יישום של רטבאליות העיסוי העקבי של העכבר וניטור השינויים הנובעים בלחץ שרירי

סיכום

כאן נתאר את הפרוטוקולים להחלת עומסים מכניים מוגדרים לעגלים של העכבר ולניטור השינויים בלחץ הפנים-שרירי הפנימי. המערכות הנסיוניות שפיתחנו יכולות להועיל לחקירת המנגנון שמאחורי ההשפעות היעילות של הפעילות הגופנית והעיסוי.

תקציר

העיסוי מוכר בדרך כלל כמועיל להקלה על כאב ודלקת. למרות שמחקרים קודמים דיווחו על השפעות אנטי דלקתיות של עיסוי על שרירי השלד, המנגנונים המולקולריים שמאחורי מובנים בצורה גרועה. פיתחנו לאחרונה מכשיר פשוט כדי להחיל דחיסה מחזורית מקומית (LCC), אשר יכול ליצור גלי לחץ שרירית עם הגברה משתנה. באמצעות התקן זה, הדגמנו כי LCC מודולים התגובות דלקתיות של מקרופאגים באתרו ומקלה על ניוון שרירים המושרה הנגרמת. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים עבור אופטימיזציה ויישום של LCC כמו עיסוי כמו התערבות נגד דלקת וניוון המושרה של שרירי השלד של השרירים העכבר. הפרוטוקול שפיתחנו יכול להיות שימושי לחקירת המנגנון שבבסיס השפעות מועילות של פעילות גופנית ועיסוי. המערכת הניסיונית שלנו מספקת אבטיפוס של הגישה האנליטית כדי להבהיר את הוויסות המכני של הומאוסטזיס שרירים, למרות פיתוח נוסף צריך להתבצע למחקרים מקיפים יותר.

מבוא

עיסוי הוא בדרך כלל מוכר להיות מועיל עבור הקלה ושיפור הכאב של הביצועים הפיזיים בין ספורטאים תחרותיים ושאינם ספורטאים כאחד^1,2. למעשה, מחקרים קודמים הראו כי עיסוי מדכא דלקת מקומית³ ומבקש התאוששות מנזק פוסט-תרגול שרירים^4,5. מנגנונים מולקולריים הנמצאים בבסיס ההשפעות היעילות של העיסוי נותרו בלתי ידועים.

אחד הקשיים עם החקירה המכונה על העיסוי מתייחס לחוסר המחקר של טכניקות נסיוניות שבהן נבדקים התערבויות כמו עיסוי. במחקרים קודמים, הליכים ניסיוניים המחקים עיסוי בעיקר כרוכים ביישום של התערבויות פיזיות באמצעות חלקי גוף של מתרגלים, כגון כפות ידיים ואצבעות^6,7,8. כך קשה לשכפל בדיוק את סדר הגודל, התדר, המשך והמצב שלהם.

התקנים רבים פותחו כדי להחיל עומסים מכני מוגדר לרקמות היעד. לדוגמה, Zeng et al. פיתחה מערכת פניאומטית עבור הטעינה מכני באורך וחכם לבין הגפיים של חולדות⁹ ו-וואנג et al פיתחו מכשיר mechatronic שיכול להחיל עיסוי, כמו המון מכני על הגפיים של חולדות וארנבים עם בקרת משוב בזמן אמת¹⁰. בהשוואה אליהם, מערכת דחיסה מחזורית מקומית (LCC) שלנו היא הרבה יותר פשוטה, בדרישה הרבה פחות עלות לבנייה. עם זאת, אנו יכולים לשכפל את השינויים בלחץ הפנים שנוצר במהלך התכווצות שרירים קלה. באמצעות התקן זה, הדגמנו בהצלחה כי התערבויות מכני כמו עיסוי לווסת את הדינמיקה המקומית נוזל ביניים ולהקל על ניוון שרירים המושרה הנגרמת¹¹.

כאן, אנו מתארים את פרטי המכשיר שלנו ואת הפרוטוקול, אשר עשוי לעזור לחקור את המנגנונים המולקולריים מאחורי ההשפעות החיוביות של תרגילים ועיסויים. הסכמות של הפרוטוקול מוצגות כאיור משלים 1.

פרוטוקול

כל הניסויים בבעלי חיים נערכו באישור הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים ושימוש במרכז השיקום הלאומי לאנשים עם מוגבלויות.

1. השתק שאיפה של העכבר הדו הצדדי

הערה: זכר C57BL/6 עכברים שימשו לניסויים בגיל 11-12 שבועות לאחר הסתגלות לפחות 7 ימים.

1. כראוי מורדם עכבר באמצעות נתרן פנטוברביטל (50 מ"ג/ק"ג כיתה). ודא שעכברים אינם מגיבים לצביטה בבוהן.
   הערה: בצע את ההליך של השתק בין השעות 10:00 ו -7 בערב כדי למזער את ההשפעות האפשריות על פעילות ההזנה של עכברים.
2. החלת קלטות כירורגי על הגפיים הדו של העכבר הניח במצב פרקדן עם מפרקי הברך מוארך והקרסול המפרקים plantar-flexed.
3. הניחו חוט אלומיניום (ראו טבלת חומרים) על העורק ברמת השדרה L4-5 והסליל את התיל בתצורת ספירלה סביב הגפיים עם מרווחים של 5 מ"מ בין כל סיבוב של השכבה הספירלית (איור 1a). הקפד לא לסליל את התיל חזק מדי ולהימנע מפריע זרימת הדם המקומית.
4. כדי למזער את האפשרות של בריחה מחיווט, לשתק את המפרקים הירך במיקום של החטיפה 90 ° על ידי התאמת ידנית את התצורה של חוט אלומיניום.
5. החזר את העכברים לכלובים המקוריים שלהם. 3 שעות מאוחר יותר, ודא שהם מחלימים מהרדמה וגישה למזון ולמים כרגיל.
6. בית 3-6 משתק עכברים לכל כלוב כמו לפני הקיבוע.

2. מדידה של לחץ תוך-שרירי של השרירים של העכבר

הערה: כמה משקולות שונות של יחידות גלילי (36 g, 66 g, ו 200 g) נבדקו בניסויים ניטור לחץ בשילוב עם LCC. מדידה זו נערכה בנפרד מן הניסויים כדי לנתח דלקת שרירים וניוון (ראה שלב 3-5 לפרטים נוספים) i.e., העכברים נתון מדידת לחץ לא שימשו ניתוח היסטולוגית.

1. מכיוון שמדידת הלחץ כרוכה בהליכים פולשניים יותר (למשל, חתך העור והחדרת מחט) לעומת חיווט הגוף המחודש, LCC, להשתמש בתערובת של שלושה סוכני הרדמה (medetomidine 0.75 mg/ק"ג, midazolam 4.0 mg/ק"ג, ו butorphanol 5.0 mg/ק"ג, כיתה). ודא שעכברים אינם מגיבים לצביטה הבוהן התחת.
2. להניח את העכבר בתנוחה נוטה, לעשות חתך 2-mm עם אזמל על העגל האחורי לאחר depilating עם מכונת גילוח חשמלי למחצה מחטא את פני העור עם 70% אתנול-ו כלורקסדין-כותנה סופג ספוג.
3. הכנס מחט שכינתה 20 גרם לתוך השריר הגקטמיאוס בזווית קהה (150 ° – 170 °) על פני העור.
4. באמצעות מעטפת פלסטיק של המחט כמדריך, במקום חיישן של הטלמטר לחץ דם (ראה טבלה של חומרים) באמצע בטן של השריר גקצ'נמיוס, ולאחר מכן להסיר את הנדן מן השריר.
5. לאחר העור עם תפר ניילון 4-0, להחיל LCC עם משקולות שונות של יחידות גליליות לעגל בעכברים (ראה שלב 3 לפרטים נוספים), ולנטר את הלחץ התוך שרירי באמצעות תוכנה עבור ניתוח אותות ביולוגיים (ראה טבלת חומרים).
6. החזר את העכברים לכלובים המקוריים שלהם. 3 שעות מאוחר יותר, ודא שהם מחלימים מהרדמה/משככי כאבים ויש להם גישה למזון ולמים כרגיל.

3. דחיסה מחזורית מקומית (LCC) על עגלים לעכבר

1. למעט מדידה הלחץ הפנימי והמתת החסד (כלומר, פריקה צוואר הרחם), השימוש נתרן פנטוברביטל (50 mg/ק"ג כיתה) עבור הרדמה.
2. לנתק את העכבר מתוך חיווט הגוף ולהניח אותו בתנוחה נוטה עם מפרקי הברך המורחבת המפרקים הקרסול plantar-מוכי העגלים התמודד כלפי מעלה. לא לתקן את העכבר מתחת לרגליים על הבמה.
3. החלת LCC על העגל על ידי הזזת יחידת משקל גלילי (איור 1B) מכוסה במשטח כרית (איור 1b) ב-1 הרץ עבור 30 דקות ליום, 7 ימים.
4. לאחר כל התחרות של LCC יומי, לחווט מחדש את הגפיים העכבר.

4. האנליזה האימונוהיסטוקלית של גקטמיאוס

1. המתת חסד העכבר על ידי פריקת צוואר הרחם בהרדמה נאותה/כאבים על ידי הזרקת הצפק של תערובת של שלושה סוכני הרדמה (medetomidine 0.75 mg/ק"ג, midazolam 4.0 mg/ק"ג, ו butorphanol 5.0 mg/ק"ג).
2. לאחר depilating משטח העגל האחורי, לעשות חתך העור, ולנתח את השרירים הגקינמאוס על ידי הפרדת העצם tibio-fibular באמצעות מספריים כירורגית ובמהירות להקפיא אותם בפתרון הטמפרטורה האופטימלית לחיתוך מתחם.
3. באמצעות קריוסטט, הכינו דגימות של שרירי גקטנמיוס על מגלשות זכוכית. אחסן את הדגימות במקפיא של 80 ° c עד לניתוח.
4. קחו את הדגימות מהמקפיא ומייבשים אותם על ידי ייבוש האוויר בטמפרטורת החדר.
5. השתמש בעט של חוסם הנוזלים כדי לצייר אזור הכולל את כל מקטעי ההקפאה בשקופית. המעגל ימנע מהפתרונות לזרום מהשקופית.
6. הימנע מייבוש הדגימות על-ידי הצבת השקופיות במגש שבו סביבה לחה נוצרת עם מטלית נייר ספוגה במים.
7. החל 100 μL של חסימת מאגר (מתמיסת מלח באגירה (PBS) המכילה 0.25% קזאין, הספק חלבון, ו 0.015 M נתרן azide) עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר.
8. לשטוף את השקופיות פעמיים על ידי הדגירה עם PBS-T (PBS המכיל 0.1% polyoxyethylene יתן מונאולאורון (ראה טבלת חומרים) עבור 5 דקות.
9. החל 100 μL של הנוגדן העיקרי מדולל עם PBS על כל מדגם, לכסות את המגש עם מכסה, ו דגירה לילה בטמפרטורת החדר.
10. רוחצים 3 פעמים עם PBS-T (5 דקות לכל כביסה).
11. החל 100 μL של נוגדן משני מדולל עם PBS על כל מדגם ו-דגירה עבור 1 h בטמפרטורת החדר.
    הערה: למניעת למינציה בצביעת, השתמש ב-אלקסה Fluor 568-נוגדן משני מצועם. עבור anti-F4/80, נגד MCP-1, ו אנטי-TNF-α, להשתמש אלקסה Fluor 568-או 488-מעלה מצושל נוגדן משני.
12. רוחצים 3 פעמים עם PBS-T (5 דקות לכל כביסה).
13. החל 100 μL של פתרון DAPI מדולל עם PBS-T על כל מדגם ו-דגירה עבור 3 דקות בטמפרטורת החדר.
14. רוחצים 3 פעמים עם PBS-T (5 דקות לכל אחד).
15. הר את הדגימות עם הרכבה בינונית ולכסות אותם עם כיסוי.

5. היסטו-אנליזה גוורמטרית של גקטמינוס

1. מניחים את השקופיות לדוגמה על מיקרוסקופ פלואורסצנטית (ראה טבלת חומרים) ולהציג את הדגימות באמצעות 20 × מטרה עם מסננים המתאים (dapi-B, 360/40 nm עבור עירור ו 460/50 nm עבור פליטה; GFP-B, 470/40 nm עבור עירור ו 535/50 nm עבור פליטה; FRITC, 540/25 nm עבור עירור ו 605/55 nm עבור פליטה.
2. באמצעות התוכנה לניתוח תמונה (ראה טבלת חומרים), למדוד את האזור חתך הרוחב (csa) של כל מיובים, ולספור את מספר F4/80-, MCP-1-, ו-tnf-α-התאים חיוביים.
   הערה: קבע CSA של כל מיויוסיבי על ידי מעקב אחר השוליים הפנימיים של קרום המרתף דמיינו עם כתמים אנטי למינציה ב-2.

תוצאות

בהתאם^{לתצפיות}הקודמות שלנו, השניים הללו הופחתו באופן משמעותי על-ידי מעבר (איור 2א, ב). יתרה מזאת, הניתוח שלנו מכתים את האנליזה החיסונית שלנו חשפה כי תאים המבטאים MCP-1 ו-tnf-α, שניהם משחקים תפקידים מרכזיים בוויסות תהליכים דלקתיים^13,14, גדל באופן משמעותי בשריר הווקנמיוס רקמות של קיבוע הגפיים (MCP-1: איור 2C, F, H; TNF-α: איור 2

דיון

תיארנו שיטה להחלת גירוי מכני כמו עיסוי, הכולל אפקטים אנטי דלקתיים. למערכת שלנו יש יתרונות גם בהשוואה לאלה שדווחו קודם לכן. ראשית, מחקרים קודמים לא להגדיר את הכוחות המכניים להחיל² או מוגדר גניטודות שלהם על בסיס המדידה על פני הגוף, אבל לא בתוך הרקמות¹⁰. לעומת זאת, מדדנו לחץ פנימי שרירי באמצעות טלמטר לחץ דם. שנית, את המבנה הפשוט של המכשיר שלנו (איור 1B) איפשר לנו לבנות את המערכת עם עקביות גבוהה והתוכסות (איור 3a) בעלו...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
חוט אלומיניום	DAISO JAPAN	B028	חוט אלומיניום משמש כדי למנוע בריחה מהגבלה על ידי החוט
טלמטר לחץ דם	Millar	SPR-671	טלמטר לחץ דם משמש למדידת לחץ תוך שרירי.
DAPI	Thermo Fisher Scientific	D1306	DAPI הוא בדיקה פלואורסצנטית המשמשת בדרך כלל לצביעה של DNA למיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
אנטי-ארנב עיזים Alexa Fluor 488 (יחס דילול, 1:500)	Invitrogen	A11034	נוגדן לצביעה אימונוהיסטוכימית.
עז נגד חולדות Alexa Fluor 568 (יחס דילול, 1:500))	Invitrogen	A11077	נוגדן לצביעה אימונוהיסטוכימית.
תוכנת ניתוח ImageJ	NIH	N/A	עבור מעבדת תמונהמעבדתChart8
	ADInstrumens		תוכנת אנליזה לרכישת אותות ביולוגיים
זהב פרולונג	תרמו פישר מדעי	P36930	זהב פרולונג מיועד להרכבת דגימות מוכתמות.
בלוק חלבון ללא סרום	Dako	X090930-2	לחסימת צביעת רקע לא ספציפית בהליכים אימונוהיסטוכימיים.
נוגדן חד שבטי נגד למינין-2 של חולדה (יחס דילול, 1:1000)	Sigma Aldrich	L0663	נוגדן לצביעה אימונוהיסטוכימית.
נוגדן חד שבטי נגד F4/80 של חולדה (יחס דילול, 1:500)	Abcam	ab6640	נוגדן לצביעה אימונוהיסטוכימית.
נוגדן אנטי-MCP-1 פוליקלונלי של ארנב (יחס דילול, 1:1000)	Abcam	ab25124	נוגדן לצביעה אימונוהיסטוכימית.
נוגדן אנטי-TNF-&אלפא רב-שבטי ארנב (יחס דילול, 1:1000)	Abcam	ab66579	נוגדן לצביעה אימונוהיסטוכימית.
סרט כירורגי	3M Japan	1530EP-0	סרט כירורגי משמש להגבלת תנועת המפרקים.