תאי מברשת הם נדירים cholinergic האפיתל תאים כימוחושי נמצא בקנה הנשימה של העכבר נאיבי. בשל המספרים המוגבלים שלהם, הערכה לשעבר vivo של תפקידם התפקודי בחסינות דרכי הנשימה ושיפוץ הוא מאתגר. אנו מתארים שיטה לבידוד של תאים מברשת קנה הנשימה על ידי הזרמת cy, לנסות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בידוד והערכה כמותית של תאי המברשת מקנה הנשימה של העכבר
במאמר זה
סיכום
תקציר
תאי מברשת הקנה הם cholinergic כימוחושי תאים אפיתל צפוי לשדר אותות מן לומן דרכי הנשימה אל מערכות החיסון והעצבים. הם חלק ממשפחה של תאים אפיתל כימוחושי הכוללים תאים קווצת ברירית המעי, תאי מברשת בקנה הנשימה, וכימוחושי בידוד תאים microvillous ברירית האף. כימוחושי תאים בתאי אפיתל שונים לשתף סמנים תאיים מפתח וחתימה ליבה ההמרה, אבל גם להציג משמעותי transcript טרוגניות, כנראה רפלקטיבית של סביבת הרקמה המקומית. בידוד של תאים מברשת הקנה מתוך תא יחיד השבולים נדרש כדי להגדיר את הפונקציה של אלה תאים אפיתל נדירים בפירוט, אבל הבידוד שלהם הוא מאתגר, בגלל האינטראקציה הקרובה בין תאים מברשת קנה הנשימה וקצות העצבים או עקב הרכב ספציפי לדרכי הנשימה של צמתים הדוקים ומחסיד. כאן, אנו מתארים הליך בידוד של תאי מברשת מתוך האפיתל הקנה הנשימה של העכבר. השיטה מבוססת על הפרדה ראשונית של האפיתל קנה הנשימה מן הרירית, המאפשר הדגירה קצר יותר של גיליון האפיתל עם papain. הליך זה מציע פתרון מהיר ונוח עבור מיון cytometric זרימה וניתוח פונקציונלי של תאים מברשת קיימא הקנה.
מבוא
תאי מברשת שייכים מחלקה של תאים אפיתל כימוחושי מאופיין על ידי ביטוי של קולטני טעם המר ואת מכונות קולטן הטעם מצאו בתאים ניצן טעם. בניגוד לטעם ניצן תאים, התאים האפיתל כימופי מפוזרים משטחים אפיתל מכונים תאים כימוחושי הבידוד (sccs) ותאים microvillous ב אפיתל האף1,2, תאי מברשת בקנה הנשימה . תאים 3,4, ו-קווצת במעי5,6 תאים אפיתל ביטוי קולטני טעם המר ואת מכונות טעם המר התמרה גם מצויים בשופכה7,8 ו שפופרת השמיעה9. בתאי מברש....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
לפני שתנהל את הניסויים הבאים, ודא שכל השימוש בבעלי חיים והפרוטוקולים מאושרים על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים (iacuc) והופיעה בהסכמה עם המדריך הלאומי של מועצת המחקר לטיפול ושימוש ב חיות מעבדה "(8ה מהדורה, 2011) והנחיות הגעה. כל ההליכים המתוארים להלן נבדקו ואושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים והשימוש בבית החולים לנשים בריגהם.
1. הכנת ריאגנטים
- הכנת פתרון העיכול Dispase, שהוא פתרון PBS המכיל 16 U/mL dispase ו 20 μg/mL DNase I. ודא כי אבקת dispase מומס היטב לפני התחממות הפתרון באמבט מים ב 37 ° c.
- הוסף 5% חום בלתי מופעל העובר סרום (FBS) כדי להפוך את מדיום נשר שונה בינונית (DMEM) כדי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הליך זה יושם בהצלחה כדי לבודד תאים מברשת הקנה הנשימה עבור רצפי RNA רצף3. לאחר בידוד של קנה הנשימה ואת העיכול של הרקמה עם פרוטוקול 2-step (איור 1), תאים נאספו והוכתם עם התווית FLUORESCENTLY ו-epcam לאחר החרגה של תאים מתים עם PI. לאחר היציאה doublets מבוסס על מאפייני פיזור בצד הקדמי, הגדרת תאי מברשת נמוך/שלילי עבור CD45, חיובי עבור EpCAM ו חיובי עבור eGFP (איור 2א). תאי מברשת מיוצגים ~ 0.16-0.42% מתאים CD45נמוך/מינוס
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מצאנו כי שילוב של טיפול במינון גבוה dispase עבור 40 דקות ואחריו טיפול פפאין קצר (30 דקות) מספק פרוטוקול אופטימלי לעיכול הקנה ובידוד תא מברשת. שילוב זה גם נמנע מעיכול נרחב ומייצר את התשואה הגבוהה ביותר של תאי מברשת, לעומת פרוטוקולים חלופיים.
בעוד העיכול הריאה לחלץ תאים המטפאות יש הסתמך באופן קלאסי על אנזימים העיכול מתון כמו קולגן הרביעי15, בידוד של תאים אפיתל דורש פרוטוקולים מורכבים יותר. תא בודד השעיות של תאים אפיתל קשה יותר להשיג בגלל הצמתים צר וחסיד מחייב אותם זה לזה .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
. למחברים אין מה לגלות
תודות
אנו מודים לאדם שכינין במרכז ליבת מרכז האימונולוגיה של הנשים במהלך הסיוע באמצעות מיון ציטומטלי זרימה. עבודה זו נתמכת על ידי המכונים הלאומיים של מענקי בריאות R01 HL120952 (N.A.B.), R01 AI134989 (נ. א. ב), U19 AI095219 (N.A.B., L. G. B), ו K08 AI132723 (L. G. B), ועל ידי האקדמיה האמריקנית לאלרגיה, אסטמה, ואימונולוגיה (ראה)/אמריקן לונג אלרגיות פרס מחלת הנשימה (N.A.B.), על-ידי פרס פיתוח הפקולטה למדעי הקרן (L.G.B.), על ידי הפרס הצעיר של סטיבן וג קיי (N.A.B.), על ידי הקרן לפיתוח קריירה של מדעני נשים (L.G.B.), וב תרומה נדיבה של משפחת ויניק (L.G.B.).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>נוגדנים | |||
| אנטי-GFP (עז פוליקלונלית Ig) | Abcam | cat# ab5450 | |
| APC נגד עכבר CD326 (EpCAM) (G8.8) | חתול Biolegend | #118214 | |
| APC Rat IgG2a, k בקרת איזוטיפ | חתול Biolegend | #400511 | |
| חתול DAPI | Biolegend | 422801 | |
| חמור נגד עזים IgG (H+L) נוגדן משני נספג מאוד, Alexa Fluor 488 | Life Technologies/חתול בדיקות מולקולריות | #A-11055 | |
| עז רגילה IgG | R& D Systems | cat#AB-108-C | |
| Pacific Blue נגד עכבר CD45 (30F-11) | Biolegend | cat#103126 | |
| Pacific Blue Rat IgG2b, k בקרת איזוטיפ | Biolegend | cat#400627 | |
| TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) נוגדן | Biolegend | cat#101320 | |
| כימיקלים, פפטידים וחלבונים רקומביננטיים | |||
| Dispase | חתול ג'יבקו | # 17105041 | |
| DNase I | Sigma | cat# 10104159001 | |
| HEPES-Tyrode' s מאגר ללא סידן (10 מ"מ HEPES, 135 מ"מ NaCl, 2.8 מ"מ KCl, 1 מ"מ MgCl<תת>2, 12 מ"מ NaHCO3, 0.4 mM NaH2PO4, 0.25% BSA, 5.5 mM גלוקוז. מוכן במים של 18.2 מגה-הם ומסונן דרך 0.22 ומיקרו; m מסנן | Boston BioProducts | cat# PY-912 | |
| Tyrode' s תמיסה (חוצץ HEPES) 140 מ"מ NaCl, 5 מ"מ KCl, 25 מ"מ HEPES, 2 מ"מ CaCl2, 2 מ"מ MgCl2 ו-10 מ"מ גלוקוז. מוכן במים של 18.2 מגה-הם ומסונן דרך 0.22 ומיקרו; מסנן M. ) | Boston BioProducts | cat# BSS-355 | |
| L-Cysteine | Sigma | cat# C7352 | |
| Leupeptin trifluoroacetate salt | Sigma | cat# L2023 | |
| פפאין מלטקס פפאיה | סיגמא | cat# P3125 | |
| Propidium iodide | Sigma | cat# P4170 | |
| <מודלים ניסיוניים חזקים>: אורגניזמים/זנים | |||
| ChATBAC-eGFP (B6. Cg-TG (RP23-268L19-EGFP) 2Mik / J) | מעבדת ג'קסון | 7902 | |
| <חזק>ציוד< / חזק > | |||
| LSM 800 עם מערכת קונפוקלית של Airyscan ב-a Zeiss Axio Observer Z1 מיקרוסקופ הפוך | Zeiss | ||
| LSR | 647465< | ||
| חד פעמי חזק> חד פעמי | |||
| 1.5 מ"ל | תומאס סיינטיפיק | 1157C86 | |
| 5 מ"ל צינור עגול תחתון פויסטרן, סגנון 12 מ"מ x 75 מ"מ | פלקון | 14-959-1A | |
| 50 מ"ל צינור חרוטי מפוליפרופילן, 30 מ"מ x 115 מ"מ בסגנון | פלקון | 352098 | |
| נוצות חד פעמי אזמל מס' 12 | פישר סיינטיפיק | NC9999403 | |
| , 100 מ"מ x 15 מ"מ סגנון | פלקון | 351029 | |
| מסננת תאים סטריליים, 100 μ מ | חתול פישרברנד | #22363549 |
מקורות
- Tizzano, M., et al. Nasal chemosensory cells use bitter taste signaling to detect irritants and bacterial signals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (7), 3210-3215 (2010).
- Genovese, F., Tizzano, M.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
