הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מודל Murine מתקדם לאגודה לדלקת כבד Nonatoin עם סוכרת מסוג 2

6.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59470

⸱

26 באפריל 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Endocrinology & Metabolism Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, 2Berlin Institute of Health (BIH), 3Berlin-Brandenburg Center for Regenerative Therapies (BCRT), Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, 4DZHK (German Centre for Cardiovascular Research), 5Institute of Medical Immunology, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, 6Julius Wolff Institute (JWI) and Center for Musculoskeletal Surgery, Charité - Universitätsmedizin Berlin, Berlin, Germany, corporate member of Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

דיאטה פשוטה ואמינה המושרה בעלי חיים מכרסם מודל עבור steatohepatitis שאינם אלכוהוליים (נאש) מתואר, מושגת באמצעות דיור ללא SPF של בעלי חיים וניהול של תזונה מסוימת גבוהה שומן. אנו מתארים זיהוי של תת הכבד והאדיפוז מערכות המשנה של תאים חיסוניים כדי ללכוד את התנאים האימונולוגיים אנושיים על ידי חשיפת עכברים חיידקים סביבתיים.

תקציר

השמנת יתר קשורה לדלקת כרונית בדרגה נמוכה ועמידות לאינסולין, לתרום לשכיחות הולכת וגוברת של מחלות מטבולית כרונית, כגון סוכרת סוג 2 ו steatohepatitis שאינם אלכוהוליים (נאש). מחקרים שאירעו לאחרונה הקימה כי תאי החיסון הפרו דלקתיים לחדור יפרטרופית שמנים רקמות והכבד. בהינתן החשיבות המתעוררים של תאים חיסוניים בהקשר של הומאוסטזיס מטבולית, יש צורך קריטי לכמת ולאפיין את השינוי שלהם במהלך התפתחות של סוכרת מסוג 2 ו נאש. עם זאת, מודלים בעלי חיים היגרמו לתכונות הפתותולוגיות האופייניות של האדם נאש הם דלילים.

במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקול מפורט כדי לזהות את ערכות המשנה של תאים חיסוניים מבודדים מן הכבד ואת רקמת השומן במודל העכבר האמין של נאש, שהוקמה על ידי הדיור דיאטה גבוהה שומן (HFD) עכברים תחת לא ספציפי הפתוגן ללא מצבים (SPF) תנאים ללא מכשול למשך שבעה שבועות לפחות. אנו להדגים את הטיפול של עכברים בתנאים שאינם SPF, העיכול של רקמות וזיהוי של מקרופאגים, הרוצח הטבעי (NK) תאים, תאים דנדריטים, B ו-T קבוצות ממשנה של תאים על ידי הזרמת cy, לנסות. זרם מייצג cy, לנסות מגרשים מעכברי SPF HFD ועכברים שאינם SPF מסופקים. כדי להשיג נתונים אמינים ומתרגם, שימוש בנוגדנים, שיטות מדויקות ומדויקות לעיכול רקמות והמשך הניסויים הנכונים בזרימה cy, לנסות הם אלמנטים קריטיים.

ההתערבות כדי לשחזר את החשיפה אנטיגן פיזיולוגי בעכברים על ידי דיור אותם בתנאים שאינם SPF וחשיפה לא ספציפית אנטיגנים חיידקים יכול לספק כלי רלוונטי לחקירת הקשר בין שינויים אימונולוגיים, המושרה דיאטה השמנת יתר וסיבוכים הקשורים לטווח ארוך.

מבוא

השמנת יתר היא הפרעה רב עצרת וגורם סיכון מרכזי לפיתוח מחלות לב, שבץ, steatohepatitis שאינם אלכוהוליים (נאש), סוכרת סוג 2 (T2D) וכמה סוגים של סרטן. השכיחות של השמנת יתר הוא גדל במהירות ברחבי העולם. כיום, 2,100,000,000 אנשים – כמעט 30% מאוכלוסיית העולם-הם שמנים או שמנים1. השמנת יתר הקשורות לאינסולין יכול להוביל T2D, כאשר מותש תאי ביתא איון הלבלב לא לפצות על הצורך מוגבר לאינסולין כדי לשמור על הומאוסטזיס גלוקוז2.

רקמת אדיפוז מורכבת מסוגי תאים שונים, כולל אדיפוציטים, תאי אנדותל, פיברותקיעות ותאי החיסון. במהלך התקדמות של השמנת יתר, שינויים במספר והפעילות של תאים חיסוניים יכול להוביל דלקת בדרגה נמוכה של יפרטרופית אדיפוז3,4. באופן ספציפי, זה נמצא כי צריכת אנרגיה מוגזמת, מלווה ברמות גבוהות באופן כרוני של גלוקוז בדם, טריגליצרידים וחומצות שומן חינם, מוביל היפוקסיה adipocyte, המתח רשתית העין, לקויי תפקוד מיטוכונדריאלי ו הפרשת ציטוקין משופרת, וכתוצאה מכך הפעלת התאים החיסוניים הפרו-דלקתיים5,6. מחקר בעבר התמקד בעיקר בחסינות מולדת, אבל לאחרונה תאים חיסוניים גמישים (T ו-B תאים) התפתחה כרגולטורים חשובים של הומאוסטזיס גלוקוז. הם בעלי דלקתיות (כולל CD8+ T תאים, Th1, ו B תאים) או בעיקר פונקציות רגולטוריות (כולל הרגולציה T (treg) תאים, Th2 תאים) והוא יכול גם להחמיר או להגן מפני תנגודת לאינסולין7,8 , . בסדר, תשע

יתר על כן, מנגנונים מספר הוצעו כדי להסביר כיצד השמנת יתר מגדילה, כולל ייצור מוגבר של ציטוקינים על ידי האדיפוז רקמה10. נאש, הצורה המתקדמת של מחלת כבד שומני לא אלכוהולי ונטל בריאות מרכזי במדינות מפותחות, הוא מאופיין באופן היסטולוגית על ידי הבלון בלונים, הצטברות ליפיד, פיברוזיס ודלקת לוצלתית ועשוי להתקדם ל שחמת, בסוף מחלת כבד שלב או סרטן hepatocellular. משטר מספר (למשל מתיונין ותזונה לקויה כולין11) ידועים לגרום נאש כמו מחלות כבד במודלים בעלי חיים לא אנושיים, אבל רוב הגישות הללו לא לכידה של התנאים האנושיים של נאש ואת מטבולית תוצאות כפי שהם דורשים הסתרה גנטית ספציפית, שאינם פיזיולוגיים מניפולציות תזונתיים או חוסר עמידות לאינסולין אופייני של האדם נאש. יתר על כן, ההבנה שלנו של המנגנונים הבסיסיים של מחלות מטבולית מבוססת כיום על ניסויים שבוצעו עם עכברי מעבדה שוכנו תחת תקן הפתוגן הספציפי ללא המחלה (SPF). מתקני מכשול אלה הם היגיינה באופן חריג לא לשקול את החיידקים מגוון בני אדם צריך להיתקל, אשר עשוי להסביר את הקשיים בתהליך התרגום של מחקרי בעלי חיים לגישות קליניות12,13 , . ארבע עשרה

כדי לחקור את ערכות המשנה של התא החיסונית השונים ברקמת השומן והכבד במהלך התפתחות עמידות לאינסולין ונאש במודל עכבר מתקדם לשחזר את התנאים האימונולוגיים אנושיים, עכברים שוכנו בכלובים בודדים בחצי סטרילי תנאים ללא מחסום. עכברים שוכנו תחת התנאים נחשף אנטיגן פיתחה נאש כמו הכבד פתולוגיה כבר אחרי 15 שבועות של דיאטה גבוהה שומן (HFD) האכלה13. בהשוואה לגיל המתאים עכברי SPF הם פיתחו stevesiרומטוזיס, חדירת הכבד הפעלה של תאים חיסוניים.

כתב יד זה מתאר זרימה חזקה cy, לנסות ניתוח להגדיר ולספור את תת הקבוצות של תאים החיסונית של רקמת שומן העכבר והכבד במודל של נאש. הניתוח הסייטונסה לזרום מאפשר זיהוי של פרמטרים מרובים של תאים בודדים בו בניגוד ל-RT-PCR או גישות אימונוהיסטוכימיה.

לסיכום, המחקר שלנו מציע מודל העכבר של HFD לטווח קצר עבור חקירת התפתחות עמידות לאינסולין ו נאש ואת המנגנונים הבסיסיים המוצגים גם נאמנות למצב האנושי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

מחקר זה נעשה בהתאם למדריך לטיפול ולשימוש בבעלי חיים מעבדתיים של המוסדות הלאומיים לבריאות וחוק רווחה בעלי חיים תחת פיקוחו של הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים ושימוש. פרוטוקולי בעלי חיים נערכו על פי הנחיות אתיות מוסדיים של הCharité ברלין, גרמניה, ואושרו על-ידי מדינת לנדיסמט והגעה להנחיות הבאות.

1. דיאטה המושרה דגם בעלי חיים של Steatohepatitis

  1. העברת עכברים (C57Bl/6J, זכר) לדיור שאינו SPF בגיל 4 שבועות ולחשוף אותם ברציפות למגוון רחב של פתוגנים סביבתיים/אנטיגנים. להבטיח את החשיפה על ידי טיפול יומיומי של חיות מעבדה כמו אנטיגנים מופצים על ידי מעבר אוויר בדרך זו.
  2. לשמור על עכברים (C57Bl/6J, זכר, 12 שבועות) במערכות מערכות פתוחות עם מסננים קונבנציונליים על 12 h:12 h מחזור אור/כהה בטמפרטורה של 22 ° c. אין להקרין או לעשות כנגד דיאטה ומצעים ניסיוניים. גישה למתקן לדיור בעל חיים ללא מסכה או רשת שיער. דלתות פתוחות בין חדרי בעלי חיים. . אל תשתמש במקלחת אוויר
  3. להבטיח טיפול יומיומי של חיות מעבדה ולהחליף חדרים על בסיס קבוע כך אנטיגנים מופצים על ידי מעבר אוויר. המשלים את הדיור המלוכלך עם חשיפה יומית לא ספציפית של חיידקים לאנטיגנים מתוך מצעים של בעלי חיים מעבדתיים מהחי שוכנו בחדרים ליד עכברי המעבדה.
  4. למדוד את הפרופורציות של CD44-CD62L- אפקטור זיכרון CD4+ ו CD8+ T תאים בתוך דם וטחול באמצעות זרימה cy try (כפי שמתואר ב refefence13).
    הערה: בהקשר זה הגדירו גידול של 20% מהזיכרון CD8+ t תאים מCD8+ t כהוכחה לחשיפה מספקת של חיידקים.
  5. הפעל את HFD (60 kJ% מ-fat, 19 kJ% מחלבונים ו -21 kJ% מפחמימות וצריכת מודעות לlibitum של מים עם 6% סוכרוז תוכן עם העכברים בן חמישה שבועות C57Bl/6J גברים עבור 7-15 שבועות. HFD צריך להכיל 60% kJ משומן (כפי שמתואר לעיל) על מנת לגרום להתפתחות של עמידות לאינסולין במהלך הניסוי.
    הערה: יש לבצע את הצביעת המטאוקסילין ומאפיינים היסטלוגיים כמו בלונים, הגופים של מלורי דנק, הסתננות של תאים חיסוניים ומקרוסורומטוזיס להפגין כנגד מחלות הכבד נאש (כפי שמוצג בהתייחסות 13).

2. הכנת ריאגנטים ופתרונות

  1. הכינו 70% אתנול, מלוחים באגירה פוספט (PBS, ללא סידן ומגנזיום) שיושלם עם 0.5% BSA ו-ACK (אמוניום-כלוריד-אשלגן) מאגר לפירוק.
  2. צביעת מאגר
    1. התמוססות 10 מ ל של סרום עגל עוברי (FCS) ב 500 mL של PBS להשיג 2% FCS הPBS. מניחים מאגר הצביעת על קרח לפני השימוש.
    2. חנות פתרון בבקבוק פלסטיק ב -4 ° c.
  3. הפתרון לעיכול הרקמה האדיפוז
    1. התמוססות 2.5 g של סרום של שור (BSA) ב 500 mL של PBS כדי לקבל 0.5% BSA/PBS.
    2. התמוססות 74.5 גרם של CaCl2 ב-10 מ"ל של 0.5% bsa/PBS כדי לקבל פתרון 10 MM cacl2 .
    3. להוסיף 1 מ"ג של הקולגן הסוג השני (ראה טבלת חומרים) לכל mL של 0.5% bsa עם 10 מ"מ cacl2 PBS.
    4. הכינו 3 מ ל של התמיסה הקולגיראז של הפתרון לכל g של דגימת הרקמה האדיפוז. הכינו את התמיסה הטרייה. בשביל כל בידוד
  4. הפתרון לעיכול רקמות הכבד
    1. לפזר 2.5 g של BSA ב 500 mL של האנק ́s מאוזן תמיסת מלח (HBSS) כדי לקבל 0.5% BSA HBSS.
    2. הוסף 10 מ ל של FCS ב 500 mL של 0.5% BSA/HBSS כדי לקבל 2% FCS 0.5% BSA/HBSS.
    3. להוסיף 0.5 mg של הקולגן הסוג הרביעי (ראה טבלת חומרים) על כל mL של 2% fcs 0.5% bsa/HBSS.
    4. הוסף 0.02 מ"ג של DNase לכל mL של 2% FCS 0.5% BSA/HBSS קולגן הפתרון.
    5. הכינו 13 מ ל של התמיסה לעכל את הפתרון לכל דגימת רקמת הכבד.
    6. הכינו את התמיסה הטרייה. בשביל כל בידוד

3. הדור של תא בודד השבולים

  1. עיכול רקמת אדיפוז
    1. . ואחריו פריקה צווארי רסס את החזה עם 70% אתנול. בזהירות לעשות חתך מרכזי 5-6 ס מ דרך קיר הבטן העור לאורך כל החלק של כלוב הצלעות כדי לחשוף את חלל הלב והלב.
      הערה: אין לפגוע באיברים הבסיסיים ולשמור על מספריים מטיפים.
    2. הכנס לפחות 10 מ ל של 0.9% תמיסת מלח בקודקוד החדר השמאלי באמצעות מחט G 26.
      הערה: הפרזיה מוצלחת מצוין על ידי שטיפת הכבד.
    3. פתחו את חלל הצפק עם מספריים וחתכו את משטחי השומן הפריגונאל בכל צד עם מספריים מעוגלים עדינים. מנתחים רקמות גונאדאל עם מספריים. מעוגלים ושוקלים רקמת שומן
    4. בצעו את הדיסוציאציה המכנית באמצעות מספריים וחותכים את רקמת השומן לחתיכות משובחות בצלחת פטרי ב -4 ° c. העבר רקמת האדיפוז ל 50 mL לצינורות צנטריפוגה ולשטוף צלחת פטרי עם 1 מ ל של 0.5% BSA/PBS.
    5. הוסיפו 3 מ ל של תמיסת אדיפוז (כמוכן בשלב 2.3) לכל גרם של רקמת השומן. מודטת התמיסה ברקמת השומן ב 37 ° c עבור 20 דקות תחת טלטול עדין (200 rpm).
    6. הוסף 5 מ ל של 0.5% BSA/PBS לגרם של הרקמה האדיפוז והמקום על הקרח. Triturate את הפתרון פעמים רבות עם הצינורות 10 mL סרולוגית ולהעביר אותו דרך מסננת (100 μm) בעזרת בוכנה.
    7. צנטריפוגה ב 500 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c.
    8. הסירו את שבר האדיפוציט הצף באמצעות פילטף. השהה מחדש את הגלולה הסלולרית (סטרומה שבר כלי דם) ב 1 מ ל של מאגר הליזה ACK (ראה טבלת חומרים). הוסף 10 מ ל 2% FCS הערוץ.
    9. צנטריפוגה ב 500 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c.
    10. Decant סופר ומשהה מחדש את הגלולה בתא 250 μL של 2% FCS PBS.
    11. לספור את מספר התאים הפעילים על הטציטומטר באמצעות טריקון כחול הדרה.
  2. עיכול רקמת הכבד
    1. לאגור כבד בצינורית צנטריפוגה. מלאה בPBS ובהובלה בקרח
    2. בצע את הדיסוציאציה המכנית באמצעות חותמות מזרק בצלחת פטרי ב -4 ° c. לשים רקמת הכבד בגזור 50 mL צנטריפוגה שפופרת המכיל 10 מ ל של פתרון לעכל הכבד החום. לשטוף את צלחת פטרי עם 3 מ ל של פתרון לעכל הכבד.
    3. הפתרון רקמות הכבד של העור ב 37 ° c עבור 20 דקות תחת טלטול עדין (200 rpm).
    4. הוסף 20 מ ל של HBSS. Triturate את הפתרון פעמים רבות עם הצינורות 10 mL סרולוגית ולהעביר אותו דרך מסננת (100 μm) בעזרת בוכנה.
    5. צנטריפוגה ב 500 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c. והשהה מחדש את הגלולה בתוך 20 מ ל של HBSS.
    6. צנטריפוגה ב 30 x g עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר את המטריצה hepatocyte. . מחק את הגלולה הסלולרית
    7. צנטריפוגה את הסופרנטנט ב-500 x g במשך 10 דקות ב -4 ° c. השהה מחדש את הגלולה ב-10 מ ל של 33% בצפיפות צמיגות נמוכה של מעבר הצבע (ראה טבלת חומרים) ב-HBSS ואחריו צנטריפוגה (800 x g; 30 דקות; טמפרטורת החדר; ללא בלימה).
    8. השהה מחדש את הגלולה ב 1 מ ל של מאגר הליזה ACK ו דגירה עבור 4 דקות בטמפרטורת החדר. ואז להוסיף 10 מ ל של HBSS.
      הערה: כדי לבטל את הסופרנטנט מזהם את הסופרנטנט עם האינטרפציטים (hepatocytes) בזהירות רבה עם העברת הצנרת (ככל האפשר מבלי לקחת את הגלולה עם תאים חיסוניים אריתרופוציטים).
    9. להעביר תאים באמצעות מסננת 30 יקרומטר ב 15 מ"ל שפופרת הצנטריפוגה החרוו צנטריפוגה ב 500 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c. Decant סופר ומשהה מחדש את הגלולה בתא 250 μL של 2% FCS PBS.
    10. לספור את מספר התאים הפעילים על הטציטומטר באמצעות טריקון כחול הדרה.

4. צביעת פני השטח

  1. הכן לערבב נוגדנים עבור T-cell-קבוצות משנה (פאנל 1) ותאים חיסוניים מולדים (פאנל 2) כפי שמתואר בטבלה 1 ובטבלה 2. אמצעי אחסון ממוטבים עבור מדגם אחד (100 μL) לגבי ריכוזי נוגדנים.
    הערה: לימפוציטים תאים חיסוניים מולדים להציג הבדלים באופן אוטומטי, יש לנתח בנפרד.
  2. השתמש עד 3 x 106 תאים ב 100 μl בצינור facs פוליסטירן לצביעת פני השטח. כדי לחסום קולטני Fc להוסיף 10 μL של anti-CD16/CD32 נוגדן (מדולל 1:100) ו דגירה עבור 10 דקות על הקרח. השתמש בדגימת בקרה שלילית שאינה מוכתמת כדי לכוונן את הפיזור הצדדי (הפיקוח העצמי) ופיזור העברה (FSC) כדי לקבוע את המיקום של אוכלוסיית התא השלילית.
  3. ומערבולת ולהוסיף את הנפח המתאים של תערובת נוגדן פאנל 1 ו-פאנל 2. הוסף 1 μL של צבע הכדאיות לכל מדגם כדי לאפשר אפליה של תאים חיים ומתים. דגירה של 20 דקות ב 4 ° צ' ומוגן מפני אור.
  4. שטוף פעמיים עם 2 מ ל של 2% FCS PBS ו צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c.
  5. השהה מחדש את הגלולה בתא ב-300 μL של 2% FCS PBS ואחסן ב -4 ° c עד ניתוח של FACS.
    הערה: לפני התחלת המדידה לעבור תאים דרך 30 יקרומטר תא מסננת לתוך צינור facs ומערבולת. Cy, הזרמת שקעים בוצעה עם התאים המסומנים ב 2% FCS PBS ב 4 ° צ' עבור 1-3 h. יש לנתח תאים בהקדם האפשרי עבור תוצאות ממוטבות.

5. הזרמת הפיצויים, הרכישה והאיסוף

  1. הפעל מדגם שלילי ללא ויטראז ' כדי להגדיר את FSC ו-אס אס ולהתאים את המתח של cytometer הזרימה כדי לזהות אוכלוסיות leucocyte כדי להבדיל בין פסולת תאים קיימא. לא לכלול פסולת ותאים מתים.
    הערה: הכדאיות של השחטות התאים מהכבד עשויה להיות נמוכה יותר מהכדאיות של השעיות התאים מרקמת השומן הפריגונאל עקב צעד נוסף של הפרדת הצפיפות.
  2. הפעל דגימות בקרה ויטראז ' בודדות עבור פיצוי רב-צבעי.
    הערה: מחרוזות לכידת נוגדנים יכול לשמש גם כדי להתאים חפיפה ספקטרלי אם מספר התאים של אוכלוסיה באוכלוסייה של עניין הוא נמוך מדי כדי לפצות באמצעות תאים. כדי לזהות אותות בעלי קרינה אוטומטית אפשרית של התאים הפלואורסצנטית פחות אחד (FMO) בקרות עבור כל נוגדן מומלץ אך לא הוחלו בפרוטוקול זה.
  3. הפעל את המדידה, לאסוף את המספר המתאים של אירועים (לפחות 50,000 אירועים) ולהקליט נתונים ניסיוניים.
  4. יצא קבצי נתוני FCS לניתוח והגדר את אסטרטגיית הפעולה. שער על CD45+ leucocytes לזהות אוכלוסיות התאים הבאים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הפרוטוקול תיאר מאפשר את האפיון של סמנים פני השטח של תאים חיסוניים מולדים מסתגלת מבודדים מורטין perigonadal הרקמה והכבד במודל של המושרה דיאטה נאש. במודל זה, נאש המושרה על ידי מינהל של HFD פלוס סוכרוז (6%) במים לשתייה במשך 7 עד 15 שבועות בעכברים C57Bl/6J, כפי שדווח בעבר13. חשוב מכך, עכברים היו שוכנו בתנאים סטרילי למחצה, ולכן, חשופים אנטיגנים סביבתיים במהלך הניסוי. עכברים HFD האכיל שוכנו בתנאי SPF ועכברים דיאטה צ'או שוכנו תחת תנאי SPF ושאינם SPF שימשו פקדים. HFD האכלה הביא משקל הגוף משמעותי לצבור כבר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

Steatohepatitis יש קשר חזק עם חריגות מטבולית כגון השמנה, עמידות לאינסולין ו דיסליפידמיה15. מחקרים מרובים מצביעים על כך דלקת ברקמת אדיפוז יכול לנהוג בפתוגנזה של סוכרת סוג 2, כולל רמות שונות של תאים הן של המערכת החיסונית מולדת מסתגלת4,5,16,17 . בנוסף, זה כבר נמצא כי השמנת יתר מודולים את ההפעלה של מסלולים החיסונית, אשר יכול להוביל לסיבוכים בכבד18. יש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

אנו מודים Anke Jurisch, דיאנה וולנר, ד ר קתרין וייט ו קורנליה השמאן לקבלת סיוע בהליכים ניסיוניים ובנימין Tiburzy מ Biolegend על הערות מועילות על אסטרטגיית העליה. י. ס. ס. הייתה נתמכת על ידי מענק הלמהולץ (ICEMED). מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהיחידה למחקר קליני של מכון ברלין לבריאות (BIH), "BCRT-גרנט" על ידי משרד החינוך הגרמני הפדרלי של המחקר וקרן איינשטיין. K.S.-בי. ו-H.-D.V. ממומנים על ידי FOR2165.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
100 ומיקרו; מסנני תאי M מזרק פלקון352340
1 מ"ל BD   
26 גרם x 5/8 מחטים BD 
צלחות פטרי 35 מ"מ פלקון353001
40 ומיקרו; מסנני תאי M Falcon352340
מאגר ליזה ACK GIBCOA1049201
Alexa Fluor 700 נגד עכבר CD45 Biolegend 103127AB_493714 (BioLegend Cat. מס' 103127)
תוכנת ניתוח FlowJo 10.0.8 תוכנה
APC נגד עכבר CD11c נוגדןBiolegend 117309AB_313778 (BioLegend Cat. מס' 117309)
APC נגד עכברים KLRG1 (MAFA) נוגדןBiolegend 138411AB_10645509 (BioLegend Cat. מס' 138411)
BV421 נגד עכבר CD127 נוגדןBiolegend 135023AB_10897948 (BioLegend Cat. מס' 135023)
BV421 נגד עכבר F4/80 נוגדןBiolegend 123131AB_10901171 (BioLegend Cat. מס' 123131)
BV605 נגד עכבר CD279 (PD-1) נוגדןBiolegend 135219AB_11125371 (BioLegend Cat. מס' 135219)
BV605 נגד עכבר NK-1.1 נוגדןBiolegend 108739AB_2562273 (BioLegend Cat. מס' 108739)
BV650 נגד עכבר/אנושי CD11b נוגדןBiolegend 101239AB_11125575 (BioLegend Cat. מס' 101239)
BV711 נגד עכברים/אנושי B220 נוגדןBiolegend 103255AB_2563491 (BioLegend Cat. מס' 103255)
BV785 נגד עכבר CD8a נוגדן Biolegend 100749AB_11218801 (BioLegend Cat. מס' 100749)
עכברי C57Bl/6J, זכר, בני 5 שבועות Forschungseinrichtungen fü r experimentelle Medizin (FEM)
CaCl2 Charité - Universitä הוסמדין ברליןA119.1 
קולגנאז NB 4G הוכח כדרגה סרווה 
סוג קולגנאז I וורת'ינגטון 
LS004197 צינור צנטריפוגה חרוטי 15 מ"ל פלקון352096
צינור צנטריפוגה חרוטי 50 מ"ל פלקון352070
DNAse   סיגמא-אולדריץ' 
סרום בקר עוברי מסנן ביוכרוםS0115
30&מיקרו; מ תאית 
FITC נגד עכבר CD3 נוגדןBiolegend 100203AB_312660 (BioLegend Cat. מס' 100203)
ציטומטריית זרימה BD-LSR פורטסה 
מלקחיים סיגמא-אולדריץ' F4142-1EA
HBSS GmBH ביואנליטי  085021-0500 
תזונה עתירת שומן SSNIFE15741– 34 60 ק"ג% משומן, 19 ודליל; kJ% מחלבונים, ו-21  kJ% מפחמימות
מספריים לניתוח סיגמא-אולדריץ' S3146המשמש למטרות דיסקציה 
PE נגד עכבר CD25 נוגדןBiolegend 101903AB_312846 (BioLegend Cat. מס' 101903)
PE/Cy7 נגד עכבר CD62L נוגדןBiolegend 104417AB_313102 (BioLegend Cat. מס' 104417)
PE/Cy7 נגד עכברים I-A/I-E (MHCII) נוגדןBiolegend 107629AB_2290801 (BioLegend Cat. מס' 107629)
PE/Dazzle 594 נגד עכבר CD4 נוגדןBiolegend 100565AB_2563684 (BioLegend Cat. מס' 100565)
תמיסת פרקול BiochromL6115
PerCP/Cy5.5 נגד עכבר CD44 נוגדןBiolegend 103031AB_2076206 (BioLegend Cat. מס' 103031)
PerCP/Cy5.5 נגד עכבר Gr-1 נוגדןBiolegend 108427AB_893561 (BioLegend Cat. מס' 108427)
מי מלח חוצצים פוספט Gibco12559069
צינורות תחתונים עגולים עם מכסה מסננת תאיםSTEMCELL Technologies 38030
TruStain fcX נגד עכבר CD16/32Biolegend 101301AB_312800 (BioLegend Cat. מס' 101301)
טריפאן כחול סיגמא-אולדריץ' T6146
Zombie NIR ערכת כדאיות ניתנת לתיקוןBiolegend 423105כתם חיוניות 
309659305115114275134716728001400422316

מקורות

  1. Guh, D. P., et al. The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: A systematic review and meta-analysis. BMC Public Health. 9, 88(2009).
  2. Prentki, M. Islet β cell failure in type. J Clin Invest. 116 (7), 1802-1812 (2006).
  3. Shoelson, S. E., Lee, J., Goldfine, A. B. Inflammation and insulin resistance. Journal of Clinical Investigation. 116 (7), 1793-1801 (2006).
  4. Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444, 840(2006).
  5. Exley, M. A., Hand, L., O'Shea, D., Lynch, L. Interplay between the immune system and adipose tissue in obesity. Journal of Endocrinology. 223 (2), R41-R48 (2014).
  6. Ferrante, A. W. Macrophages, fat, and the emergence of immunometabolism. Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 4992-4993 (2013).
  7. Winer, D. A., et al. B cells promote insulin resistance through modulation of T cells and production of pathogenic IgG antibodies. Nature Medicine. 17, 610(2011).
  8. Onodera, T., et al. Adipose tissue macrophages induce PPARγ-high FOXP3(+) regulatory T cells. Scientific Reports. 5, (2015).
  9. Lackey, D. E., Olefsky, J. M. Regulation of metabolism by the innate immune system. Nature Reviews Endocrinology. 12, 15(2015).
  10. Calle, E. E., Kaaks, R. Overweight, obesity and cancer: epidemiological evidence and proposed mechanisms. Nature Reviews Cancer. 4, 579(2004).
  11. Ibrahim, S. H., Hirsova, P., Malhi, H., Gores, G. J. Animal Models of Nonalcoholic Steatohepatitis: Eat, Delete, and Inflame. Digestive Diseases and Sciences. 61 (5), 1325-1336 (2016).
  12. Beura, L. K., et al. Recapitulating adult human immune traits in laboratory mice by normalizing environment. Nature. 532 (7600), 512-516 (2016).
  13. Sbierski-Kind, J., et al. Distinct Housing Conditions Reveal a Major Impact of Adaptive Immunity on the Course of Obesity-Induced Type 2 Diabetes. Frontiers in Immunology. 9 (1069), (2018).
  14. Japp, A. S., et al. Wild immunology assessed by multidimensional mass cytometry. Cytometry Part A. 91 (1), 85-95 (2017).
  15. Benedict, M., Zhang, X. Non-alcoholic fatty liver disease: An expanded review. World Journal of Hepatology. 9 (16), 715-732 (2017).
  16. McNelis, J. C., Olefsky, J. M. Macrophages, Immunity, and Metabolic Disease. Immunity. 41 (1), 36-48 (2014).
  17. Ferrante, A. W. The Immune Cells in Adipose Tissue. Diabetes, Obesity & Metabolism. 15, 34-38 (2013).
  18. Bertola, A., et al. Hepatic expression patterns of inflammatory and immune response genes associated with obesity and NASH in morbidly obese patients. PloS One. 5 (10), e13577(2010).
  19. Turnbaugh, P. J., Bäckhed, F., Fulton, L., Gordon, J. I. Diet-Induced Obesity Is Linked to Marked but Reversible Alterations in the Mouse Distal Gut Microbiome. Cell Host & Microbe. 3 (4), 213-223 (2008).
  20. Singh, R. K., et al. Influence of diet on the gut microbiome and implications for human health. Journal of Translational Medicine. 15 (1), 73(2017).
  21. Müller, V. M., et al. Gut barrier impairment by high-fat diet in mice depends on housing conditions. Molecular Nutrition & Food Research. 60 (4), 897-908 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

עכברי תזונה עתירת שומןתנאי Non-SPFפракציה וסקולרית סטורמליתאנליזת ציטומטריה של זרימהפרוטוקול עיכול רקמהבידוד תאי מערכת החיסוןרקמת שומן בכבדאסטרטגיית גייטינג
מודל Murine מתקדם לאגודה לדלקת כבד Nonatoin עם סוכרת מסוג 2
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.