Method Article

הערכה של ריבוי סינפטית באמצעות תאים כל תיקון-קלאמפ אלקטרופיזיולוגיה

DOI:

10.3791/59461

⸱

April 23rd, 2019

 , 
1Neuroscience Program, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario, 2Robarts Research Institute, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario, 3Department of Physiology and Pharmacology, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להערכת תפקודית הריבוי סינפטית באמצעות תיקון שלם-תא קלאמפ אלקטרופיזיולוגיה פרוסות המוח חריפה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במערכת העצבים המרכזית, זוג של הנוירונים יוצרים לעתים קרובות מספר קשרים סינפטיים ו/או אתרים שחרור נוירוטרנסמיטר פונקציונלי (ריבוי סינפטית). ריבוי סינפטית היא פלסטיק ושינויים במהלך הפיתוח, בתנאים פיזיולוגיים שונים, להיות דטרמיננטה חשוב עבור היעילות של ההעברה הסינאפסית. כאן, אנחנו חלוקה לרמות ניסויים עבור הערכת מידת הריבוי של הסינפסות הפסקת אל נוירון postsynaptic נתון באמצעות תיקון שלם-תא קלאמפ אלקטרופיזיולוגיה פרוסות המוח חריפה. באופן ספציפי, מתח-קלאמפ הקלטה משמש כדי להשוות את ההבדל בין את משרעת של זרמי postsynaptic סינאפסות ספונטנית (sEPSCs) וזרמים מיניאטורי סינאפסות postsynaptic (mEPSCs). התיאוריה מאחורי שיטה זו הוא כי תשומות מביא כי התערוכה ריבוי יראה sEPSCs גדול, תלויי-פוטנציאל הפעולה בעקבות יציאתו סינכרונית המתרחשת על כל איש קשר סינפטית. לעומת זאת, שחרור ללא תלות פוטנציאל הפעולה (וזה אסינכרוני) יפיק mEPSCs משרעת קטנים יותר. מאמר זה מתאר קבוצה של ניסויים וניתוחים לאפיין את קיומו של ריבוי סינפטית ודן את הדרישות ואת המגבלות של הטכניקה. טכניקה זו ניתן להחיל לחקור כמה שונה התערבויות התנהגותיות, תרופתי או סביבתיים בתחום vivo משפיעים על הארגון של קשרים סינפטיים באזורי מוח שונים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הסינאפסית הוא מנגנון בסיסי עבור תקשורת בין נוירונים, לפיכך, תפקוד המוח. הסינאפסית גם יציב, באפשרותך לשנות את יעילותה באופן תלוי-פעילות כמו גם כמו בתגובה אותות modulatory1. לפיכך, בחינת תפקוד סינפטית היה מוקד מרכזי של חקר המוח. אלקטרופיזיולוגיה מלחציים תיקון כל תא הוא טכניקה תכליתי המאפשר לנו להבין, על-ידי להמציא עיצובים מוטוריים וניתוחים נתונים, מעמיק מנגנונים biophysical ומולקולרית של ההעברה הסינאפסית. בגישה נפוץ, אולי בשל הפשטות של טכניקה, קונספט, הוא המדד של זרמי postsynaptic סינאפסות מעכבות מיניאטורי (בי / IPSCs) תחת המתח תהדק את תצורת2,3, 4 ,....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניסויים בבעלי חיים כל המאושרים על ידי ועדת אכפת של מאוניברסיטת מערב אונטריו לפי המועצה הקנדית על הנחיות טיפול בעלי חיים (AUP #2014-031) של בעלי חיים.

1. פתרונות

  1. פתרון עם פרוסות
    1. עיין טבלה 1 לקבלת ההרכב של הפתרון עם פרוסות.
    2. להכין פתרון מניות 20 x מראש ואחסן אותו ב 4 ° C עד כחודש.
    3. 1 x עם פרוסות הפתרון, להמיס3NaHCO, גלוקוז, סוכרוז ddH2O, והוסף את המניה 20 x. להבטיח osmolarity בין mOsm 315-320 ולאחסן את הפתרון עבור לא יותר משבוע 1-4 מעלות צלזיוס.
    4. למלא שני בקבוקונים עם 100 מ של בציעת פתרון, לכסות אותם עם מצלמות-מיקרוסקופים. מקררים את הפתר....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול הנ ל מתאר שיטה באמצעות תיקון שלם-תא קלאמפ אלקטרופיזיולוגיה לבחון את מידת הריבוי סינפטית, נוירונים היפותלמי העכבר כדוגמא. טכניקה זו הכנה פרוסה אמור להניב התאים קיימא בריא זה לא יש ממברנה נפוחות או גרעין (איור 1). כל שלב בפרוטוקול זה חשוב לבריאות של רקמות, איכות ההקלטות.

figure-results-1
איור 1: רקמה בריאה, לא בריא הבאים לחתוך הכנ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דרישה חשובה אחת עבור ניסוי אלקטרופיזיולוגיה מלחציים תיקון מוצלח הוא קבלת פרוסות/תאים בריאים. הפרוטוקול המתואר שלנו ממוטב היפותלמי פרוסות המכילות PVN נוירונים. אחרים במוח אזורים עשויים לדרוש ששינה פתרונות, עם פרוסות שיטות21,22,23,24. עבור ההקלטה, זה קריטי לקבל הקלטות יציב רק על ידי וניטור שוטף מאפייני תא כגון התנגדות הממברנה, התנגדות קיבול וגישה. עלייה הגישה התנגדות ניתן להקטין EPSC משרעת, לכן ו.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

י. ס קיבל מלגה לתואר שני אונטריו. W.I. קיבל מלגת חוקר חדש למחקר בריאות הנפש קנדה. עבודה זו נתמכת על ידי ההפעלה מענקים כדי W.I של מדעי הטבע, הנדסה מחקר המועצה של קנדה (06106-2015 RGPIN) ומכון קנדי למחקר בריאות (PJT 148707).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
מזרק BD 1 מ"ל309659
10 להביםפישר סיינטיפיק/אחרים35698
22 להבVWR/אחרים21909-626
22 μ מסנני מזרקM Milipore09-719-000
Adson forecepsHarvard Instruments72-8547
מספריים חדים בזוויתמכשירי הרווארד72-8437
Clampexמכשירים מולקולרייםpClamp 10
להב קצה כפולVWR74-0002
נייר סינוןסיגמא/אחרים1001090
מברשת צבע עדינהפישר / שונים15-183-35 /
VWRLG-8680-120
IsofluraneFresenius Kabi / אחריםM60303
Krazy
מיני ניתוחSynaptosoftMiniAnalysis 6
OsmomoterWescor Incדגם 5600
ParafilmSigmaPM-996
פיפטה פסטרVWR14672-200
מד phמטלר טולדוFE20-ATC
נורת גומיVWR82024-550
ידית אזמל מס' 3מכשירי הרווארד72-8350
ידית אזמל מס' 4מכשירי הרווארד72-8356
להב קצה יחידVWR55411-050
פורס ויברטוםLeicaVT1200S
מערכת טיהור מיםMilliporeMilli-Q אקדמי A10
מכסה צלחתבאר פישר/שונים07-201-590/שונים
<חזקים>כימיקלים/ריאגנטים
4-APSigma275875
BAPTAבדיקות מולקולריותB1204
CaCl2*2H2OSigmaC7902
CdCl2sigma202908
DNQXTocris189
EGTASigmaE3889
גלוקוזSigmaG5767
HEPESSigmaH3375
K2-ATPSigmaA8937
KClSigmaP9333
K-gluconateSigmaG4500
MgCl2*6H2OSigmaM2670
כיתה ביולוגיה מולקולרית מיםסיגמאW4502-1L
Na3GTPSigmaG8877
NaClBioshopSOD001.1
Na-gluconateSigmaS2054
NaH2PO4Sigma71504
NaHCO3SigmaS6014
PicrotoxinsigmaP1675
SrClSigma255521
סוכרוזBioshopSUC507.1
TTXAlamone LabsT-550
yDGGTocris6729-55-1
צינור פיזור גז שונים דבק שונים

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Abbott, L. F., Nelson, S. B. Synaptic plasticity: taming the beast. Nature Neuroscience. 3 (Supp), 1178-1183 (2000).
  2. Hsia, A. Y., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Development of Excitatory Circuitry in the Hippocampus. Journal of Neurophysiology. 79 (4), 2013-2024 (1998).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Synaptic MultiplicityWhole cell Patch clampSpontaneous EPSCsMiniature EPSCsAction Potential dependent ReleaseTTX Cadmium BlockadeStrontium ACSF ApplicationGamma DGG Antagonist TestAfferent Stimulation ProtocolAccess Resistance Monitoring

Related Articles