מנגנון בסיסי עבור תקשורת בין נוירונים, לפיכך, תפקוד המוח. הסינאפסית גם יציב, באפשרותך לשנות את יעילותה באופן תלוי-פעילות כמו גם כמו בתגובה אותות modulatory1. לפיכך, בחינת תפקוד סינפטית היה מוקד מרכזי של חקר המוח. אלקטרופיזיולוגיה מלחציים תיקון כל תא הוא טכניקה תכליתי המאפשר לנו להבין, על-ידי להמציא עיצובים מוטוריים וניתוחים נתונים, מעמיק מנגנונים biophysical ומולקולרית של ההעברה הסינאפסית. בגישה נפוץ, אולי בשל הפשטות של טכניקה, קונספט, הוא המדד של זרמי postsynaptic סינאפסות מעכבות מיניאטורי (בי / IPSCs) תחת המתח תהדק את תצורת2,3, 4 ,....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
ניסויים בבעלי חיים כל המאושרים על ידי ועדת אכפת של מאוניברסיטת מערב אונטריו לפי המועצה הקנדית על הנחיות טיפול בעלי חיים (AUP #2014-031) של בעלי חיים.
1. פתרונות
-
פתרון עם פרוסות
- עיין טבלה 1 לקבלת ההרכב של הפתרון עם פרוסות.
- להכין פתרון מניות 20 x מראש ואחסן אותו ב 4 ° C עד כחודש.
- 1 x עם פרוסות הפתרון, להמיס3NaHCO, גלוקוז, סוכרוז ddH2O, והוסף את המניה 20 x. להבטיח osmolarity בין mOsm 315-320 ולאחסן את הפתרון עבור לא יותר משבוע 1-4 מעלות צלזיוס.
- למלא שני בקבוקונים עם 100 מ של בציעת פתרון, לכסות אותם עם מצלמות-מיקרוסקופים. מקררים את הפתר....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הפרוטוקול הנ ל מתאר שיטה באמצעות תיקון שלם-תא קלאמפ אלקטרופיזיולוגיה לבחון את מידת הריבוי סינפטית, נוירונים היפותלמי העכבר כדוגמא. טכניקה זו הכנה פרוסה אמור להניב התאים קיימא בריא זה לא יש ממברנה נפוחות או גרעין (איור 1). כל שלב בפרוטוקול זה חשוב לבריאות של רקמות, איכות ההקלטות.
איור 1: רקמה בריאה, לא בריא הבאים לחתוך הכנ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
דרישה חשובה אחת עבור ניסוי אלקטרופיזיולוגיה מלחציים תיקון מוצלח הוא קבלת פרוסות/תאים בריאים. הפרוטוקול המתואר שלנו ממוטב היפותלמי פרוסות המכילות PVN נוירונים. אחרים במוח אזורים עשויים לדרוש ששינה פתרונות, עם פרוסות שיטות21,22,23,24. עבור ההקלטה, זה קריטי לקבל הקלטות יציב רק על ידי וניטור שוטף מאפייני תא כגון התנגדות הממברנה, התנגדות קיבול וגישה. עלייה הגישה התנגדות ניתן להקטין EPSC משרעת, לכן ו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף
תודות
י. ס קיבל מלגה לתואר שני אונטריו. W.I. קיבל מלגת חוקר חדש למחקר בריאות הנפש קנדה. עבודה זו נתמכת על ידי ההפעלה מענקים כדי W.I של מדעי הטבע, הנדסה מחקר המועצה של קנדה (06106-2015 RGPIN) ומכון קנדי למחקר בריאות (PJT 148707).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מזרק BD 1 מ"ל | 309659 | ||
| 10 להבים | פישר סיינטיפיק/אחרים | 35698 | |
| 22 להב | VWR/אחרים | 21909-626 | |
| 22 μ מסנני מזרק | M Milipore | 09-719-000 | |
| Adson foreceps | Harvard Instruments | 72-8547 | |
| מספריים חדים בזווית | מכשירי הרווארד | 72-8437 | |
| Clampex | מכשירים מולקולריים | pClamp 10 | |
| להב קצה כפול | VWR | 74-0002 | |
| נייר סינון | סיגמא/אחרים | 1001090 | |
| מברשת צבע עדינה | פישר / שונים | 15-183-35 / | |
| VWR | LG-8680-120 | ||
| Isoflurane | Fresenius Kabi / אחרים | M60303 | |
| Krazy | |||
| מיני ניתוח | Synaptosoft | MiniAnalysis 6 | |
| Osmomoter | Wescor Inc | דגם 5600 | |
| Parafilm | Sigma | PM-996 | |
| פיפטה פסטר | VWR | 14672-200 | |
| מד ph | מטלר טולדו | FE20-ATC | |
| נורת גומי | VWR | 82024-550 | |
| ידית אזמל מס' 3 | מכשירי הרווארד | 72-8350 | |
| ידית אזמל מס' 4 | מכשירי הרווארד | 72-8356 | |
| להב קצה יחיד | VWR | 55411-050 | |
| פורס ויברטום | Leica | VT1200S | |
| מערכת טיהור מים | Millipore | Milli-Q אקדמי A10 | |
| מכסה צלחת | באר פישר/שונים | 07-201-590/שונים | |
| <חזקים>כימיקלים/ריאגנטים | |||
| 4-AP | Sigma | 275875 | |
| BAPTA | בדיקות מולקולריות | B1204 | |
| CaCl2*2H2O | Sigma | C7902 | |
| CdCl2 | sigma | 202908 | |
| DNQX | Tocris | 189 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| גלוקוז | Sigma | G5767 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| K2-ATP | Sigma | A8937 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| K-gluconate | Sigma | G4500 | |
| MgCl2*6H2O | Sigma | M2670 | |
| כיתה ביולוגיה מולקולרית מים | סיגמא | W4502-1L | |
| Na3GTP | Sigma | G8877 | |
| NaCl | Bioshop | SOD001.1 | |
| Na-gluconate | Sigma | S2054 | |
| NaH2PO4 | Sigma | 71504 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| Picrotoxin | sigma | P1675 | |
| SrCl | Sigma | 255521 | |
| סוכרוז | Bioshop | SUC507.1 | |
| TTX | Alamone Labs | T-550 | |
| yDGG | Tocris | 6729-55-1 |
מקורות
- Abbott, L. F., Nelson, S. B. Synaptic plasticity: taming the beast. Nature Neuroscience. 3 (Supp), 1178-1183 (2000).
- Hsia, A. Y., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Development of Excitatory Circuitry in the Hippocampus. Journal of Neurophysiology. 79 (4), 2013-2024 (1998).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
