מאמר שיטה

באמצעות תא גזע המושרה האדם Pluriפוטנטי-המעי הנגזר אורגנואידים ללמוד ולשנות את התא אפיתל הגנה מפני סלמונלה ופתוגנים אחרים

DOI:

10.3791/59478

⸱

12 במאי 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Wellcome Trust Sanger Institute, 2Department of Medicine, University of Cambridge, 3University of Cardiff

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תא גזע הנגרמת על ידי האדם (היפנוסק)-המעי הנגזר אורגנואידים להציע הזדמנויות מרגש למודל בידור מחלות מבחנה. אנו להדגים את הבידול של hiPSCs לתוך מעיים אורגנואידים (iHOs), גירוי של iHOs אלה עם ציטוקינים, ואת המיקרוהזרקה של סלמונלה typhimurium לתוך לומן ihos, המאפשר לימוד של הפלישה אפיתל על ידי זה פתוגן.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המעי ' אורגנואיד ' (iHO) מערכת, שבו 3-D מבנים נציג של רירית האפיתל של הבטן האנושית ניתן לייצר מתאי גזע המושרה האדם pluripotent (hiPSCs) ונשמר בתרבות, מספק הזדמנות מרגשת להקל מידול של תגובת האפיתל לזיהומים חיטוט. ב vivo, תאים אפיתל המעי (IECs) לשחק תפקיד מפתח בוויסות הומאוסטזיס מעיים והוא עשוי לעכב באופן ישיר פתוגנים, למרות המנגנונים שבהם זה מתרחש אינם מובהר לחלוטין. ציטוקינים interleukin-22 (IL-22) הוכח לשחק תפקיד תחזוקה והגנה של המכשול האפיתל הבטן, כולל גרימת שחרור של פפטידים מיקרוביאלית ו נוגדנים בתגובה לזיהום.

אנו מתארים את הבידול של שליטה בריאה hiPSCs לתוך iHOs באמצעות תוספת של שילובים ציטוקין ספציפיים למדיום התרבות שלהם לפני הטבעה אותם לתוך מערכת קרום המרתף מבוססי מטריקס מבוסס התרבות prointestinal. לאחר ההטבעה, ihos גדלים בתקשורת בתוספת עם הראש, R-החתן-1, מקדם גידול באפידרמיס (egf), CHIR99021, פרוסטגלנדין E2, ו-Y-27632 דיהידרוטסטוסטרון מונוגיאני. קטעים שבועיים על ידי שיבוש ידני של מבנה האולטרה של iHO להוביל היווצרות Iho מודגשים, עם כמה המציגות מבנה קריפטה/ויליוס. כל iHOs להדגים האפיתל הבדיל המורכב של התאים כד, תאים enteroאנדוקריניים, תאים Paneth, ו מקוטב enterציטים, אשר ניתן אישר באמצעות מכתים של סמנים ספציפיים של כל קבוצה תא, הילוכים אלקטרון מיקרוסקופ (TEM), ו-PCR כמותי (qPCR). כדי ליצור מודל זיהום, סלמונלה בידור Serovar TYPHIMURIUM SL1344 הם microinjected לתוך לומן ihos ו-דגירה עבור 90 דקות ב 37 ° c, ו שונה הגנה gentamicin שיטת מבוצעת כדי לזהות את רמות של תאיים . פלישה חיידקית כמה iHOs מטופלים גם עם רקומביננטי האדם IL-22 (rhIL-22) לפני זיהום כדי לקבוע אם ציטוקין זה הוא מגן מפני זיהום סלמונלה .

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בשנים האחרונות, המחקר של האינטראקציות המארחים הפתוגן שופרה על ידי פיתוח של "אורגאיד" מודלים, שבו 3-D ייצוגים של אפיתל המעי יכול להיות מופק ושלתי שונים. ארגון ' ראשי ' אורגנואידים ניתן ליצור ישירות מתאי גזע המעיים שנקטפו ביופסיה מעיים. בנוסף, ניתן להפיק את המעיים מhiPSCs. אותו ניתן לומר על רקמות רבות, עם קיבה1, הכבד2, הלבלב3,4, המוח5,6, ריאה7, ו הערמונית8 אורגנואידים בשימוש על ידי חוקרים רבים למודל מחלה. ישנם יישומים מרגשים רבים של מערכת ארגונית, כולל מידול סרטן9 וסמים ההקרנה10, אבל כאן אנו מתמקדים בשימוש ihos כמודל זיהום, באמצעות S. בידור ומים. Typhimurium) כפתוגן למופת וטיפול מקדים עם IL-22 כטיפול.

במחקר זה, hiPSCs השתמשו כדי לייצר iHO הם ' Kolf2 ' iPSCs, שנוצר מן הפרט בריא זמין מן האדם המושרה Pluripotent תאי גזע היוזמה הארגון (היפנוsci; www.hipsci.org), גישה לפתוח פאנל התייחסות מאופיין . קווי היפסק11 אחד היתרונות של שימוש hiPSCs as ושלתי עבור אורגנואידים הוא כי יש עכשיו בנקים נרחבים של התורמים iPSC בריא שורות זמין, כלומר תוצאות ניתן לאמת במספר קווי תאים עם רקעים גנטיים שונים. בנוסף, החוקרים רוצים להסתכל על מחלות ספציפיות הקשורים נוקלאוטיד בודד פולימורית (SNPs), אפשר להשתמש CRISPR/Cas9 כדי מוטציות מהנדס קו התא בריא, ובכך לייצר גם קו מוטציה ושמירה על האיזוגניים שורת הבקרה להשוואה12. בניסיון שלנו, המעי הנגזר אורגנואידים מעיים הם גדולים יותר מאשר עמיתיהם העיקריים שלהם עקבי יותר בתרבות, ביצוע עבור מיקרו פחות מאתגרת מבחינה טכנית ומאפשר מגוון מגוונת יותר של פתוגנים להיות למד. iHOs ניתן לשמור באופן בתולי, ואנו הופץ תרבויות Ihos עד שנה כדי לייצר חומר לניסויים.

ב vivo, IECs לשחק תפקיד מפתח בוויסות הומאוסטזיס מעיים והוא עשוי לעכב ישירות פתוגנים, למרות המנגנונים שבהם זה מתרחש לא הבינו היטב. ציטוקינים IL-22 ידוע כי יש תפקיד בתחזוקת המכשול האפיתל הבטן13 והוא מעורב אינדוקציה הפרשה של פפטידים מיקרוביאלית ו נוגדנים בתגובה זיהום14. הוא מופק על ידי מופעל תאי T (במיוחד, Th17 תאים) כמו גם על ידי הרוצח הטבעי (NK) תאים ונקשר לקולטן heterodimeric מורכב IL-22R1 ו IL-10R2 תת יחידות משנה15. הקולטן ל-IL-22 מתבטאת ב-IECs, כלומר במודל iHO, ניתן לטפל מראש באורגנואידים עם rhIL-22 פשוט על-ידי תוספת לתרבות בינונית16. חיסרון אחד של מערכת ארגונית היא כי הוא חסר את התגובה החיסונית המשויכת בדרך כלל מועברת על ידי סוגים אחרים של תאים חיסוניים; עם זאת, מודלים מתגלים כי לנסות מארגני התרבות עם לימפוציטים מעיים כדי לייצג טוב יותר זה17,18.

השימוש במערכת מיקרוהזרקה הוא המפתח להדמיית זיהומים במודל iHO, מאז זה מאפשר משלוח ישיר של פתוגנים למשטח האפיפיורי של האפיתל, כפי שהתרחש במקרה של זיהום vivo. התוספת של פנול אדום לפתרון חיידקי מוזרק לתוך iHO מסמן את אלה שנדבקו, ובכך הימנעות זריקות חוזרות של אותו iHO. אורגנואידים כמו כלי מידול זיהום גדלים בשימוש, עם פתוגנים כגון הליקובקטר פילורי,19 norovirus,20 rotavirus,21 shiga הרעלן הפקת es, המאבכיה קולי22, Cryptosporidium23, וירוס zika24 הוכח לשרוד ולשכפל בתוך מערכות אלה. טכנולוגיה זו יכולה להיות מיושם על מגוון רחב יותר של פתוגנים, במיוחד לאורגניזמים כי הם קשים לתרבות, כגון פרוטותים, או פתוגנים האדם המוגבל, על מנת לקבל מידע ישיר על תגובת האפיתל האנושי לזיהום.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. culturing ו פאסאייג ' של תאי גזע המושרה פלאוריטי

הערה: כל השיטות המתוארות כאן משתמשות בקווי תאים אנושיים פנויים מסחרית. כל התרבות רקמה לעבוד מפורט להלן צריך להיעשות ב מחלקה II כיסוי הזרימה לבינארי. iPSCs מתוחזקים באופן שגרתי במדיום התרבות תא גזע (לראות את הטבלה של חומרים), לפי הוראות היצרן, אשר מאפשר תרבות חינם בסוף השבוע של iPSCs. iPSCs ניתן להתאים ממערכות אחרות של התרבות iPSC בקלות יחסית.

  1. העבר את התאים ברגע שמושבות מכסות כ-80%-90% ממשטח הצלחת.
  2. להכין צלחות עבור מעבר 1 h לפני השימוש על ידי הוספת vitronectin 10 μg/mL מדולל במלח פוספט באגירה של דולבקה (DPBS; ללא סידן [Ca] או מגנזיום [Mg]) לצלחות רקמה-תרבות מטופלים. אמצעי האחסון לציפוי תלויים בגודל הצלחת וניתן למצוא אותם בהוראות היצרן. במהלך זמן זה, התרבות תא גזע חם בינונית לטמפרטורת החדר (RT).
  3. הסר את המדיה מ iPSCs מוכן למעבר ולשטוף את התאים 2x עם DPBS (ללא Ca או Mg).
  4. הוסף פתרון EDTA (לראות את הטבלה של חומרים) על לוחיות, וודא את פני השטח כולו מצופה ו-דגירה ב RT עבור 5 – 8 דקות. כאשר החורים מתחילים להופיע במרכז המושבות iPSC, להשליך ולמחוק את פתרון EDTA.
  5. הוסף מדיום תרבות תא גזע לבארות; להוציא את הiPSCs על ידי שטיפת מדיה בעדינות על פני השטח כמה פעמים. IPSCs הם הפסנים כגושים ולא כמו תאים בודדים, לכן ודא כי פתרון EDTA לא נשאר במשך זמן רב מדי. הזיזו את כל iPSCs החוצה לשפופרת חרוט של 15 מ ל.
  6. מפחית את הvitronectin מן צלחות מצופה ולהחליף אותו עם תאי גזע בינוני התרבות. היפוך iPSC ההשעיה מספר פעמים כדי לוודא iPSCs לא התיישבו בחלק התחתון של צינור החרוט, ולהוסיף את נפח ההשעיה המתאים לתת 1:10 דילול של תאים על צלחת חדשה. יחסי פיצול עשויים להיות מותאמים בהתאם לקצב הצמיחה iPSC, אשר עשוי להשתנות בין קווי iPSC.
  7. סלע צלחת לפזר את iPSCs על פני השטח ולמקם אותו בחממה ב 37 ° צ'/5% CO2. האכילו את הiPSCs יום לאחר הפסעות.

2. בידול מiPSCs לתוך הבטן

  1. ביום 0, לפצל את iPSCs על מאכל 10 ס מ רקמות-תרבות, מצופה מראש עם vitronectin כפי שמתואר בשלב 1.2, לתוך 10 מ ל של התרבות תא גזע בינונית בתוספת הפעילות (10 Ng/ml) + בסיסי הצמיחה פיברוהפיצוץ גורם (bFGF; 12 Ng/ml). הוסף את גורמי הגדילה למדיה ישירות לפני השימוש; עשות זאת בכל השלבים הבאים.
  2. ביום 1, לשנות את המדיה (10 מ ל של מדיום התרבות תא גזע עם הפעילות A [10 Ng/ml] + bFGF [12 Ng/mL]).
  3. ביום 2, להתחיל את הבידול על ידי שינוי המדיה ל 10 מ ל של התרבות תא גזע בינונית בתוספת עם גורמי הצמיחה הבאים: הפעילות A (100 Ng/ml), bFGF (100 Ng/ml), עצם חלבון מורפולגנטיקה 4 (BMP-4; 10 Ng/mL), פוספהואינוסיטול 3- LY294002 מעכב קינאז (10 μM), ו GSK3 מעכבי CHIR99021 (3 μM).
  4. ביום 3, לשנות את המדיה ל 10 מ ל של התרבות תא גזע בינוני בתוספת הפעילות (100 Ng/ml), bFGF (100 Ng/ml), BMP-4 (10 Ng/mL), ו LY294002 (10 μm). מפרט העור הנגרמת על ידי מדיה זו צריך לגרום לשינויים גלויים במבנה המושבה iPSC במשך 24 ה ' הבא.
  5. ביום 4, לשנות את המדיה ל 10 מ ל של RPMI/B27 מדיה בתוספת הפעילות (100 Ng/ml) ו bFGF (100 Ng/ml).
    הערה: RPMI/B27 מדיה מכיל 500 mL של RPMI בינוני עם תוסף L-גלוטמין (ראה טבלה 1), 10 מ ל של B27 תוספת (50x, סרום חופשי), ו 5 מ ל של חומצות אמינו לא הכרחי. אופציונלי: להוסיף 5 מ ל פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL). מסנן לחטא לפני השימוש.
  6. ביום 5, לשנות את המדיה ל 10 ML של RPMI/B-27 מדיה בתוספת הפעילות A (50 Ng/mL).
  7. ביום 6, כדי להתחיל לפתוח את העור הטיפולי האחורי לבטן, לשנות את המדיה ל 10 מ ל של RPMI/B27 מדיה בתוספת CHIR99021 (6 μm) + חומצה retinoic (3 μm).
  8. בימים 7, 8, ו -9, חזור על שלב 2.7. במהלך שלבים אלה, מבנים תלת-ממדיים גלויים של הבטן הזאת צריכים להיות גלויים, המכסים את פני השטח של הצלחת.
  9. ביום 10, להטביע את התוצאה המתקבלת בתוך מטריצת קרום המרתף (לראות את הטבלה של חומרים).

3. הטבעה של החלק הקדמי של מטריצת ממברנה במרתף

  1. להפוך את iHO בסיס צמיחה מדיה (500 mL של מתקדם בינונית הנשר שונה של Dulbecco [DMEM]/F12, 10 מ ל של תוספת B27 [50x, סרום חינם], 5 מ ל של תוספת N2 [100x, סרום חינם], 5 מ ל של 1 M 4-(2-הידרולוקסיל) -1-piperazinefonic חומצה (HEPES), ו-5 מ ל של חומצות אמינו לא חיוניות [100x]. אופציונלי: להוסיף 5 מ ל של פניצילין-סטרפטומיצין [10,000 U/mL]; לעקר סינון לפני השימוש. ראה טבלה 1).
  2. הסר את המדיה מלוחית הבטן, ושטוף את הצלחת 1x עם DPBS (ללא Ca או Mg). הוסף 5 מ ל של תמיסת קולגן הפתרון לצלחת ו דגירה ב 37 ° c עבור 5 דקות.
    1. התוצרת הקולגן הפתרון על ידי הוספת 500 מ"ג של קולגן העירוי אבקת IV כדי 400 mL של DMEM מתקדם/F12. לאחר מכן, להוסיף 100 mL של החלפת סרום (לראות את הטבלה של חומרים), 5 מ ל של L-גלוטמין (200 mM), ו 3.5 μl של 2-mercaptoethanol, ו מערבולת את הפתרון כדי לערבב. מסנן-לחטא את הפתרון פעם אחת אבקת הקולגן הוא התפרקה לחלוטין.
      הערה: ניתן לאחסן את הדבר ב-20 ° צ' עד 6 חודשים בלבד.
  3. הפוך את הקולגן על ידי הוספת 5 מ ל של iHO מדיה צמיחה הבסיס לצלחת ולגרד את התאים השבטן באמצעות מגרד התא, איסוף ההשעיה המלא בתוך 15 מ"ל צינור חרוט.
  4. צנטריפוגה ב 240 x g עבור 1 דקות ופיפטה מחוץ לסופרנטאנט.
  5. הוסף 10 מ ל של מדיה, לשבור את הבטן לחתיכות קטנות יותר על ידי ליטוף בעדינות, ו צנטריפוגה שוב ב 95 x g עבור 1 דקות.
  6. לשטוף את התאים 2x ב iHO מדיה גדילה בסיס על ידי חוזר שלב 3.5. השהה מחדש את התאים בנפח קטן של בסיס גידול בסיסי (~ 300 – 500 μL) ולהוסיף סביב 100 μL של פתרון זה כדי 1.5 mL של מטריצה קרום המרתף. המטריצה חייבת להישאר על הקרח במהלך הזמן הזה, כפי שהוא יתחיל לחזק במהירות ב-RT.
  7. הגדרת צלחת 24-באר על תנור לוחית בשעה 37 ° צ' ובמקום 60 μL לתוך הבאר אחת של הצלחת 24. אפשר לו לקבוע לזמן קצר ולבדוק את הצפיפות מתחת למיקרוסקופ.
    1. במקרה הצורך, הוסיפו את הפתרון האחרון למטריצת הממברנה בתוך המרתף, עד להשגת הריכוז הרצוי, ובדי לזהות את הפתרון לבארות הנותרות.
  8. מודטה ב 37 ° c עבור 10 דקות; לאחר מכן, להוסיף 800 μL של iHO בסיס צמיחה מדיה המכילה גורמי גדילה לכל טוב של הצלחת 24-באר בריכוזים הבאים (ראה שולחן 1): 500 Ng/ml R-החתן-1, 100 Ng/ml ראש, 100 Ng/ml מקדם צמיחה באפידרמיס (egf), 3 ΜM CHIR99021, 2.5 μm פרוסטגלנדין E2, ו 10 μm Y-27632 דיהידרוטסטוסטרון (מעכבי סלע).
  9. שנה את מדיית הגדילה הבסיסית של iHO כל 2 – 3 ימים, או מיד אם המדיה מתחילה לטשטש. לאחר הזריעה הראשונית לתוך מטריקס קרום המרתף, לאפשר iHOs להתפתח 7 ימים לפני פיצול אותם. ביום 3 – 4, כדורים נפרדים צריכים להיות גלויים בתרבות.
    1. לשינוי מדיה בלבד, השמט את Y-27632, מכיוון שפעולה זו נדרשת רק בעת פיצול/זריעה.

4. אחזקה ומעבר של איהוס

  1. כדי לאפשר הפשרה הדרגתית, להוציא את הנפח הנדרש של מטריצת קרום המרתף בדלי קרח מכוסה ב 4 ° c לילה, 24 h לפני פיצול.
  2. הסר את המדיה מ iHOs ולהחליף אותו עם 500 μL של פתרון הרמת התאים (לראות את הטבלה של חומרים) לכל טוב. דגירה ב 4 ° צ' עבור 40-50 דקות, ובשלב iHOs צריך להיות צף בפתרון.
    1. אופציונלי: השתמש במערכת הדמיה במכסה המנוע כדי לבחור iHOs בלבד עם המבנה הרצוי (עיין בטבלת החומרים).
  3. בעדינות פיפטה את iHO/תא הרמת פתרון הבולם ל 15 מ ל צינורות חרוטי, מנסה לא לשבור את Iho. אפשר ל-IHOs להתיישב במשך 3 – 5 דקות ולהסיר את התאים החד והיחידים.
  4. להשעות את iHOs ב 5 מ ל של Ihos בינוני צמיחה בינונית ופיפטה אותם בעדינות כדי לשטוף. צנטריפוגה ב 95 x g עבור 2 דקות.
  5. הגדר צלחת 24-באר על תנור לוחית ב 37 ° c בתוך מכסה המנוע.
  6. הסר את הסופרנטאנט והשהה מחדש את iHOs ב ~ 300 – 500 μL של מדיית גדילה בסיסית, באמצעות P1000 לשבור את iHOs לחתיכות קטנות יותר. שים לב כי הכוח שצריך להיות מיושם שונה תלוי בשורה iHO והתבגרות המדינה, אז להתחיל בעדינות, להגדיל את הכוח אם נדרש.
  7. מקום ~ 100 μL של iHOs (אמצעי האחסון תלוי בצפיפות של הפתרון) לתוך 1.5 mL של מטריצה קרום המרתף ואת הפיפטה לזמן קצר כדי לערבב.
  8. ספוט 1 x 60 μL של מטריצה קרום המרתף לבאר אחת של הצלחת 24-הבאר, להשאיר אותו לגבש עבור ~ 30 s, ולאחר מכן לבדוק את הצפיפות תחת המיקרוסקופ. אם הצפיפות נמוכה מדי, הוסף iHOs נוספים למטריצה.
  9. חזור על שלב 4.8 עד להשגת הדחיסות הנכונה ולאחר מכן החלק את שאר המטריצה לצלחת של 24 שעות ביממה.
  10. מניחים אותו בחממה ב 37 ° c עבור 10 דקות ולאחר מכן, כיסוי זה עם 800 μL של בסיס צמיחה בינונית עם גורמי צמיחה, כפי שמתואר בשלב 3.7.
  11. כדי להכין את iHOs עבור ניסוי שיטת הפלישה (המתואר להלן), מעבר iHOs 4 – 5 ימים לפני הניסוי כפי שמתואר בשלבים 4.1 – 4.10, אבל מקום 120 μL של הפתרון Ihos מטריקס שנוצר בשלב 4.7 לתוך 5 מ"מ זכוכית תחתית מנות מיקרו הזרקה.
    1. במקום להשאיר את ההשעיה של iHO ב-droplet כמו עם מעבר שגרתי, הפיצו את ה-droplet מעל החלק התחתון של המנה כדי ליצור שכבה דקה של מטריקס. כסו אותו עם 2.5 mL של בסיס צמיחה בינונית ועוד גורמי גדילה.
      הערה: אם אנטיביוטיקה נעשה שימוש במדיום התרבות, אלה חייבים להיות מוסרים והוחלף עם מדיה בתוספת שאינם אנטיביוטיים לניסויים מיקרו הזרקה.

5. הPrestimulation של איבין עם rhIL -22

  1. מתיף את התקשורת מן iHOs ולהחליף אותו עם מדיה צמיחה בסיס טרי (אשר חייב לא להכיל אנטיביוטיקה) 18 h לפני שיטת הפלישה.
  2. הוסף rhIL-22 למדיה תרבותית לריכוז סופי של 100 ng/mL.

6. מיקרוהזרקה של iHOs והפלישה התאיים

  1. . ביום שלפני הניסוי, הגדרת אס התרבות הSL1344 מועלת בשנת 10 מ ל של מרק לוריא-ברגאני ומודטה ב-37 ° c לילה עם טלטול.
  2. ביום הניסוי, אם מיקרוסקופ עם תא חום סגור זמין, להדליק אותו ולאפשר לטמפרטורה להגיע 37 ° c לפני תחילת התשובה.
  3. לדלל תרבויות חיידקי לילה ב DPBS (המכיל Ca ו-Mg) לצפיפות אופטית של 2 ב 600 ננומטר (OD600) ולאחר מכן, לערבב אותו 1:1 עם אדום פנול.
  4. לטעון את הצלחת מיקרוהזרקה המכילה iHOs על הבמה המיקרוסקופ, להסיר את המכסה, ולהביא את iHOs לתוך המוקד, מוכן הזריקה להתחיל.
  5. הפעל את מזרק ותחנות בקרת הזרוע. ודא מזרק מוגדר לחץ של 600 kPa וזמן הזרקה של 0.5 s. אם הוא עדיין לא נסוג משלב המיקרוסקופ, לסובב את הזרוע הזריקה כדי לוודא שהוא.
  6. להגדיר טיפ 6 יקרומטר מקדח ההזרקה על ידי הסרת העטיפה ואת גליל פלסטיק מן המחט. הסירו את ראש האחיזה מזרוע הזריקה.
  7. טען את עצת המקדחה עם 10 μL של האירשת, מרתק את קצה המקדחה בעדינות בקצהו הקהה. מניחים את עצת המקדחה בראש האחיזה ומחברו אותו לזרוע המיקרוהזרקה.
  8. הזיזו בעדינות את הזרוע לתנוחה כך שהמחט ממוקמת 1 – 2 ס מ מעל לצלחת המיקרוהזרקה. השתמש בבקרת הזרוע כדי למקם את קצה המחט במרכז המנה ולהוריד אותה עד שהיא נמצאת ממש מעל פני השטח של המדיה.
    1. תוכנית בקרת זרוע להחזיר את המחט לנקודה זו לאחר כל הזריקות.
  9. למקד את המיקרוסקופ על iHOs ולבחור את היעד להזריק. מקמו את המחט בדיוק מעל ומימין iHO כדי להיות מוזרק ולהזיז את המחט כלפי מטה ולמטה לתוך iHO לומן.
  10. לחץ על כפתור ההכנסה על המיקרומזרק; תערובת החיידקים המוכתמת-פנול תצא מהמחט. הכנס כל iHO 3x. הכנס לפחות 30 iHOs לכל תנאי.
    הערה: בשל טרוגניות בגודל iHO ומבנה בתוך תרבות, יש צורך להזריק מספר גדול של Iho לשלוט על הווריאציה.
  11. כאשר כל iHOs נדרש מוזרק, להסיר את הצלחת מיקרוהזרקה מן הבמה, להחליף את המכסה, ו מודקת את הצלחת ב 37 ° c עבור 90 דקות.
  12. לאחר 90 דקות, מנושף את מדיית הצמיחה ומחליף אותו עם 3 מ ל של פתרון הרמת התאים; דגירה ב 4 ° צ' עבור 45 דקות.
  13. הזז בעדינות את הפתרון של iHOs/cell לצינור מנוע חרוט של 15 מ ל המכיל 5 מ ל של DPBS. ודא כי כל iHOs הוזרק הוסרו מן הצלחת (לשטוף את הצלחת עם 1 mL של DPBS אם נדרש). צנטריפוגה ב 370 x g עבור 3 דקות.
  14. הסר את הסופרנטאנט והשהה מחדש את iHOs במדיית הגדילה הבסיסית המכילה gentamicin ב-0.1 mg/mL (add 1 mL של מדיה; לאחר מכן, השתמש בP1000 הצינורות ~ 50x כדי לשבור את iHOs, ולהוסיף 4 מ ל של מדיה נוספת).
  15. דגירה ב 37 ° צ' עבור 1 h כדי להרוג חיידקים מסחטות.
  16. צנטריפוגה את iHOs ב 370 x g עבור 3 דקות ומכה את סופרנטאנט, ומשאיר מעט ככל האפשר. שטוף את ה-iHOs 1x עם. ה-DPBS והצנטריפוגה שוב
    הערה: צעד זה מסיר gentamicin, אשר חשוב כמו כל gentamicin הנותרים עלול להרוג חיידקים תאיים פעם התאים הם לאחר.
  17. להשעות את iHOs ב 500 μL של מאגר הליזה (לראות את הטבלה של חומרים) ובאופן ידני לנתק את האורגנואידים על ידי ליטוף ~ 50x. השאר את התערובת במשך 5 דקות בשעה RT.
  18. סרילית לדלל את הפתרון שהתקבל 10-קיפול ב DPBS כדי ליצור 10-1, 10-2, ו 10-3 ריכוזי. פיפטה 3 x 20 μL טיפות של פתרונות מסודר ומדולל על צלחות LB מראש אגר.
  19. המלון משלב בין לילה ב-37 ° c ומבצע ספירת מושבה וחישוב של יחידות המושבה היוצרות (CFU). ספירות המושבה תשקף את מספר החיידקים התאיים שפורסמו במהלך תהליך לישישר התאים.

7. תא הקפאה ושחזור

הערה: כפי שצוין קודם לכן, ניתן לשמר את iHOs בצורה מחודשת וליצור אותם מחדש בעת הצורך. תהליכי ההקפאה והפשרה מתוארים להלן.

  1. בחר את הבארות של iHOs שברצונך להקפיא. הוסף פתרון להרמת תאים לבארות ולדגירה של 40 עד 50 דקות ב-4 ° c. . האיטים אמורים לרחף בתמיסה
  2. מנקז בעדינות את האיהוס לתוך שפופרת של 15 מ"ל ולאפשר להם להתיישב. הסר את המדיה ושטוף את iHOs 1x עם מדיית גדילה בסיסית (ללא גורמי גידול).
  3. צנטריפוגה ב 95 x g עבור 2 דקות, להסיר את supernatant, ולהחליף אותו עם כמות מתאימה של תא הקפאה בינונית (לראות את הטבלה של חומרים; השתמש במדיום לפי הוראות היצרן), בקבוקי ihos לתוך מבחנות קריוגניים.
    1. לאחסן את הבקבוקונים ב-80 ° c מקפיא בלילה כדי לאפשר קיפאון הדרגתי יותר; לאחר מכן, להעביר אותם לאחסון חנקן נוזלי.
  4. כדי ליצור מחדש את iHOs, להפשיר במהירות בקבוקון קריוגני ב 37 ° צ' באמצעות אמבט מים/חרוז; אז, בעדינות פיפטה את תוכנו ל 10 מ ל של הבסיס מדיה צמיחה (אין גורמי גדילה). אפשר ל-iHOs ליישב ולהחליף את המדיה באמצעות ~ 300 μL של מדיית גדילה בסיסית טרייה.
    1. אין לנתק באופן ידני את iHOs. הוסף iHOs לתוך מטריצת קרום המרתף ולוחית אותם כמתואר בסעיף 3.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעקבות תחילת תהליך הבידול, התאים צריכים לעבור דרך השלב של היווצרות שורש העור הסופי ולאחר הטבעה של המעיים לפני ההטבעה לתוך מטריצת קרום המרתף. Spheroids יהיה ליצור ותרבויות עם כמויות גדולות של חומר מזהם יהיה ברור לאורך תקופה של שבועות אחדים כמו iHOs בוגרת. תמונות מצולמות של תהליך הבידול, ההטבעה והפסנה מוצגות באיור 1.

הכיוונון של מערכת מיקרוהזרקה הוא כפי שמתואר באיור 2. IHOs מוזרקים עם התמיסה אדום/חיידקי פנול ולשמור על הצבע האדום שלהם, המאפשר זיהוי של iHOs נגועים כדי למנוע זריקות כפולות. ספירות של חיידקים תאיים מצופה מבוצעים בעקבות הgentamicin שונה ההגנה הגנה; prestimulation עם rhIL -22 מגביל את ה-S. זיהום typhimurium, עם חיידקים פחות תאיים שנצפו בעקבות הטיפול rhIL-22 (איור 3). כמו כן, אנו מעבדים באופן שגרתי iHOs נגועים לעיבוד חיסוני, או TEM, על מנת להקל על ההדמיה של אינטראקציות IEC-בקטריאלי מארחים (איור 4).

figure-results-1
איור 1: בידול של iPSCs To iHOs. רצף מייצג של בידול מ iPSCs to iHOs, הוכחת שינויים מורפולוגיים נצפתה ואת גורמי הצמיחה הנדרשים לנהוג בשינויים אלה. האנדופופיל סופי נוצרת ביום 4 של הבידול, בעקבות חשיפה לריכוזים ספציפיים של שילובים של הפעילות A, FGF, BMP-4, LY294002, ו CHIR99021. לאחר 8 ימים, את התמצית של זה האנדוקטית הסופית עם ריכוזים ספציפיים של חומצה CHIR99021 ו retinoic היווצרות במערך המעיים. הטבעה פוסט, היווצרות ספרואיד הוא נצפתה. לאחר פאסאייג ' מתמשכת באמצעות מטריקס התומך במרתף ממברנה מצופה עם בינוני בתוספת עם מרכיבי הפצת prointestinal R-החתן 1, ראש, EGF, CHIR99021, ו proסטגlandin E2, התקדמות המאנדאידים לתוך iHOs מודגש. (התמונות צולמו בהגדלה של 4x – 10x). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: מיקרוהזרקה של iHO עם S. . סוג של מוטיום (א) מערכת מיקרוהזרקה (ראו את טבלת החומרים) התחומה בחדר הסביבתי; זה מאפשר הזרקה של iHOs בסביבה מבוקרת (37 ° צ'/5% CO2). (ב) האירשת החיידקית מועברת ישירות לתוך לומן iho בעזרת מיקרונימים המחוברים למערכת המיקרו-הזרקה. (ג) על ידי ערבוב של חיידקים בקטריאליים עם אדום פנול, ברור אילו ihos נדבקו, ובכך הימנעות זריקות כפולות של אותו ihos. התמונות צולמו בהגדלה של 10 x. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: טיפול מקדים של iHOs נגזר מקו התא Kolf2 עם rhIL-22 מגביל את ה-S. הפלישה SL1344 typhimurium לתוך תאים אפיתל המעי. עבור gentamicin הגנה מוסר, iHOs טופלו עם 100 ng/mL rhIL-22 18 h לפני זיהום, או שמאל מטופל, ו מודגנה עבור 90 מינימום הזיהום. הנתונים משמעו שלושה משכפל טכני עבור שלושה משכפל ביולוגי. עבור בדיקות משמעותיות, בדיקות מאן-ויטני U שימשו; p < 0.0001. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: אינטראקציה של IECs עם S. Typhimurium. הפאנלים האלה מדגימים . " Typhimurium SL1344 ו מודב עבור 3 שעות, לפני קיבוע ועיבוד עבור (A) immunofluorescence או (ב) מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים. ב פאנל A, חיידקים נראים בתוך לומן iho ואינטראקציה עם האפיתל. גרעינים מוכתמים עם 4 ′, 6-diamidino-2-פנייילידול (DAPI) dilactate (כחול), ממברנות תא עם phalloidin (אדום), וחיידקים עם CSA-1 (ירוק). התמונות נלקחים בהגדלה של 20 x. פאנל B מדגים שלושה מסלולים העיבוד תאיים שונים של סלמונלה בעקבות הפלישה; חיידקים נראים (א) בתוך מכלול סלמונלההמכיל ולבן, (ב) חינם בתוך הציטופלסמה, ו (ג) שעברו שימוש אוטומטי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

RPMI/B27 מדיום
רכיבכמות
RPMI 1640 מדיה עם תוספת גלוטמין500 מ ל
B27 סרום ללא תוספת 50x10 מ ל
iHO בסיס גדילה בינוני
רכיבכמות
מתקדם _ זיכרון/F12500 מ ל
B27 סרום ללא תוספת 50x10 מ ל
N2 סרום-תוספת חינם 100x5 מ ל
היכל 1 M5 מ ל
ל-גלוטמין 200 מ"מ5 מ ל
גורמי גדילה לבסיס iHO בינונית צמיחה
רכיבכמות
רקומביננטי האדם R-spondin1500 ng/mL
רקומביננטי האדם האנושי100 ng/mL
מקדם גידול עוריות (EGF)100 ng/mL
פרוגלנדין E22.5 μM
CHIR990213 μM
י-27632 דיהידרוטסטוסטרון10 μM

שולחן 1: מתכוני מדיה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר את הבידול של hiPSCs לתוך ihos והשירות שלהם כמודל שבו כדי לדמות זיהומים חיטוט. להלן, אנו מתווה את השלבים הקריטיים בפרוטוקול ואת כל השינויים או השיפורים שעשינו.

פרוטוקול זה מייעל את תהליך הבידול של hiPSCs בהשוואה לעבודה שפורסמה בעבר25. שיטות ששימשו בעבר נדרשות העברת hiPSCs ממערכות תרבות אחרות (לדוגמה, תרבות היפנוציה תלוית המזין) למדיום המוגדר כימית-פוליוויניל אלכוהול (CDM-PVA). העברה זו ל-CDM-PVA בדרך כלל לוקח 2 – 3 שבועות ודורש האכלה יומית של hiPSCs. פרוטוקול זה גם לא היה אפקטיבי באופן עקבי, עם כמה הפסקות כושלות; לכן, אנו בידול באמצעות שימוש באותם גורמי גדילה אך החל ב-hiPSCs גדל בתווך התרבות תא גזע (ולא CDM-PVA) והחלפה של CDM-PVA עם מדיום התרבות תא גזע במהלך בידול בימים 0 – 3. זה כבר הצליח עבור חמשת הקווים העצמאיים היפנוסי הטריקו עד כה, מה שהופך את תהליך הבידול הרבה יותר מהירה ויעילה. זה גם מאפשר לסופשבוע חינם culturing של hiPSCs לפני בידול, המאפשר גמישות רבה יותר בתרבות היפנוסי. הקווים iHO המיוצר על ידי שיטה זו הוקלדה עבור סמנים של אפיתל המעי כפי שתיארנו בעבר את הקווים הKolf2, Yemz1, ו Lise116 ומופיעים פנופי בדרך כלל מן iho המיוצר באמצעות הקודם פרוטוקול.

בעקבות זריעה, iHOs דורשים לפחות 1 חודש של הפסעות שגרתית, עם פיצול כל 4 – 7 ימים כדי להקל על ההבשלה. שים לב כי יהיו כמה וריאציה בפיתוח iHO בהתאם לקו iPSC בשימוש ואת הצפיפות של התרבות הראשונית. במהלך המעברים הראשונים, יהיו מזהם תאים בעליל אשר אינם iHOs. אלה ימותו בסופו של דבר, להשאיר תרבות נקייה של כדורי,, לאחר כ 4 שבועות, iHOs בודלי. בנוסף, מערכת הדמיה במכסה המנוע ניתן להשתמש כדי לבחור ומעבר iHOs רק עם המבנה הרצוי. כמו iHOs בוגרת, הם ידרשו פיצול כל 6 – 7 ימים, תלוי בקצב צמיחה וצפיפות. אם אחד מהבאים להתרחש, iHOs צריך להתפצל לפני נקודה זו: חללים הלומיאל של iHOs מתחיל להתמלא עם תאים מתים, מטריקס קרום המרתף מתחיל להתפרק, iHOs מתחיל לצמוח מתוך מטריקס קרום המרתף, או התרבות היא גם צפוף והתקשורת מתחילה ללכת צהוב מהר מאוד.

לאחר הקמת תרבות iHO, אם בכל זמן הופעתו של Iho שינויים או שונה מהצפוי (למשל, התרבויות להישאר כדורית, ולא להנצה), פנוטיפים באמצעות אימונוהיסטוכימיה ו qPCR עבור סמנים תא צריך להיות חוזרות ונשנות כדי להבטיח כי הבידול של סוגי התאים בתוך iHOs (למשל, בתאי גביע, בתאי Paneth) נותר ללא פגע. אם iHOs כבר לא מבדיל, אז הם צריכים להיות מושלך מחדש או מעבר מוקדם יותר של iHOs צריך להיות מופכל ומחדש. אם iHOs לחדול להבדיל, הגורמים הפוטנציאליים הם גיל התרבות (אם זה מעל גיל 6 חודשים), את הפעילות של גורמי הצמיחה (להבטיח כי אלה מחדש לפי ההוראות של היצרנים והמשיך קפוא בעלי מידע קטנים כדי למנוע מחזורי הקפאת-הפשרה מרובים), מעברים תכופים מדי או אלימים (באופן כללי, passaging להתרחש רק פעם בשבוע, ואם iHOs הם הנתק באופן ידני מדי על בסיס קבוע, הם יפסיקו להבדיל במלואו).

הקמנו באמצעות רצפי RNA כי IL-22 גירוי 18 h לפני זיהום upregulates גנים מיקרוביאלית ואלה מעורבים ההגנה המכשול פנוטיפים. לפני השימוש ihso החדש עבור בחני מעורבים עם rhil-22 (או cy, חלופה חלופית אם המערכת היא בשימוש זה), מומלץ לבדוק את הפעילות של גנים ידוע להיות upregulated על ידי ציטוקינים (במקרה של IL-22 , השתמשנו DUOX2 ו LCN2) דרך qpcr לאחר גירוי של ihos, כדי להבטיח ביטוי הקולטן האיתות שלם. לפני השימוש הראשון של IL-22, אנו גם ביצעו אימונוהיסטוכימיה כדי לאתר את קולטן IL-22 על iHOs כדי לקבוע כי הביטוי של הקולטן IL-22 היה בסיס, כלומר prestimulation ניתן להשיג פשוט על ידי הוספת rhIL-22 לתרבות Ihos בינוני. עם זאת, אם מבוטא קולטן באופן מידי, ייתכן שפרוטוקול זה צריך להיות מותאם להעברת ליגניות באופן מקומי.

החסרונות בנוגע למערכת מיקרוהזרקה קשורים בדרך כלל לעדינות המחטים הדרושות להזרקה. כאן, אנו משתמשים עצות מסחריות זמין מקדחה עם לומן 6 יקרומטר. ניתן למשוך את מחטי ההזרקה מ נימים זכוכית26 למרות שזה עשוי להיות אחיד פחות, המוביל דליפות מן המחט עצה או כרכים לא עקביים להיות מוזרק ihos. חשוב להיות בטוח כי הזריקה התקיימה לתוך לומן iHO, שהיא אחת הסיבות לשימוש של פנול אדום כצבע; iHOs יהיה בעליל להרחיב ולהחזיק את האירשת האדום, המאפשר ודאות לגבי אילו הזריקו iHOs. מדי פעם מחטים יהיה לסתום עם פסולת מהקיר iHO; אם זה המקרה, להסיר את קצה המחט מתוך iHO ולחץ על כפתור נקי במערכת המיקרו הזרקה. זה יפיק תקופה קצרה של לחץ אוויר גבוה אשר צריך לנקות את החסימה. זה יהיה גם לגרום לדליפה כלשהי של החיידק החיידקי על הצלחת; לכן, אם זה קורה, יש לחזור על הפעולה הנקיה על כל הלוחות כדי להבטיח שוויון של בקטריות לכל צלחת. אחד היתרונות הגדולים של iHOs הנגזרים האלה הם גודלם. אורגנואידים מעיים מעכברים ואורגנואידים אנושיים הראשי הם הרבה יותר קטן (מדידה עד ~ 100 יקרומטר ו-100 – 300 יקרומטר, בהתאמה27, לעומת 250 – 1500 יקרומטר עבור ihos נגזר), כלומר זריקות של כמויות גדולות של אורגנואידים יהיה איטי יותר. זה מאפשר ניסויים הזרקה בקנה מידה גדול יותר להיות מנופח ב-iHOs נגזר של היפאס. ניתן גם ללמוד את תוכן הלומיאל של iHOs על ידי איסוף אותם פוסט זיהום ובאופן ידני הנתק iHOs לתוך DPBS, שחרור תוכן הלומיאל שלהם. להזרקת מיקרו, אנו ממליצים להשתמש בריכוז גבוה של חיידקים. מצאנו כי ריכוזים נמוכים לא היה מספיק כדי ליצור תגובה מתוך IECs הכוללת את iHOs. בנוסף, היה קשה לאתר את החיידק הפנפניי בעזרת מיקרוסקופ. האינוקולומס עשוי להיות ממוטב עבור זנים חיידקיים שונים.

לסיכום, הטיה-נגזר ihos לספק מודל מבטיח לבתר באופן ישיר את תגובת האפיתל לזיהומים חיטוט, אם על ידי לימוד הפלישה תאיים ספירות, הדמיה, מדידת רמות ציטוקין ב ihos supernatants, או קצירת RNA כדי ל ללמוד שינויים משתנים לאחר חשיפה לפתוגנים. השירות שלהם יהיה אפילו יותר ברור בעתיד להקמת מודלים זיהום עבור פתוגנים אנושיים מוגבלים וניצול האפשרויות של שימוש בטכנולוגיה זו כדי להתאים אישית את המחקר על ידי לימוד ספציפי מחלות הקשורות מוטציות גנטיות והתגובות לסמים.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכת על ידי מימון של "אמון ברוכים ה," קרן השערים ומרכז המחקר הביו-רפואי קיימברידג '. E.A.L. הוא סטודנט לדוקטורט קליני הנתמך על ידי הקרן.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM6250-10ML
5 מ"מ כלי הזרקת תחתית זכוכיתתאגיד MatTekP50G-0-14-F
מתקדם DMEM/F12Gibco12634010
Alexa fluor 647 phalloidinLife TechnologiesA22287שימוש בריכוז 1:1,000
תוסף B27 ללא סרוםLife Technologies17504044ריכוז מלאי פי 50, ריכוז סופי 1x
BMP-4 חלבון אנושי רקומביננטיR& DPHC9534ריכוז מלאי 10 μ גרם/מ"ל, ריכוז סופי 10 ננוגרם/מ"ל
תמיסת שחזור תאים (תמיסת הרמת תאים)BD354253
CHIR99021Abcam ab120890-5mgריכוז מלאי 3 מ"מ, ריכוז סופי 3 ומיקרו; M
קולגנאז, אבקה מסוג IVLife Technologies17104019להרכיב מחדש ב-0.1%
בקבוקונים קריוגנייםשל קורנינג430487
Costar TC מטופל ב-24 צלחות תרבית בארקורנינגCLS3527
DAPI דילקטטסיגמא-אולדריץ'D9564-10MGשימוש בריכוז 10 ננומטר
Dulbecco' s PBS (ללא MgCl2 או CaCl2)Life Technologies14190-144
Dulbecco' s PBS (עם MgCl2 ו-CaCl2)Sigma-AldrichD8662-100ML
גורם גדילה אפידרמיסR& D236-EG-200ריכוז מלאי 100 μ g/mL, ריכוז סופי 100 ננוגרם/מ"ל
Eppendorf TransferMan NK2 (מערכת מיקרו-הזרקה)Eppendorf920000011
Eppendorf Femtojet express  (מערכת מיקרו-הזרקה)Eppendorf5248 000.017
Essential 8 Flex medium kit (מדיום תרבית תאי גזע)Life TechnologiesA2858501
מערכת הדמיה EVOS XL (מערכת הדמיה בתוך מכסה המנוע)
GentamicinSigma-AldrichG1272-10MLריכוז מלאי 10 מ"ג/מ"ל, ריכוז סופי 0.1 מ"ג/מ"ל
עיזים נגד סלמונלה, CSA-1Insight Biotechnology02-91-99שימוש בריכוז 1:20
HEPES 1 MLife Technologies15630056
החלפת סרום נוקאאוט (החלפת סטרום)תוסף Gibco10828010
GlutaMAX (תוסף גלוטמיןThermoFisher
L-glutamineLife TechnologiesA2916801ריכוז מלאי 200 מ"מ, ריכוז סופי 2 מ"מ
LY294002Promega UKV1201ריכוז מלאי 50 מ"מ, ריכוז סופי 10μ M
Matrigel, GFR, ללא פנול (מטריצת ממברנת הבסיס)קורנינג356231
חומצות אמינו לא חיוניות MEM  תמיסה (100x)תוסף תזונה ללא סרום Gibco11140035
N2LifeTechnologies 17502048 ריכוז מלאי 100x, ריכוז סופי 1x
פניצילין-סטרפטומיציןLife Technologies15140163ריכוז מלאי 10,000 U/mL, ריכוז סופי 100 U/mL
פנול אדוםSigma-AldrichP0290-100ML
עכבר מקדחה פייזו ICSI, זווית קצה 25& מעלות, 6 ומיקרו; m קוטר פנימיEppendorf5195000087
Prostaglandin E2SigmaP0409-1MGריכוז מלאי 2.5 מ"מ, ריכוז סופי 2.5 מ"מ
FGF אנושי רקומביננטיR& D233-FB-025ריכוז מלאי 100 μ גרם/מ"ל, ריכוז סופי 100 ננוגרם/מ"ל
רקומביננטי אנושי IL-22מו"פ D6057-NG-100ריכוז מלאי 100 μ גרם/מ"ל, ריכוז סופי 100 ננוגרם/מ"ל
אנושי רקומביננטי D6057-NG-100ריכוז מלאי 100 μ גרם/מ"ל, ריכוז סופי 100 ננוגרם/מ"ל 
R-ספונדין אנושי רקומביננטי1מו"פ D4645-RS-025ריכוז מלאי 25 מ"ג/מ"ל, ריכוז סופי 500 ננוגרם/מ"ל
רקומביננטי אדם/עכבר/חולדה Activin AR& D338-AC-050ריכוז מלאי 100 μ גרם/מ"ל, ריכוז סופי 100 ננוגרם/מ"ל
מדיום הקפאת תרבית תאים התאוששות (מדיום הקפאת תאים)Gibco12648010
חומצה רטינואיתסיגמא-אולדריץ' R2625-50MGריכוז מלאי 3 μ M, ריכוז סופי 3 מ"מ
RPMI 1640 מדיה עם תוסף גלוטמקס (RPMI Medium עם תוסף L-גלוטמין)Life Technologies61870010
Triton X-100 (מאגר ליזה תאית)Sigma-AldrichRES9690T-A101Xשימוש בריכוז 1%
Versene (תמיסת EDTA)Life Technologies15040066
Vitronectin XFStemcell Technologies 7180
Y-27632 דיהידרוכלוריד מונוהידראטסיגמא-אולדריץ'Y0503-1MGריכוז מלאי 3 מ"מ, ריכוז סופי 10 מ"מ
מו"פ

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
  2. Huch, M., Boj, S. F., Clevers, H. Lgr5(+) liver stem cells, hepatic organoids and regenerative medicine. Regenerative Medicine. 8 (4), 385-387 (2013).
  3. Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. The EMBO Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).
  4. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  5. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  6. Mariani, J., et al. Modeling human cortical development in vitro using induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (31), 12770-12775 (2012).
  7. Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. eLife. 4, (2015).
  8. Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
  9. Matano, M., et al. Modeling colorectal cancer using CRISPR-Cas9-mediated engineering of human intestinal organoids. Nature Medicine. 21 (3), 256-262 (2015).
  10. Ogawa, M., et al. Directed differentiation of cholangiocytes from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 33 (8), 853-861 (2015).
  11. Leha, A., et al. A high-content platform to characterise human induced pluripotent stem cell lines. Methods. 96, 85-96 (2016).
  12. Drost, J., et al. Sequential cancer mutations in cultured human intestinal stem cells. Nature. 521 (7550), 43-47 (2015).
  13. Schreiber, F., Arasteh, J. M., Lawley, T. D. Pathogen Resistance Mediated by IL-22 Signaling at the Epithelial-Microbiota Interface. Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3676-3682 (2015).
  14. Sabat, R., Ouyang, W., Wolk, K. Therapeutic opportunities of the IL-22-IL-22R1 system. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (1), 21-38 (2014).
  15. Kotenko, S. V., et al. Identification of the functional interleukin-22 (IL-22) receptor complex: the IL-10R2 chain (IL-10Rbeta ) is a common chain of both the IL-10 and IL-22 (IL-10-related T cell-derived inducible factor, IL-TIF) receptor complexes. Journal of Biological Chemistry. 276 (4), 2725-2732 (2001).
  16. Forbester, J. L., et al. Interleukin-22 promotes phagolysosomal fusion to induce protection against Salmonella enterica Typhimurium in human epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (40), 10118-10123 (2018).
  17. Nozaki, K., et al. Co-culture with intestinal epithelial organoids allows efficient expansion and motility analysis of intraepithelial lymphocytes. Journal of Gastroenterology. 51 (3), 206-213 (2016).
  18. Dijkstra, K. K., et al. Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).
  19. Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
  20. Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids. Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).
  21. Saxena, K., et al. Human Intestinal Enteroids: a New Model To Study Human Rotavirus Infection, Host Restriction, and Pathophysiology. Journal of Virology. 90 (1), 43-56 (2016).
  22. Karve, S. S., Pradhan, S., Ward, D. V., Weiss, A. A. Intestinal organoids model human responses to infection by commensal and Shiga toxin producing Escherichia coli. PLOS ONE. 12 (6), e0178966(2017).
  23. Heo, I., et al. Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids. Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).
  24. Garcez, P. P., et al. Zika virus impairs growth in human neurospheres and brain organoids. Science. 352 (6287), 816-818 (2016).
  25. Forbester, J. L., Hannan, N., Vallier, L., Dougan, G. Derivation of Intestinal Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells for Use as an Infection System. Methods in Molecular Biology. , (2016).
  26. Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions. Mucosal Immunology. 8 (2), 352-361 (2015).
  27. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Human Induced Pluripotent Stem CellsIntestinal OrganoidsEpithelial Cell ProtectionSalmonella InfectionMicroinjection TechniqueInterleukin 22 TreatmentGentamicin Protection AssayTransmission Electron MicroscopyQuantitative PCR AnalysisBasement Membrane Matrix

מאמרים קשורים