הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הפעלה כימית של ה-E3 אוביקוויב Ligase הומו מבוסס על ידי Pomalidomide מבוססי ההומו-פרוטואקס

13.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59472

⸱

15 במאי 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine III, University Hospital Ulm, 2Pharmaceutical Institute, Pharmaceutical Chemistry I, University of Bonn

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

עבודה זו מתארת את הסינתזה והאפיון של המבוסס על המוח, bifunctional הומו-protac כגישה הרומן כדי לגרום אובילינציה והשפלה של E3 אוביקוויב ליגאז המוח (crbn), המטרה של תלידומיד אנלוגיים gs.

תקציר

התרופות האימונומודולטוריים (שפוניים) תלידומיד ו האנלוגית שלה, lenalidomide ו pomalidomide, כל ה-FDA אישר תרופות לטיפול מיאלומה נפוצה, לגרום אוביקווינציה והשפלה של שעתוק הלימפה הגורמים אימוס (IKZF1) ו aiolos (IKZF3) באמצעות המוח (crbn) E3 אוביקוויב ליגאז עבור השפלה פרוטאספאואל. הסרדים לאחרונה כבר נוצל עבור הדור של bifunctional פרוטפוליזיס מיקוד הצ (PROTACs) כדי למקד חלבונים אחרים עבור אוביקווינציה ו השפלה פרוטאספאל על ידי CRBN E3 ligase. עיצבנו ו מסונתז pomalidomide מבוססי מבוסס PROTACs וניתח את היכולת שלהם כדי לגרום לעצמי אוביקווינציה והשפלה של CRBN. כאן, crbn משמש שניהם, the E3 אוביקוויב ליגאז ואת המטרה באותו זמן. מתחם הומו-פרוטואק 8 מאשר crbn עם עוצמה גבוהה עם השפעות שנותרו מינימליות בלבד על IKZF1 ו IKZF3. Crbn איון פעלה על ידי מתחם 8 לא היתה השפעה על הכדאיות התא והתפשטות של שונים תאים מיאלומה נפוצה. זה הומו-PROTAC abrogates ההשפעות של שפתוכים בתאי מיאלומה נפוצה. לכן, תרכובות מבוססות שלנו pomalidomide שלנו עשוי לסייע לזהות מצעים האנדוגניים של CRBN ופונקציות פיזיולוגיות ולחקור את המנגנון המולקולרי של הפתוכים.

מבוא

התרופות האימונומודולטוריים (שפתוכים) תלידומיד ו האנלוגית שלה, lenalidomide ו pomalidomide, כל מאושר לטיפול מיאלומה נפוצה, לאגד את המידע e3 אוביקוויב ליגאז (crbn), מתאם מצע עבור cullin4A-RING e3 לליגאז (CRL4crbn)1,2,3. איגוד של הסרדים מגביר את האהדה של CRL4crbn כדי שעתוק הלימפה גורמים אינוס (IKZF1) ו aiolos (IKZF3), המוביל שלהם אוביגינציה והשפלה (איור 1)4,5, מיכל בן 6 , מיכל סבן , 8. מאז IKZF1 ו IKZF3 חיוניים עבור תאים מיאלומה נפוצה, תוצאות חוסר ההפעלה שלהם מעכבות גדילה. SALL4 נמצאה לאחרונה כמו הגנום הניאו המושרה נוסף של crbn כי הוא כנראה אחראי על טראטוגניזה ואת האסון contergan בשנות החמישים שנגרמו על ידי תלידומיד9,10. לעומת זאת, שהקזאין (CK1α) הוא מצע מיוחד של CRBN, שהוא מעורב באפקט הטיפולי בתסמונת המיאלודיספלסטית עם מחיקות 5q של כרומוזום11.

היכולת של מולקולות קטנות למקד חלבון מסוים להשפלה היא רמז מרגש להתפתחות הסמים המודרנית. בעוד המנגנון של תלידומיד ואת האנלוגיות שלה התגלתה לאחר השימוש הראשון שלהם בבני אדם, כך קרא Proteolysis Targeting Chimeras (protacs) תוכננו במיוחד למקד חלבון של עניין (הדמות) (איור 2)12,13,14,15,16,17,18. Protacs הם מולקולות הטרובייוטיות המורכבות של ליגנד עבור פוי מחובר באמצעות מקשר ל ליגו של E3 אוביקוויב ליגאז כמו crbn or פון-היפרפל-ינדאו (vhl)18,19,20, 21,22. PROTACs לגרום להיווצרות של מתחם טרנארי חולף, הנחיית פוי ל-E3 אוביקוויב ligase, וכתוצאה מכך אוביקווינציה שלה והשפלה פרוטאספאואל. היתרונות העיקריים של PROTACs על פני מעכבי קונבנציונלי היא כי קשירה של פוי הוא מספיק ולא העכבות שלה ולכן PROTACs יכול למקד ספקטרום רחב הרבה יותר של חלבונים כולל אלה שנחשבו להיות undruggable כמו גורמים שעתוק15. בנוסף, מולקולות צ'יאריק לפעול באופן מזרז ולכן יש עוצמה גבוהה. לאחר העברת אוביקוויב לנקודת ההפוי, הקומפלקס הטרארי מנתק וזמין להיווצרות מתחמים חדשים. כך, ריכוזי PROTAC נמוך מאוד מספיקים עבור השפלה של חלבון היעד23.

כאן אנו מתארים את הסינתזה של pomalidomide-פוליאנide הומו-PROTAC (מתחם 8) כי המגוייסים עבור השפלה של עצמו24. The E3 אוביקוויט ליגאז crbn משמש הן המגייס ואת המטרה באותו זמן (איור 3). כדי לאמת את הנתונים שלנו, מסונתז גם בקרת מחייב שלילי (מתחם 9). הנתונים שלנו לוודא כי מסונתז הומו-PROTAC החדש הוא ספציפי עבור השפלה CRBN ויש לו רק השפעות מינימליות על חלבונים אחרים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת מולקולות PROTAC

התראה: נא להתייעץ עם כל גליונות הנתונים הרלוונטיים של בטיחות חומרים (MSDS) לפני השימוש. כמה מהכימיקלים המשמשים בתחביתזות אלה רעילים ומסרטנים. נא להשתמש בכל נוהלי הבטיחות המתאימים וציוד הגנה אישי.

  1. הכנת טרט-בוטיל N-(2, 6-דיאוקסו-3-piperidyl) carbamate (תרכובת 1)
    1. הוסף 1, 1-קרבונדיסרשאזול (1.95 g, 12 ממול) וכמות קטליטי של 4-(dimethylamino) pyridine (5 מ"ג) לתערובת של Boc-Gln-הו (2.46 g, 10 מ מול) ב THF (50 mL) ב 100 mL עגול בקבוקון עם בר מהומה מצויד עם מעבה ריפלוקס. חום על ריפלוקס עבור 10 h תוך כדי ערבוב עד לפתרון ברור נוצר.
    2. הסר את הממס תחת לחץ מופחת עם מאייד רוטרי, להוסיף אטואק (200 mL) ולהעביר אותו משפך מופרדים. לשטוף את השכבה האורגנית עם H2O (50 mL) ואת המלח (50 mL) ולייבש אותו על Na2SO4.
    3. מסננים את הפתרון באמצעות משטח קצר של סיליקה ג'ל (קוטר 5 ס"מ ו 5 ס"מ גובה) ומשחרל עם נפח נוסף (200 mL) של אטואק.
    4. להתנדף את הממס ולייבש את החסר צבע מוצק בתוך וחללים.
  2. הכנת טרט-בוטיל N-(1-מתיל -2, 6-דיאוקסו-3-piperidyl) carbamate (תרכובת 2)
    1. לשלב תרכובת 1 (2.28 g, 10 ממול) עם האשלגן פחמתי (2.76 g, 20 mmol) ו dmf (25 מ ל) ב 100 ml התחתון עגול בקבוקון. הוסף שפתי-שיני (1.42 g, 0.62 mL, 10 ממול) ירידה בחכמה באמצעות מזרק ולצייד את הבקבוקון עם מחיצת גומי נוקב. מניחים את כלי התגובה לתוך אמבטיה ultrasonication עבור 2 h.
    2. לדלל את תערובת התגובה עם אטואק (100 mL) ולהעביר אותו משפך מופרדים. שטוף את השכבה האורגנית עם 1 N NaOH (2x 25 מ ל), H2O (25 מ ל), ואת המלח (25 מ ל), ויבש אותו על Na2כל כך4.
    3. לסנן ולאדות את הממס. לטהר את המוצר על ידי כרומטוגרפיה עמודה על סיליקה ג'ל (6 ס"מ קוטר עמודה 20 ס"מ גובה) באמצעות אתר הנפט/אטואק (2:1).
  3. הכנה של 2-(2, 6-diox, 3-yl) -4-fluoroisoindoline-1, 3-dione (תרכובת 3)
    1. לשלב 3-fluorophthalic אנהידריד (1.25 g, 7.5 mmol), גלוטמיד 1 (1.14 g, 5 ממול) ופתרון של סודיום אצטט (0.50 g, 6.0 mmol) ב חומצה אצטית קרחוני (20 מ ל) ב בקבוקון התחתון בתוך 50 mL עם בר מהומה מצויד עם הקבל ריפלוקס. מחממים את התערובת ב-120 ° c עבור 6 שעות.
    2. לאחר הקירור, יוצקים את התערובת הסגולה על H2O (100 mL) ומערבבים עבור 10 דקות. לאסוף את הקימו מוצק על ידי סינון, לשטוף עם H2O (3 × 5 ml) ו הנפט אתר (3 × 5 ml) ויבש בתוך הריק.
  4. הכנת 4-fluoro-2-(1-מתיל-2, 6-diox, 3-yl) isoindoline-1, 3-dione (מתחם 4)
    1. לשלב 3-פלואור אנהידריד (1.25 g, 7.5 mmol), גלוטמיד 2 (1.21 g, 5 ממול) ופתרון של סודיום אצטט (0.50 g, 6.0 mmol) ב חומצה אצטית קרחוני (20 מ ל) ב בקבוקון התחתון 100 mL עם בר מהומה מצויד עם הקבל ריפלוקס. מחממים את התערובת ב-120 ° c עבור 6 שעות.
    2. לאחר הקירור, יוצקים את התערובת הסגולה על H2O (100 mL) ומערבבים עבור 10 דקות. לאסוף את הקימו מוצק על ידי סינון, לשטוף עם H2O (3 × 5 ml) ו הנפט אתר (3 × 5 ml) ויבש בתוך הריק.
  5. הכנה של tert-בוטיל N-[2-[2-[2-[2-(2, 6-דיאוקסו-3-piperidyl)-1, 3-דיאוקקסו-isoindolin-4-yl] איטורוקסי] אתיל] קרבאט (תרכובת 7)
    1. מטען 50 mL בקבוק התחתונה העגולה עם טרט-בוטיל N-[2-[2-(2-עמינח ethoxy) אתיל] carbamate (5, 0.41 g, 1.65 mmol), מתחם 3 (0.41 g, 1.50 mmol), יבש dmf (10 מ"ל) ו dipea (0.39 g, 0.51 mL, 3.0 mmol). צייד עם בר המהומה ואת הקבל ריפלוקס. מחממים את אווירת הארגון ב-90 ° c תמורת 10 שעות.
    2. לאחר קירור לטמפרטורת החדר, יוצקים את התערובת הירוקה כהה על H2O (100 ml) ולחלץ עם אטואק (3x 50 mL) במשפך משפך. שטוף את הרבדים האורגניים המשולבים עם H2O (50 mL) והמלח (50 ml), יבש מעל Na2כל כך4, מסנן, ולהתרכז בריק.
    3. לטהר את המוצר גולמי על ידי כרומטוגרפיה טור על סיליקה ג'ל (3 ס"מ קוטר עמודה ו 60 ס"מ גובה) באמצעות מעבר הדרגתי של הנפט אתר/אטואק (1:1 ל 1:2).
  6. הכנת הומודימר (תרכובת 8)
    1. לשלב α, ω-diamine מקשר 6 (0.22 g, 0.22 mL, 1.50 ממול), dipea (1.05 ml, 6.00 mmol) ופתרון של 3 (0.83 g, 3.00 MMOL) יבש Dmso (20 מ ל) בבקבוקון התחתון של 50 mL עם בר מהומה מצויד עם הקבל ריפלוקס. מחממים את אווירת הארגון ב-90 ° c תמורת 18 שעות.
    2. לאחר קירור לטמפרטורת החדר, יוצקים את התערובת הירוקה כהה על H2O (100 ml) ולחלץ עם אטואק (3x 50 mL) במשפך משפך. לשטוף את הרבדים האורגניים המשולבים עם H2O (50 mL) ותמיסת מלח (50 mL), יבש מעל Na2כל כך4, לסנן ולהתרכז והתרכז.
    3. לטהר את המוצר גולמי על ידי כרומטוגרפיה טור על סיליקה ג'ל (3 ס"מ קוטר עמודה ו 50 ס"מ גובה) באמצעות מעבר הדרגתי של הנפט אתר/אטואק (1:2) כדי אטואק.
  7. הכנת הטרודימר (תרכובת 9)
    1. התמוססות תרכובת 7 (0.83 g, 1.65 ממול) ב-CH יבש2Cl2 (10 מ"ל). הוסף חומצה trifluoroacetic (10 mL) ומערבבים את התערובת הצהובה ב 40 ° צ' עבור 2 h בבקבוקון סגור 50 mL עגול.
    2. הסר את הוולאטילס והתנדפים עם CH2Cl2 (4x 5 מ"ל). . תייבש את השאריות בתוך האבק במשך 10 שעות
    3. מפזר מחדש את החומר ב-DMF יבש (20 mL). הוסף תרכובת 4 (0.44 g, 1.50 mmol) ו dipea (0.78 g, 1.05 mL, 6.00 mmol) ולצייד את הבקבוקון עם הקבל ריפלוקס. מחממים את אווירת הארגון ב-90 ° c תמורת 10 שעות.
    4. לאחר קירור לטמפרטורת החדר, יוצקים את התערובת הירוקה כהה על H2O (100 ml) ולחלץ עם אטואק (3x 50 mL) במשפך משפך. לשטוף את הרבדים האורגניים המשולבים עם רווי נחקו3 (50 mL), H2o (50 ml), 10% khso4 (50 ml), h2o (50 mL), ואת המלח (50 ml), יבש מעל Na2כל כך4, לסנן ולהתרכז בריק.
    5. לטהר את המוצר גולמי על ידי כרומטוגרפיה טור על סיליקה ג'ל (3 ס"מ קוטר עמודה ו 50 ס"מ גובה) באמצעות מעבר הדרגתי של הנפט אתר/אטואק (1:2) כדי אטואק.
    6. להבהיר ולוודא מבנה מולקולה (איור 5A מתחם 8, 5a מתחם 9) על ידי 1H NMR ו 13C nmr ספקטרום ב dmso-d6 על תהודה מגנטית גרעינית (nmr) ספקטרומטר. בדוק כי הטוהר של שני תרכובות הוא גבוה מ 97% באמצעות ספקטרומטריה כרומטוגרפיה נוזלית (LC-MS), החלת זיהוי מערך דיודה (אבא) ב 220 – 500 ננומטר.

2. אימות פונקציונלי של מולקולות PROTAC

  1. ניתוח כתמי מערבי של ירידה CRBN על ידי PROTACs
    הערה: השפעות התרכובת8ומתחם9ברמת החלבון CRBN נבדקו על ידי ניתוח כתמי אבן מערבית. בנוסף, ההשפעה על רמות IKZF1 ו IKZF3 יכול גם להיות מאושר (איור 6).
    1. הכנה לדוגמא
      1. התמוססות תרכובות 8 ו -9, lenalidomide (Len), pomalidomide (פום), MG132, ו mln-4924 ב dmso בריכוז של 10 מ"מ, סדרת מחלקים ו החנות ב-80 ° צ' עד שימוש נוסף.
      2. זרע 1 x 106 MM1S תאים בצלחת 6-באר עם מדיה 2.5 mL ולטפל בתאים עם 100 nM או 1 μm מתחם 8 או 9 עבור 24 h.
      3. הקציר תאים לאחר הטיפול והצנטריפוגה ב 700 x g, 5 דקות, 4 ° c. לשטוף את הגלולה תא עם קר 1x PBS להסיר את המדיה הנותרים, צנטריפוגה ב 700 x g, 5 דקות, 4 ° צ', ו להיפטר supernatant. . חזור על השלב הזה פעם אחת
      4. Lyse תאים במאגר הליזה (25 מ"מ הHCl 7.4 מילימטר, 150 מ"מ, 1% NP-40, 1 מ"מ EDTA, 5% גליצרול, 1x פרוטאז & מעכבי פוספספטאז קוקטייל) עבור 10 דקות על קרח, צנטריפוגה בשעה 320 x g עבור 10 דקות, 4 ° c. הקציר הסופר ולקבוע ריכוז החלבון על ידי שיטת חלבון החומצה הבינותית (שיטת BCA) על פי פרוטוקול היצרן.
      5. חלבונים בספרות (15 – 30 μg/מדגם) עם מאגר העמסה 1x המילד (5% 2-mercaptoethanol) ומרתיחים 10 דקות, 75 ° c.
    2. מדים-עמוד
      1. כריך לתקן ג'ל עם 10% הפרדה ג'ל [4 mL 3x ג'ל מאגר (3 M טריס/HCl, 0.3% (w/v) נתרן dodecyl סולפט (SDS), pH 8.45), 4 מ ל אקרילאמיד 30%, 2.52 mL גלירול 50%, 1.395 mL2O, 75 μl 11% אמוניום פרסולפט (APS), ו-9.75 μl) ו-4% הערמה ג'ל [1.992 mL 3x ג'ל מאגר, 0.792 mL 30% אקרילאמיד, 3.168 mL H2O, 36 μl 11% APS, ו 6 ΜL temed] ביחידת הרכבה אלקטרודה. להסיר מסרקים, ריקון בארות עם מאגר קתודה (100 mM טריס/HCl, 100 mM tricine, 0.1% (w/v) SDS), ו לטעון דגימות.
      2. מילוי מאגר אנודת (100 mM טריס/HCl, pH 8.9) לתוך המיכל. לטעון דגימת חלבון משלב 2.1.1.4 ולהפעיל SDS-PAGE ב 70 V, 20 דקות, ואחריו 115 V, 150 דקות במתח קבוע.
    3. בלוק חיסוני וזיהוי של CRBN, IKZF1 ו IKZF3
      1. הפעל ממברנה PVDF (0.45 μm) ב 100% מתנול עבור 1 דקות. ממברנה מוספרטה והפרדת ג'ל ב 1x מאגר העברה [10x מאגר העברה (192 מילימטר גליצין, 25 מ"מ בסיס טריס/HCl, 900 mL2O), 20% מתנול, 0.1% Sds, pH 8.3].
      2. הכנס את הקלטת הלבנה בהתאם לפרוטוקול היצרן. העברה ג'ל ב 180 mA עבור 90 דקות.
      3. לשטוף ממברנה 3x ב-1x TBS-T (25 מ"מ Tris/HCl, 150 מ"מ היאl, pH 7.6, 0.1% הרצף 20) עבור 5 – 10 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר. לחסום קרום ב 5% שומן חלב יבש (NFDM), TBS-T עבור 1 h בטמפרטורת החדר. לרחוץ ממברנה 3x ב-1X TBS-T עבור 5 – 10 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר.
      4. ממברנה דגירה עם נוגדן ראשוני עבור CRBN (1:500 בתוך 5% BSA, TBS-T) עם טלטול עדין ב 4 ° c, לילה.
      5. לרחוץ ממברנה 3x ב-1X TBS-T עבור 5 – 10 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר. ממברנה דגירה עם אנטי עכבר (1:10.000 ב 5% NFDM, TBS-T) או נגד ארנב (1:5.000 ב 5% NFDM, TBS-T) הנוגדן המשני מצמידים לחזרת peroxidase HRP (1 h בטמפרטורת החדר.)
      6. שטוף ממברנה 2x ב-1X TBS-T עבור 5 – 10 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר. חזור על שלב זה פעמיים באמצעות TBS 1x.
      7. ממברנה דגירה עבור 2 דקות עם פתרון המצע HRP על פי הפרוטוקולים של היצרן ולזהות chemiluminescence במכשיר זיהוי כימואומיננסנציה.
      8. שטוף ממברנה 1x ב-1 x TBS עבור 5 – 10 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר. לשחרור של נוגדנים, קרום רצועת במאגר מסחרי זמין להתפשט עבור 15 דקות. לשטוף ממברנה 3x ב-TBS 1X עבור 5 – 10 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר.
      9. לחסום ממברנה ב 5% שומן חלב מיובש, TBS-T עבור 1 h בטמפרטורת החדר. לרחוץ ממברנה 3x ב-1x TBS-T עבור 5 – 10 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר ו reprobe בדוק עם IKZF1, IKZF3 או טובולין לפי שלב 2.1.3.4.
  2. תחרות ניסויים עם MG132, MLN4942 או פוליאנדומיד
    הערה: כדי לאשר אם CRBN מושפל באמצעות מסלול אוביקוויב-פרוטאסדום, ביצעו ניסויים בתחרות עם MG132 מעכב פרוטסליב ' ו מפעיל neddylation הפעלת אנזים (לא) מעכב MLN4942 (איור 7).
    1. זרע 1 x 106 MM1S תאים לכל טוב בצלחת 6-היטב. לטפל בתאים עם 10 μM MG132, 10 μM MLN4942, או lenalidomide (100x), ו-דגירה 1 h ב 37 ° צ', 5% CO2.
    2. הוסף 100 ננומטר מתחם 8 עבור 3 h ב 37 ° c, 5% CO2.
    3. בתאי הקציר לאבן החשופה המערבית לפי שלב 2.1.1.
  3. הכדאיות התאית בקווים מרובים של תאים מיאלומה
    הערה: שיטת הבדיקה משמשת כדי לבחון את ההשפעה על הכדאיות בתאים ובנוסף, להרגיז את ההשפעה של הסרדים על מספר תאי מיאלומה על ידי טיפול מקדים של התאים עם תרכובת 8 (איור 8, איור 9a, B).
    1. זרע 5 x 104 MM1S תאים בבאר בצלחת 96 ביולוגי בטרילקטים ביולוגיים לצורך הכדאיות. עבור ניתוח כתמי מערבי, זרע 1 x 106 MM1S תאים בו בצלחת 6-היטב בטריליטים ביולוגיים.
    2. לטפל בתאים עם DMSO או 100 nM, 1 μM, או 10 μM מתחם 8, מתחם 9 או pomalidomide ו דגירה עבור 24 h, 48 h, או 96 h ב 37 ° c, 5% CO2. עבור ניסויים הצלה, לטפל בתאים עם 100 ננומטר מתחם 8 עבור 3 h, לפני או אחרי תוספת של 1 μm pomalidomide ו דגירה עבור 96 h.
    3. מדידה 96-צלחת לומיזנציה עם שיטת הכדאיות של התא זורח, על פי פרוטוקול של היצרן על קורא צלחת או בתאי הקציר מן הצלחת 6-הבאר עבור ניתוח כתמי מערבי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כאן תיארנו את העיצוב, סינתזה והערכה ביולוגית של homodimeric pomalidomide מבוסס PROTAC עבור השפלה של CRBN. PROTAC שלנו אינטראקציה בו זמנית עם שני מולקולות CRBN וטפסים מתחמי מתחמים הגורמת עצמית אוביקווינציה והשפלה proteasomal של CRBN עם תופעות הנותרים מינימלי רק על pomalidomide המושרה ניאו מצעים IKZF1 או IKZF3.

מתוך סדרה של מולקולות מבוססות PROTALIDOMIDE שפורסמו בעבר, מתחם 8 היה יעיל במיוחד...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

העיצוב של כזה הומו-PROTACs כפי שתואר כאן עבור CRBN מסתמך על הזיקה הספציפית של pomalidomide כדי CRBN, אשר כבר נוצל בהצלחה ברבים הטרובידותיום PROTACs והביא לפיתוח PROTACS 8 כמו מאוד CRBN degrader סלקטיבית. הספציפיות של המולקולה שלנו כבר אושרה על-ידי ניתוחים פרוטאואריים24. עבור הסתרה מתווכת גנטית, הדרה ואימות של תופעות לוואי הוא מאתגר זמן רב. בנוסף, מנוק הנגרמת כימית הוא הפיך, מהירה וישימה ישירות לקשת רחבה של תאים וסוגי רקמות28.

הסר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אינם מצהירים על ניגוד אינטרסים כספי פוטנציאלי.

תודות

עבודה זו היתה נתמכת על ידי הגרמני של הפרויקט (אמי-נתר התוכנית Kr-3886/2-1 ו-SFB-1074 לג; FOR2372 to מ)

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1,1'-CarbonyldiimidazoleTCI chemicalsC0119
2,2′-(Ethylenedioxy)-bis(ethylamine)Sigma-Aldrich385506Compound 6
2-mercaptoethanolSigma-AldrichM6250
3-Fluorophthalic anhydride, 98Alfa AesarA12275
4-Dimethylaminopyridine, 99%Acros148270250
אקרילאמידסטמל רעיל; sung/ Bisacrylamid (30%/0,8%)Carl Roth3029.1
Aiolos (D1C1E) mABCell Signaling15103S
נוגדן Anti-CRBN המיוצר בארנבSigmaHPA045910
נוגדן נגד ארנב IgG HRP מקושרSigma7074S
אמוניום פרסולפטרוט9592.2
Boc-Gln-OHTCI כימיקליםB1649
סרום בקר אלבומיןSigma-AldrichA7906-100G
CellTiter-Glo בדיקת כדאיות תאים זוהריםPromegaG7571
ChemiDoc XRS+Bio-Rad1708265
DMF, נטול מים, 99.8Acros348435000יבש במיוחד מעל מסננת מולקולרית
DMSO, נטול מים, 99.7Acros348445000יבש במיוחד מעל מסננת מולקולרית
גליציןסיגמא-אולדריץ'15523-1L-R
עיזים נגד עכבר (מצומד HRP)סנטה קרוז ביוטכנולוגיהsc-2005
עצור פרוטאז & מעכב פוספטאז קוקטייל חד פעמי (100X)Thermo Scientific1861280
Ikaros (D6N9Y)Mab Cell Signaling14859S
ImmobilonP Transfer Membrane (0,45µ m)MerckIPVH000010
Iodomethane, 99%Sigma-AldrichI8507
מתנולSigma-Aldrich32213-2.5L
Mg132SelleckchemS2619
תא העברה אלקטרופורטי מיני Trans-BlotBio-Rad1703930
Mini-PROTEAN Tetra תא אלקטרופורזהאנכיתBio-Rad1658004
ביומול MLN4942(קיימן)Cay15217-1
נוגדן חד-שבטי נגד אלפא;-טובולין המיוצר בעכבר (B512)SigmaT5168
N-Ethyldiisopropylamine, 99Alfa AesarA11801
אבקת חלב מיובש ללא שומןPanReac AppliChemA0830,0500
Nunc F96 MicroWell לבן צלחת פוליסטירןThermo Scientific136101
NuPAGE LDS מאגר מדגם (4X)Thermo ScientificNP0008
Pierce BCA ערכת בדיקת חלבוןThermo Scientific23225
PomalidomideSelleckchemS1567
RestoreTM Western Blot Stripping BufferThermo Scientific46430
נתרן דודציל סולפטקארל רוט183.1
נתרן כלוריסיגמא-אולדריץ'A9539-500 גרם
TEMEDקארל רוט2367.3
טרט-בוטיל N-[2-[2-(2-אמינואתוקסי)אתוקסי]אתיל]קרבמטסיגמא-אולדריץ'89761תרכובת 5
טריציןקארל רוט6977.4
בסיס טריזמהסיגמא-אולדריץ'T1503-1 ק"ג
Tween-20Sigma-AldrichP7949-500 מ"ל
ספריי WesternBright ECLAdvanstaK-12049-D50
% % % רעיל מאוד %

מקורות

  1. Ito, T., et al. Identification of a primary target of thalidomide teratogenicity. Science. 327 (5971), 1345-1350 (2010).
  2. Lopez-Girona, A., et al. Cereblon is a direct protein target for immunomodulatory and antiproliferative activities of lenalidomide and pomalidomide. Leukemia. 26 (11), 2326-2335 (2012).
  3. Fischer, E. S., et al. Structure of the DDB1-CRBN E3 ubiquitin ligase in complex with thalidomide. Nature. 512 (7512), 49-53 (2014).
  4. Gandhi, A. K., et al. Immunomodulatory agents lenalidomide and pomalidomide co-stimulate T cells by inducing degradation of T cell repressors Ikaros and Aiolos via modulation of the E3 ubiquitin ligase complex CRL4(CRBN). British Journal of Haematology. 164 (6), 811-821 (2014).
  5. Kronke, J., Hurst, S. N., Ebert, B. L. Lenalidomide induces degradation of IKZF1 and IKZF3. Oncoimmunology. 3 (7), e941742(2014).
  6. Lu, G., et al. The myeloma drug lenalidomide promotes the cereblon-dependent destruction of Ikaros proteins. Science. 343 (6168), 305-309 (2014).
  7. Zhu, Y. X., Kortuem, K. M., Stewart, A. K. Molecular mechanism of action of immune-modulatory drugs thalidomide, lenalidomide and pomalidomide in multiple myeloma. Leukemia & Lymphona. 54 (4), 683-687 (2013).
  8. Chamberlain, P. P., et al. Structure of the human Cereblon-DDB1-lenalidomide complex reveals basis for responsiveness to thalidomide analogs. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (9), 803-809 (2014).
  9. Donovan, K. A., et al. Thalidomide promotes degradation of SALL4, a transcription factor implicated in Duane Radial Ray syndrome. eLife. 7, (2018).
  10. Matyskiela, M. E., et al. SALL4 mediates teratogenicity as a thalidomide-dependent cereblon substrate. Nature Chemical Biology. 14 (10), 981-987 (2018).
  11. Kronke, J., et al. Lenalidomide induces ubiquitination and degradation of CK1alpha in del(5q) MDS. Nature. 523 (7559), 183-188 (2015).
  12. Sakamoto, K. M., et al. Protacs: chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (15), 8554-8559 (2001).
  13. Sakamoto, K. M., et al. Development of Protacs to target cancer-promoting proteins for ubiquitination and degradation. Molecular & Cellular Proteomics. 2 (12), 1350-1358 (2003).
  14. Schneekloth, J. S. Jr, et al. Chemical genetic control of protein levels: selective in vivo targeted degradation. Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3748-3754 (2004).
  15. Gu, S., Cui, D., Chen, X., Xiong, X., Zhao, Y. PROTACs: An Emerging Targeting Technique for Protein Degradation in Drug Discovery. Bioessays. 40 (4), e1700247(2018).
  16. Collins, I., Wang, H., Caldwell, J. J., Chopra, R. Chemical approaches to targeted protein degradation through modulation of the ubiquitin-proteasome pathway. Biochemical Journal. 474 (7), 1127-1147 (2017).
  17. Neklesa, T. K., Winkler, J. D., Crews, C. M. Targeted protein degradation by PROTACs. Pharmacology & Therapeutics. 174, 138-144 (2017).
  18. Winter, G. E., et al. Phthalimide conjugation as a strategy for in vivo target protein degradation. Science. 348 (6241), 1376-1381 (2015).
  19. Maniaci, C., et al. Homo-PROTACs: bivalent small-molecule dimerizers of the VHL E3 ubiquitin ligase to induce self-degradation. Nature Communications. 8 (1), 830(2017).
  20. Crew, A. P., et al. Identification and Characterization of Von Hippel-Lindau-Recruiting Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of TANK-Binding Kinase 1. Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).
  21. Lu, J., et al. Hijacking the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon to Efficiently Target BRD4. Chemistry & Biology. 22 (6), 755-763 (2015).
  22. Steinebach, C., et al. PROTAC-mediated crosstalk between E3 ligases. Chemical Communications. 55 (12), 1821-1824 (2019).
  23. Tinworth, C. P., Lithgow, H., Churcher, I. Small molecule-mediated protein knockdown as a new approach to drug discovery. Medchemcomm. 7 (12), 2206-2216 (2016).
  24. Steinebach, C., et al. Homo-PROTACs for the Chemical Knockdown of Cereblon. ACS Chemical Biology. 13 (9), 2771-2782 (2018).
  25. Ambrozak, A., et al. Synthesis and Antiangiogenic Properties of Tetrafluorophthalimido and Tetrafluorobenzamido Barbituric Acids. ChemMedChem. 11 (23), 2621-2629 (2016).
  26. Zhou, B., et al. Discovery of a Small-Molecule Degrader of Bromodomain and Extra-Terminal (BET) Proteins with Picomolar Cellular Potencies and Capable of Achieving Tumor Regression. Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).
  27. Zhang, C., et al. Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK). European Journal of Medicinal Chemistry. 151, 304-314 (2018).
  28. Runcie, A. C., Chan, K. H., Zengerle, M., Ciulli, A. Chemical genetics approaches for selective intervention in epigenetics. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 186-194 (2016).
  29. Kronke, J., et al. Lenalidomide causes selective degradation of IKZF1 and IKZF3 in multiple myeloma cells. Science. 343 (6168), 301-305 (2014).
  30. Eichner, R., et al. Immunomodulatory drugs disrupt the cereblon-CD147-MCT1 axis to exert antitumor activity and teratogenicity. Nature Medicine. 22 (7), 735-743 (2016).
  31. Zhu, Y. X., et al. Cereblon expression is required for the antimyeloma activity of lenalidomide and pomalidomide. Blood. 118 (18), 4771-4779 (2011).
  32. Kortum, K. M., et al. Targeted sequencing of refractory myeloma reveals a high incidence of mutations in CRBN and Ras pathway genes. Blood. 128 (9), 1226-1233 (2016).
  33. Gil, M., et al. Cereblon deficiency confers resistance against polymicrobial sepsis by the activation of AMP activated protein kinase and heme-oxygenase-1. Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 976-981 (2018).
  34. Kim, H. K., et al. Cereblon in health and disease. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 468 (8), 1299-1309 (2016).
  35. Lee, K. M., et al. Disruption of the cereblon gene enhances hepatic AMPK activity and prevents high-fat diet-induced obesity and insulin resistance in mice. Diabetes. 62 (6), 1855-1864 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

פירוק CereblonPROTACs מבוססי Pomalidomideתרכובת Homo-PROTAC 8נטרול CRBNאנליזת Western Blotבדיקת חיות תאיםתאי מיאלומה מרובהפירוק IKZF1 ו-IKZF3עיכוב פרוטאוזוםאישור מבנה ב-NMR
הפעלה כימית של ה-E3 אוביקוויב Ligase הומו מבוסס על ידי Pomalidomide מבוססי ההומו-פרוטואקס
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.