מאמר שיטה

וירוטסט, נקודת שימוש לאיתור וירוסים בדגימות מים

DOI:

10.3791/59463

⸱

11 במאי 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Viruses Contaminants of Water and Food (VIRCONT), Department of Genetics, Microbiology and Statistics, Section of Microbiology, Virology and Biotechnology, University of Barcelona, 2Grupo de Investigación Biodiversidad, Medio Ambiente y Salud (BIOMAS), Facultad de Ingenierías y Ciencias Agropecuarias (FICA), Ingeniería en Biotecnología, Universidad de las Américas, 3Municipal Laboratory - Waters of Mataró, 4GenIUL

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מציגים את VirWaTest, המהווה שיטה פשוטה, במחיר סביר ונייד לריכוז ואיתור של וירוסים מדגימות המים בנקודת השימוש.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

וירוסים מופרשים על ידי בני אדם ובעלי חיים עלולים לזהם מקורות מים ולהוות סיכון לבריאות האדם כאשר מים זה משמש לשתייה, השקיה במזון, כביסה, וכו '. מחוון חיידקים בצואה קלאסית לא תמיד לבדוק את הנוכחות של פתוגנים ויראלי כך גילוי פתוגנים נגיפי אינדיקטורים נגיפי הוא רלוונטי כדי לאמץ מדדים של הקלה בסיכון, במיוחד בתרחישים הומניטאריים ובתחומים שבו התפרצויות ויראליות המועברות במים תכופים.

כיום, מספר בדיקות מסחריות המאפשרות כימות של חיידקים אינדיקטור צואה (פרפור) זמינים לבדיקה בנקודת השימוש. עם זאת, בדיקות מסחריות כאלה אינן זמינות לאיתור וירוסים. איתור וירוסים בדגימות מים סביבתיים דורש ריכוז של כמה ליטרים לתוך כרכים קטנים יותר. יתר על כן, לאחר מרוכז, זיהוי של וירוסים מסתמך על שיטות כגון הפקת חומצת גרעין וזיהוי מולקולרי (למשל, תגובת שרשרת פולימראז [PCR] מבוסס assays) של genomes ויראלי.

השיטה המתוארת כאן מאפשרת ריכוז של וירוסים מ 10 דגימות מים L, כמו גם את החילוץ של חומצות גרעין נגיפי בנקודת השימוש, עם ציוד פשוט ונייד. זה מאפשר בדיקות של דגימות מים בנקודת השימוש עבור מספר וירוסים והוא שימושי בתרחישים הומניטאריים, כמו גם בכל הקשר שבו מעבדה מצויד אינה זמינה. לחילופין, השיטה מאפשרת התמקדות בווירוסים המצויים בדגימות מים והובלת הריכוז למעבדה בטמפרטורת החדר לצורך ניתוח נוסף.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במהלך השלבים הראשונים של החירום ההומניטרי, גישה לאספקת מים נקיים, תברואה והיגיינה הם קריטיים להישרדות של אלה המושפעים. לכן, הניטור איכות המים הוא בעדיפות כדי למנוע התפרצויות המועברות במים. זה ידוע כי מים מזוהמים הוא לעתים קרובות מקור המחלות, אבל לעתים קרובות קשה לקבוע את המקורות של התפרצויות ויראלי כגון וירוס הפטיטיס (הכבד), אפילו עם זמינות של שיטות מעבדה קונבנציונאלי. השליטה על איכות המים מבוססת על כימות השקר1,2,3,4. עם זאת, הוא תועד בהרחבה כי אין מתאם בין העדר פרפור ונוכחות של פתוגנים מים ויראלי כגון רוטוירוס (רוב), norovirus (NoV), או מת5,6. לכן, שימוש בקריטריון איכות המים המבוססת על פרפור עלול לגרום להערכת הסיכונים הקשורים לנוכחות של פתוגנים ויראלי מים. מעקב אחר וירוסי מחוון, כגון אדנוירוסים אנושיים (hadv), או פתוגנים ספציפיים יהיה מועיל להגדיר את החשיפה לפתוגנים נגיפי וזיהוי המקור הפוטנציאלי של זיהום אנושי7,8, 9,10 ובאימות היעילות. של אמצעי התברואה11

עד עכשיו, גילוי של וירוסים בתרחישים אלה הסתמך על צוות מיומן ולוגיסטיקה מורכבת. VirWaTest (virwatest.org) מיועדת לפיתוח של שיטה פשוטה, במחיר נוח ונייד לריכוז ואיתור בעקבות וירוסים מדגימות המים בנקודת השימוש.

הריכוז וירוס מבוסס על העיקרון של לוקליזציה אורגנית של 10 L דגימות מים, אשר וירוסים משוחזרים בכרכים קטנים יותר12,13. Flocs נאספים והוסיף מאגר כי lyses וירוסים ומונע את חומצות גרעין מן השפלה כאשר הם מאוחסנים בטמפרטורת החדר עבור לא יותר מ 2 שבועות.

שיטת החילוץ חומצת גרעין מבוססת על השימוש חלקיקים מגנטיים שאליהם חומצות גרעין לקבל adsorbed. הם יכולים להיות מועברים ממאגר כביסה אחד למשנהו ולבסוף לתוך מאגר להתחמק על ידי שימוש בצנרת מגנטית אשר החלקיקים לצרף. נגיפי חומצות גרעין ויראלי שהושגו ניתן לשלוח למעבדת התייחסות שבה ניתן לבצע איתור באמצעות שיטות מולקולריות המבוססות על ה-PCR. עבור כל הפקת חומצת גרעין, שתי כמויות שונות נבדקו כדי לשלול עיכוב אנזימטי מקורו על ידי המדגם. לחילופין, עם זמינות מינימלית לציוד, ניתן להפעיל בדיקות PCR בנקודת השימוש. התהליך כולו נועד להתבצע באופן עצמאי מספק כוח (איור 1).

שיטת ה-PCR הכמותית לזיהוי האדב, המופרשת על-ידי בני אדם ונמצאה בדגימות שפכים בריכוזים גבוהים, הותאמה להפעלה בנקודת השימוש. HAdV משמשות כאינדיקטורים ויראליים אנושיים. ה-PCR לקוונפיקציה של MS2 בקטביאג כבר הותאם מאז MS2 משמש ב-VirWaTest כבקרת תהליך. ניתן להתאים אישית את השיטה לאיתור כל וירוס מעניין.

לאחר פיתוח, השיטה VirWaTest הוחלה על ידי המשתמשים בשתי הגדרות שונות ברפובליקת מרכז אפריקה (RCA) ואקוודור, מתן משוב על יישום הפרוטוקול במצבים אמיתיים.

לידיעתך, זהו הנוהל הראשון המאפשר ריכוז ואיתור של וירוסים בנקודת השימוש, ללא תלות בכל ספק כוח, ציוד גדול, ותנאי הקפאה/קירור. מומלץ לאסוף שתי משכפל של כל דגימת מים כדי להשיג תוצאות חזקות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנה ואריזה

הערה: החומרים/ציוד שיש לארוז מפורטים בטבלה 1. השתמש בכפפות כדי לטפל הריאגנטים הנדרש לבקרת התהליך, ריאגנטים ריכוז, חומצות גרעין החילוץ ריאגנטים וריאגנטים לזיהוי. ללבוש משקפיים הגנה כדי להתמודד עם ריאגנטים הדרושים לחילוץ חומצת גרעין.

  1. בקרת תהליכים
    1. הכנת MS2 בקטייפרג'ה תרבות המניה (אמריקאי סוג אוסף התרבות [ATCC] 15597-B1) המכיל 1 x 1010 Pfu/mL במעבדה על ידי ביצוע הליך ISO 10705-1:199514.
    2. אז, סדרת מחלקים 10 μl של ההשעיה לכל צינור המכיל 1 x 108 pfu לתוך 10 מ"ל צינורות ולתת המים להתאדות ב 37 ° c. השתמש בשפופרת אחת לכל אחת מדגימות המים.
    3. בנוסף, הכינו צינור אחד המכיל 10 מ ל של מים מזוקקים סטרילי לכל מדגם שנאסף.
  2. ריאגנטים לריכוז
    1. לקבלת תמיסת חלב (PSM), השתמש בסכומים הבאים כדי לרכז דגימות מים של 5 10 L.
      1. הכינו צינורית פלסטיק המכילה 5 גר' חלב.
      2. להכין שקית פלסטיק רוכסן המכיל 16.66 גרם של מלחי ים.
      3. הכינו בקבוק פלסטיק המכיל 500 מ ל של מים מזוקקים.
    2. הכן את הריאגנטים הנדרש להתאמת pH. השתמש בסכומים הבאים כדי לכוונן את ה-pH של PSM ו-5 10 דגימות מים L.
      1. מוסיפים 5 גר' חומצת לימון 1-מימה לצינור פלסטיק של 10 מ ל.
        התראה: חומצת לימון גורמת לגירוי רציני כשמדובר במגע עם העיניים. אם זה קורה, לשטוף את העין בזהירות עם מים במשך כמה דקות. אם הגירוי נמשך, מבקשים ייעוץ רפואי.
      2. שים 2 גרם של נתרן הידרוקסיד לתוך צינור פלסטיק 10 mL.
        התראה: הידרוקסיד הנתרן עלולה לגרום לכוויות עור חמורות ולנזק לעיניים. . אם בלע, שטוף את הפה אל תגרום להקאה. אם זה בא במגע עם העיניים, לשטוף בזהירות עם מים במשך כמה דקות. . אז, תבקש עצה רפואית
      3. שים 25 מ ל של מים מזוקקים סטרילי לתוך מיכל פלסטיק.
      4. שים 50 מ ל של מים מזוקקים סטרילי לתוך מיכל פלסטיק.
    3. הכינו את מיזוג המדגם המשמש להכנת החיסונים, פתרון השימור המשמש לשמירה על חומצות הגרעין, ולנטרול המים והחומרים הנמחקים. השתמש בסכומים הבאים עבור כל אחד 10 לדגום את המים כדי להיבדק.
      1. שים 15 גרם של מלחי ים ו 8 גר' חומצת לימון 1-מימה לתוך שקית פלסטיק רוכסן עבור התניה sachet.
      2. הוסף 2 מ ל של מאגר הליזה (טבלה של חומרים) ו 0.3 mL של חומצות גרעין שמירה על הסוכן (לוח חומרים) כדי צינור 5 מ ל.
        התראה: מאגר הליזה מכיל guanidine thiocyanate ו טריטון X-100. מגע עם חומצה משחררת גז רעיל, והוא מזיק אם בלע, שואף, או מגיע במגע עם העור. . אם בלע, שטוף את הפה אל תגרום להקאה. אם זה בא במגע עם העור, לשטוף עם הרבה מים. . אז, תבקש עצה רפואית חומצות גרעין שימור הסוכן גורם לגירוי בעור ובעיניים והוא מזיק אם בלע. אם זה בא במגע עם העור או העיניים, לשטוף עם מים שופע במשך כמה דקות. בכל מקרה, במיוחד אם בלע ותרגיש ברע, בקש עצה רפואית.
      3. לשים 40 גרם של אבקת כביסה לתוך ארבעה שקיות פלסטיק רוכסן.
        התראה: אבקת כביסה גורמת לגירוי בעיניים. אם זה בא במגע עם העיניים, לשטוף עם מים שופע במשך כמה דקות. אם הגירוי נמשך או אם בלע, בקש עצה רפואית.
  3. חומצת גרעין ריאגנטים לחילוץ
    1. שים 50 μL של חלקיקים מגנטיים (טבלת חומרים) ו-1 מ ל של אתנול 96% לתוך צינור 5 מ ל המהווים את מאגר הכריכה.
      התראה: מאגר החלקיקים המגנטיים מכיל נתרן עזידה, היוצר גז רעיל כאשר הוא מגיע במגע עם חומצות או יונים ממתכת כבדות, והוא רעיל אם הוא בובלע או כאשר הוא מגיע במגע עם העור. אם הוא בלע או במגע עם העור, לשטוף את הפה או את העור עם מים שופע ולבקש ייעוץ רפואי. אתנול הוא נוזל דליק מאוד אדים וגורם לגירוי בעיניים רציניות. להתרחק חום, משטחים חמים, ניצוצות, וכל מקור ההצתה אחר. אם זה בא במגע עם העור או העיניים, לשטוף עם מים שופע. במקרה של בליעה של כמויות גדולות של מים ו/או אם שאפה, צא החוצה אל האוויר הצח. . בכל מקרה, בקש עצה רפואית
    2. הוסף 500 μL, 600 μL, ו 200 μL של מאגרי כביסה 1, 2, ו-3, בהתאמה (טבלה של חומרים), עד שלושה 2 שפופרות mL.
      התראה: מאגרי כביסה מכילים את הגואנידיניום ואת הגואנידיניום וכלוריד, הפוגעים בשאיפה או בבליעה ובגירוי העור והעיניים. קשר עם חומצות משחרר גז רעיל מאוד. אם הם באים במגע עם העור או העיניים, לשטוף עם מים שופע. אם בלע, שטוף את הפה במים שופע. אל תגרום להקאה. . תמיד תבקש עצה רפואית
    3. הוסף 120 μL של מאגר הימנעות (טבלת חומרים) לצינור 0.5 mL.
  4. האדב ו MS2 לזיהוי ריאגנטים
    הערה: שני תגובות שונות להפקת חומצות גרעין ניתן לנתח בו זמנית בכל שיטת ה-PCR אם נעשה שימוש ב-8-היטב תרמוטרטרנר. עבור כל ה-PCR, להכין ביולוגיה מולקולרית מים מצוטט לתוך צינורות 1.5 mL.
    1. זיהוי HAdV
      1. להכין שילוב המכיל 10 μL של 22.5 μM-AdF לפנים, 10 μL של 22.5 μM לאחור פריימר, ו 5 μL של 11.25 μM AdP לווין (שולחן 2).
      2. הוסף 2.5 μL של המיקס לצינורות 1 עד 8 של רצועת צינור. תנו לו להתייבש בטמפרטורת החדר, סגרו את הצינורות ושמרו אותם מוגנים מהאור.
      3. חותכים את הרצועה חלוקת אותו לשתי רצועות: צינורות 1-5 וצינורות 6-8.
      4. הכינו דילול סדרתי של שתלים לדנ א המכילים את הרצף של הנוקלאוטיד של האזור הוגבר. אוויר יבש 1 μL של מתלים המכילים 1 x 105, 1 x 107, ו 1 x 109 GC/mL לתוך צינורות 6-8.
        הערה: שמרו את הצינורות המכילים את התחל, הגשוש, ואת השעיות האוויר היבשות מוגנות מהאור.
    2. זיהוי MS2
      1. להכין שילוב המכיל 10 μL של 25 μM פפסון-2F קדימה, 10 μL של 25 μM-2F פריימר הפוכה, ו 2.5 μL של 25 μM-2 בדיקה (שולחן 2).
      2. הוסף 2.25 μL של המיקס לצינורות 1 עד 8 של רצועת צינור. תנו לו להתייבש בטמפרטורת החדר, סגרו את הצינורות ושמרו אותם מוגנים מהאור.
      3. חותכים את הרצועה חלוקת אותו לשתי רצועות: צינורות 1-5 וצינורות 6-8.
      4. המשך כמו בשלב 1.4.1.4 אך השתמש בהשעיה סטנדרטית המיועדת ל-MS2 במקום זאת.

2. ריכוז נגיפי

הערה: השתמש בכפפות בכל עת במהלך איסוף המדגם, הכנה מגיב, לוקליזציה, איסוף והליכי סילוק פסולת. להרכיב משקפיים הגנה במהלך תהליך ההכנה הכימית.

  1. אוסף דוגמאות
    1. לאסוף 10 לדגום מים בדלי שטוח בתחתית עם מכסה. לאסוף מינימום של שתי משכפל עבור כל דוגמה.
      הערה: חשוב להשתמש בדליים ברורים כדי להמחיש את הגלולה. אם דגימת המים מכילה חומר מושעה (למשל, חול, אצות), תנו לו לשקע ולאחר מכן אספו את המים על גבי דלי חדש.
    2. רשום את אמצעי האחסון שנאסף, כמו גם את המיקום ואת תאריך הגבייה, עבור כל דגימת מים.
    3. שים מערבב מגנטי מחובר לסוללה תחת תמיכה דלי ולמקם את הדלי המכיל את דגימת המים על התמיכה שלה.
      הערה: חפשו משטח שטוח במקום טרי ושמרו את הדליים המכילים את דגימות המים מאור השמש הישיר.
  2. הכנה לריאגנטים
    1. ריאגנטים להתאמת pH
      1. יוצקים את אבקת חומצת לימון ואת כדורי נתרן הידרוקסיד לתוך הסירים המכילים 25 ו 50 mL של מים מזוקקים, בהתאמה.
      2. בעדינות ללחוץ ביד עד חומצת לימון הידרוקסיד הנתרן הם התפרקה לחלוטין.
        התראה: לא לשפוך את המים על כדורי נתרן הידרוקסיד. במקום זאת, יוצקים את כדורי הנתרן הידרוקסיד מעל המים.
    2. חלב לוקלוק
      1. מניחים שק עמידה על מערבב מגנטי ויוצקים 500 mL של מים מזוקקים בו. שחרר מגנט ערבוב בתוך השקית והפעל את הטירר המגנטי.
      2. יוצקים את התוכן של מלח ים מלוחים של צינור חלב לתוך שקית העמידה ומערבבים 5 דקות במהירות בינונית כדי לפזר אותם.
      3. הוסף 3 מ ל של חומצת לימון לפתרון PSM באמצעות הפיפטה פסטר כדי לוודא pH שקרים בין 3.4 ו 3.6. למדוד את ה-pH של הפתרון PSM באמצעות רצועות מחוון pH. הוסף כמויות קטנות יותר של חומצת לימון ו נתרן הידרוקסיד כמו ה-pH מתקרב 3.5.
      4. כבו את הטירר המגנטי. וודאו שה "נראים לעין השתמש בפנס כדי לעזור לדמיין את הפלוים.
  3. לוקליזציה
    1. שחרר מגנט זע לתוך המים, הגדר את הערבוב המגנטי במהירות המירבית והפעל אותו. ודא שהמגנט הזע מתחיל להסתחרר.
    2. הוסיפו 10 מ ל של מים מזוקקים לצינור שליטה בתהליך. היפוך הצינור כמה פעמים כדי להשקות מחדש את המניה ולשפוך את הפתרון לתוך המים.
    3. יוצקים את התוכן של מיזוג לדוגמה אחד sachet לתוך המים ומערבבים עבור 5 דקות.
    4. למדוד את ה-pH של דגימת המים באמצעות רצועות מחוון pH. הוסיפו כמה טיפות של חומצת לימון או נתרן הידרוקסידי למדגם המים כדי לוודא pH שקרים בין 3.4 ו 3.6. הוסף כמויות קטנות יותר של חומצת לימון ו נתרן הידרוקסיד כמו ה-pH מתקרב 3.5.
    5. הוסף 100 mL של הפתרון PSM באמצעות מכולה 100 mL.
    6. חותם את הדלי עם המכסה, להגדיר את מערבב מגנטי במהירות מינימלית, ולהשאיר את המים ערבוב עבור 8 h.
    7. כבו את העור המגנטי והניחו למים לפחות 5 שעות כדי לאפשר לאלה להתיישב.
  4. אוסף floc
    1. בניית מערכת לשאוב מורכב מבקר פיפטה, שתי מערכות ושפופרת פלסטיק, כדי לשאוב את המים על ידי מי שיורה את המים על הפלוק.
      1. חברו מדבקה של 10 מ ל. לבקר הפיפטה אז, חברו את קצה הפיפטה. לצינור הפלסטיק
      2. הסירו את הפילטר מהפיפטה הפתוח של 10 מ"ל בעזרת מלקחיים וחברו את הפיפטה לצינור הפלסטיק.
    2. מניחים דלי ריק על הרצפה.
    3. הישאב את קצה הפיפטה הפתוח במים. הקפידו לשמור אותו קרוב למשטח המים כדי להימנע מהפרעה לגבי הפלוק. עד שהוא מגיע לפיפטה. שבקצה הקלטת
    4. צבוט את צינור הפלסטיק בסוף מוצמד לצינור הטייפ ולנתק אותו מן הפיפטה.
    5. מניחים את הצינור בתוך דלי ריק. שחררו את הלחץ על הצינורית כדי לאפשר למים לזרום לתוך הדלי הריק.
    6. לצבוט את צינור הפלסטיק כדי לעצור את זרימת המים כאשר רמת המים עומדת להגיע מגנט ערבוב ולהזיז את הצינורות הרחק מהדלי.
    7. לנער את הדלי כדי להשעות את flocs ולמזוג אותם לתוך שקית פלסטיק בעמידה 500 mL. הרשו לג להסתפק. בעוד 1 שעות
    8. בזהירות להשקות את supernatant מים באמצעות פיפטה 50 mL ובקר הצינורות הידני, הימנעות הפרעה flocs.
    9. מתיף את הפלוק באמצעות פיפטה 100 mL ומעבירים אותם לצינור הצנטריפוגה של הרכבת 50 התחתית. הערה למטה את הנפח הסופי של להתמקד לדגום ולהעביר 1 מ ל של אותו לצינור 5 מ ל המכיל את פתרון שימור, באמצעות הפיפטה פסטר.
      הערה: חשוב שצינור הצנטריפוגה יהיה בוגר ולכן הנפח הסופי של המדגם המרוכז ניתן למדידה באופן מדויק ככל האפשר ורשום.
    10. בצע את החילוץ חומצת גרעין בשדה. לחילופין, אחסן את פתרון החומר השמר המכיל את הווירוסים ב-20-30 ° צ' עד 15 יום או שלח אותם למעבדת התייחסות לניתוח נוסף.
  5. סילוק פסולת ושימוש חוזר בחומרים
    1. להוסיף את התוכן של הסוכן נטרול sachet אל הדלי המכיל את המים שנמחקו. ערבב את המים, ואז, להשאיר אותו עדיין 30 דקות.
    2. היפטר מהמים המתייחסים כפסולת כללית.
    3. מניחים את הפיפטות ואת צינור הפלסטיק בתוך הדלי. ממלאים את הדלי במים ויוצקים בתוכן של סוכן נטרול אחד.
    4. לשטוף אותם לפחות 30 דקות כדי לעקר אותם ולשטוף אותם עם שופע מים נקיים כדי להסיר כל סוכן נטרול שנותר.

3. הפקת חומצת גרעין

הערה: כפפות להשתמש תמיד ללבוש משקפיים הגנה במהלך הליך החילוץ חומצות גרעין.

  1. מבצע פיפטה מגנטי
    1. . לפני ביצוע החילוץ
  2. חומצת גרעין מיצוי
    1. סדר את הצינורות המכילים את הריאגנטים הנדרש לחילוץ בארון תקשורת, משמאל לימין: מאגר מחייב, מאגרי כביסה ומאגר הימנעות. הגדר את המספר המתאים של צינורות בהתאם למספר הדגימות או הכפלת המנותח.
    2. העברה 1 מ ל של מדגם להתרכז הצינור המכיל את מאגר הכריכה, באמצעות מנקז חד פעמי פסטר. היפוך הצינור 8x כדי 10x כדי המגון את הפתרון.
    3. דגירה את הפתרון בטמפרטורת החדר עבור 10 דקות בזמן ערבוב ברציפות, או באמצעות מסלולית סולארית או ידני.
    4. לאסוף את החלקיקים המגנטיים באמצעות הצנרת המגנטית וטיפ נקי, אשר ניתן להשתמש בהם עבור שלושה מאגרי כביסה.
    5. שחררו את החלקיקים המגנטיים לתוך הצינור המכיל 500 μL של מאגר כביסה 1. לשטוף אותם על ידי לטלטל בעדינות את הפתרון עם העצה עבור 30 s ולאסוף אותם.
    6. העבר את החלקיקים המגנטיים לצינור המכיל 600 μL של מאגר כביסה 2. לשטוף אותם על ידי לטלטל בעדינות את הפתרון עם העצה עבור 30 s ולאסוף אותם.
    7. העבר את החלקיקים המגנטיים לצינור המכיל 200 μL של מאגר כביסה 3. לשטוף אותם על ידי לטלטל בעדינות את הפתרון עם העצה עבור 30 s ולאסוף אותם.
    8. שחררו את החלקיקים המגנטיים לתוך הצינורית המכילה את מאגר האלוטור ולהשליך את הקצה.
    9. דגירה את הפתרון בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות ברציפות ערבוב, באמצעות מסלולית מופעל סולארית.
      הערה: ערבוב החלקיקים המגנטיים במאגר האלוליטור הוא צעד מכריע. במקרה של חוסר מסלולית, ברציפות לערבב ידי יד בזמן הדגירה.
    10. להחליף את הקצה על הצנרת המגנטית על ידי אחד חדש לאסוף את החלקיקים המגנטיים ממאגר להתחמק. הקפד להסיר לחלוטין את החלקיקים המגנטיים מתוך מאגר להתחמק מאז הם יכולים להפריע לשיטות זיהוי מולקולרי.
    11. מחק את העצה כאשר החלקיקים מחוברים אליו. המשך בניתוח ה-PCR, העבר את מאגר המידע למעבדת התייחסות, או אחסן את מאגר האלוטור ב-4 ° צ' לצורך ניתוח נוסף.

4. גילוי נגיפי עם מופעל סוללה שמונה שפופרת בזמן אמת התראטרי תרמי

הערה: כפפות להשתמש תמיד ללבוש משקפיים הגנה במהלך ההליך זיהוי חומצות גרעין. החליפו את הכפפות לחדשים בעת ביצוע ניסוי PCR חדש כדי להימנע מזיהום צולב.

  1. ה-PCR הכמותי
    1. הוסף 14 μL של nuclease-מים ללא צינורות 2, 4, ו 5.
    2. הוסף 4 μL של תערובת PCR לצינורות 1-5.
    3. הוסף 14 μL של החילוץ חומצות גרעין ממדגם A לצינור 1 ו -14 μL ממדגם B לצינור 3.
    4. הוסף 2 μL של חומצות גרעין שחולצו ממדגם A לצינור 2 ו 2 μL ממדגם B לצינור 4. סגור את הרצועה החמש-שפופרת.
    5. הוסף 14 μL של nuclease-מים ללא צינורות 6, 7, ו 8.
    6. הוסף 4 μL של תערובת זו לצינורות 6, 7, ו-8, וסגור אותם.
    7. שים את שתי הרצועות בתוך הציקלטרנר ובחר את ההפעלה המתאימה (שולחן 3).
    8. להשליך את צינור המים ולשמור את חומצת הגרעין שחולצו במקפיא, אם אפשרי, או, אם לא, במקום טרי מוגן מפני אור במקרה בדיקה שנייה צריך להתבצע.
    9. נקה את המיקרופיפטות, את הארון, את חומר העבודה, ואת כל החומר כראוי עם מנקה חומצות גרעין, ולהשליך את שקית ניילון המכיל את הקצה המשמש, כפפות, וצינורות.
      התראה: חומצות גרעין אקולוגי הוא נוזל דליק מאוד קיטור. אל תנשמו בערפל התרסיס והימנעו ממגע עם הנוזל בעיניים או בעור. אחרת, מיד לשטוף עם מים שופע ולבקש ייעוץ רפואי.
    10. לאסוף את התוצאות ולנתח את הנתונים שהתקבלו.
  2. MS2-PCR כמותי
    1. הוסף 14 μL של nuclease-מים ללא צינורות 2, 4, ו 5.
    2. הוסף 4 μL של שילוב ה-PCR ו-0.5 μL הפוך האנזים היפוך הטרנסקריפטאז לצינורות 1-5.
    3. הוסף 14 μL של החילוץ חומצות גרעין ממדגם A לצינור 1 ו -14 μL ממדגם B לצינור 3.
    4. הוסף 1 μL של חומצות גרעין שחולצו ממדגם A לצינור 2 ו-1 μL ממדגם B לצינור 4. סגור את הרצועה החמש-שפופרת.
    5. הוסף 15.5 μL של nuclease-מים חינם צינורות 5, 6, 7, ו 8, ולסגור אותם.
    6. הוסף 4 μL של שילוב ה-PCR ו-0.5 μL של אנזים היפוך הטרנססקריפט לצינורות 6, 7 ו -8.
    7. שים את שתי הרצועות בתוך הציקלטרנר ובחר את ההפעלה המתאימה (שולחן 3).
    8. המשך כמתואר בשלבים 4.1.8 to 4.1.10.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פיתוח שיטות

הליך זה פותח במעבדה של וירוסים מזהמים של מים ומזון עם שיתוף הפעולה של המלון. הוא כולל שלושה צעדים שונים. הראשון, ריכוז החלקיקים הנגיפי, הוא עיבוד של שיטת החלב המגנב שתוארה קודם לכן12,17,18. השיטה המקורית שונתה כדי להיות בלתי תלויה באספקת חשמל, פשוטה יותר וללא שלבים צנטריפוגה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיטה VirWaTest מאפשרת ריכוז של וירוסים וחומצות גרעין החילוץ מדגימות מים בנקודת השימוש על ידי משתמשים לא מנוסים. זהו פרוטוקול זול, מהיר ופשוט. הריכוז מבוסס על העיקרון של החיסון האורגני באמצעות חלב, שדרכו מצבם של ה-pH הנמוכים והמוליכות הגבוהה הופכים את חלבוני החלב הניגנב לתוך הרמה הנמוכה ביותר של וירוסים ספוח. כאשר המשקע משקע, קל לאסוף אותם, מה שמאפשר להתרכז 10 L של מים, ואילו הקשר המסורתי מסורתי לא יכול להתמודד עם כמויות גדולות של מים.

השיטה שונתה להיות מעשית בנקודת הדגימה מבלי להשתמש בציוד חש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

וירוטסט היה פרויקט מחקר במימון תוכנית HIF (קרנות חדשנות הומניטארית) של ELHRA (שיפור הלמידה & מחקר לסיוע הומניטארי). המחברים מכירים בצוותי השטיפה שיתפו פעולה באדיבות במחקר זה. הניתוח של דגימות באקוודור המומן על ידי אוקספם אקוודור והבימוי הטוב ביותר באוניברסיטה דה לאס אמריקאס (AMB). BRT. 17.01). S. Bofill-Mas הוא בחור סרה-צייד באוניברסיטת ברצלונה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (ROX)Solis BioDyne08-14-00001כולל 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus של Solis Biodyne (תערובת qPCR), 50 תגובות
8 רצועות מיקרו-צינורות עם כובעיםdD Biolab840637פרופיל נמוך, קירות דקים, מותאמים לסוללות PCR כמותיות ואיכותיות
ומתאמי מתח לבוחש מגנטיGenIUL900011674כולל מתח לרכב 12V מתאם
תמיכת דליGenIUL900011648תמיכת אלומיניום
, 10 ליטרCater4You10LTRפוליפרופילן, עמיד בפני חבלה,
צינור צנטריפוגה בצבע שקוף, 50 מ"לLabBoxCTSP-E50-050פוליפרופילן, סטרילי, בוגר, עם חצאית
חומצת לימון 1-הידרט, 500 גרםPanReac AppliChem1410181211טהור, דרגת פארמה, 1 קילוגרם
בקבוק PET שקוףLabBoxFPET-500-088צבע שקוף, PET, פקק אינו כלול
חלב רזה Difco, 500 גרםBecton Dickinson232100מגן
DNA/RNA מיובש, 250 מ"לZymo ResearchR1100-250מדיום שימור DNA/RNA, 250 מ"ל
בקר פיפטה Easy9 LabBoxEAS9-001-0010.3 μ מסנן m, פיפטות מ-0.1 עד 100 מ"ל, מחזיק פיפטה סיליקון הניתן לחיטוי
צינור אפנדורף, 0.5 מ"לאפנדורף0030121023פוליפרופילן,
צינור אפנדורף נעילה בטוחה, 2 מ"לאפנדורף0030120094 פוליפרופילן,
צינור אפנדורף נעילה בטוחה, 5 מ"לdD Biolab999542פוליפרופילן, סטרילי,
אתנול מדורג 96% V/V, 1 ליטרPanreac AppliChem361085-1611UV, IR  ו-HPLC
LabBoxFORS-007-002קצה דק, מעוקל, L= 120 מ"מ
מערבל מגנטיGenIUL900017000מופעל על ידי סוללה
dD Biolab929203שחור, קצה עדין במיוחד, עמיד במים, ייבוש מהיר, לפלסטיק וכלי זכוכית
מיקרו רוטה-מתלה למיקרו-צינורותdD Biolab377824 מודולים, אורך x רוחב x גובה = 208 x 100 x 100 מ"מ
Mini8 PCR בזמן אמת CyclerCoyote Biosciences, סיןMini-8נייד, עובד עם ספקי כוח 12V או סוללות חיצוניות, שני ערוצים, קיבולת ל-8 צינורות
NucliSens Lysis BufferBiomerieux200292 ריאגנטים לעד 48 בידודים, אחסן בטמפרטורת הסביבה
פיפטה סרולוגית עם קצה פתוח, 10 מ"לDeltalab900136Nסטרילי, עטוף בנפרד (נייר / פלסטיק)
מכסה בורג PE PP28LabBoxTP28-004-020לבקבוקי PET
רצועת מחוון pHLabBoxWSPH-001-001טווח pH 2.8 עד pH 4.4, 50 רצועות לחבילה
מבחנה מפלסטיקQuimikals300913כולל מכסה
פוליאתילן פסטר פיפטהLabBoxPIPP-003-500בוגר, 7 מ"ל נפח כולל,
בקבוק בורג פוליפרופילן לא סטרילי עם מכסה בורג,Deltalab409726סטרילי, מדורג עד 100 מ"ל
בקבוק בורג פוליפרופילן עם מכסה בורג, 60 מ"לDeltalab409526Gמכסה בורג, סטרילי, מדורג עד 50 מ"ל
אבקת אבקת חומר ניקוי-סבון אבקה רגיל לשטיפת בגדים
כבלי חשמל למערבל מגנטיGenIUL900011692 חיבור בין סוללות לבוחשים מגנטיים
QuickPick כלי מגנטיBioNobile24001כלי כף יד לחלקיקים מגנטיים
טיפים לאיסוף מהיר בקופסהBioNobile24296RNase, חיטוי, 96 יחידות
QuickPick XL gDNA חלקיקים מגנטייםBioNobileSN51100 3.2 מ"ל
מלחי יםסיגמא-אולדריץ'S9883-500Gתערובת מלח מלאכותית הדומה מאוד להרכב המלחים המומסים של מי האוקיינוס
צינורות סיליקוןLabBoxSILT-006-005גליל של 5 מטרים, פנימי  ø x חיצוני  ø= 6 x 10 מ"מ
כדורי נתרן הידרוקסיד, 98.5 - 100.5%כדורי 28244295 כימיקלים VWR, 1 ק"ג
פלטפורמה סיבובית סולאריתSOL-EXPERT Group70020צלחת אקרילית, 10 סל"ד, תומכת בעד 300 גרם
SOLIScript ערכת בדיקה חד-שלביתSolis BioDyne08-57-00250כוללת את 5x One-Step Probe Mix של Solis Biodyne (qPCR Mix) ו-40x One-Step SOLIScript Mix (אנזים טרנסקריפטאז הפוך), 250 תגובות
SPEEDTOOLS ערכת מיצוי וירוס RNABioTools21.141-4197כולל מאגר BAW של BioTools (מאגר כביסה 1), מאגר BAV3 (מאגר כביסה 2 ו-3) ומאגר BRE (מאגר
SpinBar מגנט ערבוב אוקטהדרליdD Biolab045926טבעת ציר, L x  ø = 38 x 8 מ"מ,
פיפטה סרולוגית עם קצה סרט כחול, 10 מ"לDeltalabPN10E1סטרילי, עטוף בנפרד (נייר/פלסטיק)
פיפטה סרולוגית עם קצה סרט, 50 מ"לDeltalab900043סטרילי, עטוף בנפרד (נייר/פלסטיק)
Termi-DNA-Tor - מסירחומצות גרעיןBioTools22001-4291מסיר חומצות גרעין, חיידקים, פטריות ומיקופלזמה מחומר ומשטחים, 450 מ"ל
מגיב לביולוגיה מולקולרית של מים, 1LSigma-AldrichW4502-1Lללא נוקלאז ופרוטאז, 0.1 μ m שקית
Whirl-Pak מסוננת, 540 מ"לDeltalab200361תיק רגיל תחתון יציב
LabBoxBZIP-080-100פוליאתילן, L x W = 120 x 80 מ"מ
דלי עבור פינצטה מעבדה סמן מכסה בורג 150 מ"ל, סילוק).

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. The Sphere Project. The Sphere Project: Humanitarian Charter and Minimum Standards in Humanitarian Response. , Practical Action Publishing. Rugby, UK. https://www.spherestandards.org/wp-content/uploads/2018/06/Sphere_Handbook_2011_English.pdf (2011).
  2. Bartram, J., et al. Water Safety Plan Manual:Step-by-step risk management for drinking-water suppliers. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://apps.who.int/iris/handle/10665/75141 (2009).
  3. World Health Organization. Guidelines for Drinking-water Quality. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://whqlibdoc.who.int/publications/2011/9789241548151_eng.pdf?ua=1 (2011).
  4. World Health Organization. 25 Years Progress on Sanitation and Drinking Water. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/177752/1/9789241509145_eng.pdf?ua=1 (2015).
  5. Girones, R., et al. Molecular detection of pathogens in water - The pros and cons of molecular techniques. Water Research. 44 (15), 4325-4339 (2010).
  6. Rodriguez-Manzano, J., et al. Standard and new fecal indicators and pathogens in sewage treatment plants, microbiological parameters for improving the control of reclaimed water. Water Science and Technology. 66 (12), 2517-2523 (2012).
  7. Puig, M., et al. Detection of adenoviruses and enteroviruses in polluted waters by nested PCR amplification. Applied and Environmental Microbiology. 60 (8), 2963-2970 (1994).
  8. Carter, M. J. Enterically infecting viruses: Pathogenicity, transmission and significance for food and waterborne infection. Journal of Applied Microbiology. 98 (6), 1354-1380 (2005).
  9. Bofill-Mas, S., Pina, S., Girones, R. Documenting the epidemiologic patterns of polyomaviruses in human populations by studying their presence in urban sewage. Applied and Environmental Microbiology. 66 (1), 238-245 (2000).
  10. Bofill-Mas, S., et al. Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices. Applied and Environmental Microbiology. 72 (12), 7894-7896 (2006).
  11. Rames, E., Roiko, A., Stratton, H., Macdonald, J. Technical aspects of using human adenovirus as a viral water quality indicator. Water Research. 96, 308-326 (2016).
  12. Calgua, B., et al. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. Journal of Virological Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
  13. Bofill-Mas, S., et al. Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses. Journal of Visualized Experiments. 58, 5-9 (2011).
  14. International Organization for Standardization. ISO 10705-1:1995: Water quality - Detection and enumeration of bacteriophages - Part 1: Enumeration of F-specific RNA bacteriophages. , https://www.iso.org/standard/18794.html (1995).
  15. Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report. Applied and Environmental Microbiology. 68 (9), 4523-4533 (2002).
  16. Pecson, B. M., Martin, L. V., Kohn, T. Quantitative PCR for determining the infectivity of bacteriophage MS2 upon inactivation by heat, UV-B radiation, and singlet oxygen: Advantages and limitations of an enzymatic treatment to reduce false-positive results. Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5544-5554 (2009).
  17. Calgua, B., Barardi, C. R. M., Bofill-Mas, S., Rodriguez-Manzano, J., Girones, R. Detection and quantitation of infectious human adenoviruses and JC polyomaviruses in water by immunofluorescence assay. Journal of Virological Methods. 171 (1), 1-7 (2011).
  18. Bofill-Mas, S., et al. Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses. Journal of Visualized Experiments. (58), e2820(2011).
  19. Gonzales-Gustavson, E., et al. Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa. Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

VirWaTestPCRMS2

מאמרים קשורים