בידוד והערכה כמותית של תאי המברשת מקנה הנשימה של העכבר

Summary

תאי מברשת הם נדירים cholinergic האפיתל תאים כימוחושי נמצא בקנה הנשימה של העכבר נאיבי. בשל המספרים המוגבלים שלהם, הערכה לשעבר vivo של תפקידם התפקודי בחסינות דרכי הנשימה ושיפוץ הוא מאתגר. אנו מתארים שיטה לבידוד של תאים מברשת קנה הנשימה על ידי הזרמת cy, לנסות.

Abstract

תאי מברשת הקנה הם cholinergic כימוחושי תאים אפיתל צפוי לשדר אותות מן לומן דרכי הנשימה אל מערכות החיסון והעצבים. הם חלק ממשפחה של תאים אפיתל כימוחושי הכוללים תאים קווצת ברירית המעי, תאי מברשת בקנה הנשימה, וכימוחושי בידוד תאים microvillous ברירית האף. כימוחושי תאים בתאי אפיתל שונים לשתף סמנים תאיים מפתח וחתימה ליבה ההמרה, אבל גם להציג משמעותי transcript טרוגניות, כנראה רפלקטיבית של סביבת הרקמה המקומית. בידוד של תאים מברשת הקנה מתוך תא יחיד השבולים נדרש כדי להגדיר את הפונקציה של אלה תאים אפיתל נדירים בפירוט, אבל הבידוד שלהם הוא מאתגר, בגלל האינטראקציה הקרובה בין תאים מברשת קנה הנשימה וקצות העצבים או עקב הרכב ספציפי לדרכי הנשימה של צמתים הדוקים ומחסיד. כאן, אנו מתארים הליך בידוד של תאי מברשת מתוך האפיתל הקנה הנשימה של העכבר. השיטה מבוססת על הפרדה ראשונית של האפיתל קנה הנשימה מן הרירית, המאפשר הדגירה קצר יותר של גיליון האפיתל עם papain. הליך זה מציע פתרון מהיר ונוח עבור מיון cytometric זרימה וניתוח פונקציונלי של תאים מברשת קיימא הקנה.

Introduction

תאי מברשת שייכים מחלקה של תאים אפיתל כימוחושי מאופיין על ידי ביטוי של קולטני טעם המר ואת מכונות קולטן הטעם מצאו בתאים ניצן טעם. בניגוד לטעם ניצן תאים, התאים האפיתל כימופי מפוזרים משטחים אפיתל מכונים תאים כימוחושי הבידוד (sccs) ותאים microvillous ב אפיתל האף^1,2, תאי מברשת בקנה הנשימה ^{. תאים 3,4}, ו-קווצת במעי^5,6 תאים אפיתל ביטוי קולטני טעם המר ואת מכונות טעם המר התמרה גם מצויים בשופכה^7,8 ו שפופרת השמיעה⁹. בתאי מברשת נתיב האוויר יש פונקציות ייחודיות הנוירוגניים ואת התגובה החיסונית החיסון. הם מייצרים אצטילכולין בתאי כימוחושי שעוררו רפלקסים הנשימה הגנה על ההפעלה עם תרכובות מר ומטבוליטים חיידקיים כמו חומרים חישת-quorum¹⁰. תאים מברשת נתיב האוויר הם גם מקור האפיתל של דרכי הנשימה הדומיננטי של IL-25, אשר מווסת aeroallergen-מעורר סוג 2 דלקת בדרכי הנשימה³.

אפיון מלוא ההמרה של תאים מברשת האוויר התחתון ואת התגובה שלהם גירויים סביבתיים כבר מוגבל על ידי מספרים נמוכים שלהם באפיתל הקנה ומספרים מוגבלים מאוד מעבר סמפונות גדול¹⁰. טכניקות המשמשות לבידוד של תאים כימוחושי מן האפיתל המעי לא הניבו מספרים גבוהים באופן פרופורציונלי מקנה הנשימה, אולי בגלל הקשרים האינטימיים של תאים מברשת הקנה עם קצות העצבים¹⁰ או אחרים מרכיבים ספציפיים לרקמה ברירית הנשימה, כגון הרכב של מחסיד וחלבונים הדוקים עם הצומת. דיווחים אחרונים של בידוד מוצלח של תאים מברשת קנה הנשימה במספרים גבוהים יותר עבור ניתוח ה-RNA של תא בודד המועסקים או 2 h דגירה עם פפאין או 18 h הדגירה עם המואז^11,12. מאז יותר incubations עם אנזימי העיכול יכול להפחית את הכדאיות התאים ולשנות את הפרופיל הטרנס של תאים מתוך רקמות מתעכל¹³, זה יכול הטיה ניתוח השוואתי עם אוכלוסיות אפיתל אחרות כימוחושי.

כאן, אנו מדווחים על שיטה לבידוד של תאים מברשת קנה הנשימה ברצף RNA³. טיפול בקנה הנשימה במינון גבוה dispase מפריד את האפיתל מן הרירית. העיכול הבאים של גיליון אפיתל עם פפאין מאפשר התאוששות מצוינת של תא זה מבניים.

Protocol

לפני שתנהל את הניסויים הבאים, ודא שכל השימוש בבעלי חיים והפרוטוקולים מאושרים על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים (iacuc) והופיעה בהסכמה עם המדריך הלאומי של מועצת המחקר לטיפול ושימוש ב חיות מעבדה "(8^ה מהדורה, 2011) והנחיות הגעה. כל ההליכים המתוארים להלן נבדקו ואושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים והשימוש בבית החולים לנשים בריגהם.

1. הכנת ריאגנטים

1. הכנת פתרון העיכול Dispase, שהוא פתרון PBS המכיל 16 U/mL dispase ו 20 μg/mL DNase I. ודא כי אבקת dispase מומס היטב לפני התחממות הפתרון באמבט מים ב 37 ° c.
2. הוסף 5% חום בלתי מופעל העובר סרום (FBS) כדי להפוך את מדיום נשר שונה בינונית (DMEM) כדי לבצע פתרון הפסקה.
3. הכינו את המאגר האני מאגר: להוסיף 26 U/ml פפאין (20 μl/ml של 48 u/mg פתרון פפאין) ו 10 μl/ml l-cysteine של hepes-tyrode של מאגר ללא סידן.
4. הכינו את המאגר השני של Tyrode: להוסיף 2 μL/mL ליופטין (5 מ"ג/mL) למאגר של הייפסי-טירכב עם סידן.
5. להכין מאגר facs: השימוש בתמיסת מלח מאוזנת של הנקס (hbss) ללא סידן, מגנזיום & פנול אדום, שיושלם עם 2 מ"מ חומצה ethylenediammiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiihi

2. חיתוך של קנה הנשימה של העכבר

הערה: עכברים המשמשים בפרוטוקול זה הם צ'אט^(BAC)-Egfp (B6. Cg-Tg (RP23-268L19-EGFP) 2Mik/J), 3-6 חודשים של גיל שני המינים. מזער את החשיפה של הרקמה לאור ישיר כדי להפחית את הלבנת התמונות של eGFP.

1. המתת חסד עם העכבר עם 100 mg/ק"ג פנטוברביטל המתת הרדמה intraperitoneally או באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים שאושרו על ידי IACUC.
2. לתקן את העכבר על לוח כירורגי במצב פרקדן עם 21 מחטים G עם גפיים המורחבת העליון והתחתון. רסס את הפרווה עם 70% אטואה כדי לחטא את האזור.
3. באמצעות מלקחיים ישרים, להרים את העור ואת הפרווה של הבטן ולעשות חתך במרכז עם מחתך מספריים (מספריים ישרים, 3 ס מ). באמצעות המספריים, הפרידו את העור מרקמת התת-עורית מהבטן אל הממהולה. בעוד מחזיק את הרקמה התת עורית למעלה עם מלקחיים, לעשות חתך קטן עם המספריים במרכז קיר הבטן.
4. פתח את הצפק עם חתך בצורת V. באמצעות מלקחיים, בעדינות להזיז את המעי הדק בצד, לאתר את אבי העורקים הבטן ואת המטה קאווה ולעשות חתך עם המספריים מבתר כדי לאפשר הקלה מהירה לדימום.
5. . תאתר את הסרעפת באמצעות מחט של 18 G, לעשות פתיחה בסרעפת מתחת עצם החזה כדי לרוקן את הריאות. הפרידו בקפידה את הסרעפת מכלוב הצלעות בעזרת מספריים חדים הפונים ישר לחיתוך לאורך בסיס הצלעות.
6. באמצעות מלקחיים, להרים את הקצה החשוף של עצם החזה ולחתוך את עצם החזה מlongitudinally מהבסיס של כלוב הצלעות לצוואר. בצע חתך צוואר הרחם המרכזי עם מספריים ישרים קצרים (2 ס מ) ולהפריד את שתי האונות של בלוטת הלסת התחתונה.
7. הסר בזהירות את רקמת החיבור המקיפים את בלוטת התימוס על ידי קרינה עם זוג מלקחיים דיוק באיכות גבוהה גבוה.
8. לנתח את קנה הנשימה בחינם הראשון על ידי הפרדת הקצה הטוב ביותר ברמה של אפיגלוטיס ולאחר מכן על ידי מבתר את הקצה המרוחק ברמת הבייון של קנה הנשימה.
9. לאתר את אפיגלוטיס ולחתוך את קנה הנשימה longitudinally מן אפיגלוטיס אל קרינה.

3. מסדר העיכול האפיתל

1. מניחים את קנה הנשימה לתוך צינור 1.5 mL המכיל 750 μL של טרום מחומם (כדי 37 ° c) פתרון העיכול dispase. דגירה על שייקר ב 200 סל ד עבור 40 דקות בטמפרטורת החדר. כסו את הצינור ברדיד אלומיניום כדי להקטין את החשיפה לאור ישיר.
2. הוסף 750 μL של DMEM קר עם 5% FBS כדי לעצור את התגובה. . מקום על הקרח
3. העבר את קנה הנשימה לצלחת פטרי (100 מ"מ x 15 מ"מ) ומקום תחת מיקרוסקופ מבתר. כוון את קנה הנשימה עם הצד האפיתל פונה כלפי מעלה. בקנה הנשימה longitudinally גזור צורה חצי גליל מתוחזק על ידי טבעות הסחוס. . האפיתל נמצא על משטח הקימור
4. לקשור את האזור אפיגלוטיס של קנה הנשימה עם מלקחיים ישר לצלחת פטרי באמצעות גודל 22 אזמל חד פעמי, לגרד את האפיתל את קנה הנשימה. שכבת האפיתל מפרידה כסדין שקוף.
5. . הללו את האפיתל עם האזמל העבר את שכבת האפיתל לשפופרת של 2 מ ל.
6. לשטוף את צלחת פטרי עם 750 μL של Tyrode אני מאגר ולהעביר לצינור 2 מ"ל המכיל את שכבת האפיתל.
7. מודדאת שכבת האפיתל הקנה בתוך Tyrode אני מאגר עבור 30 דקות ב 37 ° c על שייקר ב 200 סל ד. כסו את הצינור ברדיד אלומיניום כדי להקטין את החשיפה לאור ישיר.
8. הוסף 750 μL של המאגר השני של טירודה. מערבולת את הרקמה מתעכל במרץ עבור 20-30 s. Triturate את הגון אכל עם מזרק מוצמד 18 גרם מחט 10 פעמים.  מעבר למחט מחוון של 21 גרם ו קצוצות 10-20 יותר פעמים.
9. לסנן את התאים באמצעות מסננת 100 יקרומטר לתוך צינורית חרוט 50 mL. הוסף 30:1 vol/vol של מאגר FACS קר.
10. ספין ב 350 x g עבור 10 דקות ב 4 ° צ' ולהיפטר supernatant. השהה מחדש את הגלולה במאגר FACS קר להעביר את ההשעיה של 12 מ"מ x 75 מ"מ (5 mL) פוליסטירן מוקצף. ספין שוב ב 350 x g עבור 10 דקות ב 4 ° צ' ולהיפטר supernatant.
11. השהה מחדש את הגלולה ב-100 μL של מאגר FACS.
12. הוסף 1 μL של אנטי עכבר CD16/32 נוגדן חסימת לחסום את הכריכה הלא ספציפית מודטה עבור 15 דקות על הקרח. . אל תשטוף את הכביסה
13. להוסיף את הנוגדנים הבאים שולטת isotype: פסיפיק כחול נגד עכבר CD45 או עכברוש IgG2a, k (0.25 μg/10⁶ תאים בנפח 100 μl) ו allophycocyanin (APC) נגד עכבר epcam או עכברוש IgG2b, k (0.5 μg/10⁶ תאים ב 100 μl) נוגדנים מונבטיים. דגירה של 45 דקות על הקרח מוגן מפני אור ישיר. הוסף 4.5 mL של מאגר FACS קר, לערבב ספין ב 350 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c. להיפטר מאגר FACS ולהשעות מחדש את הגלולה ב 300 μL של מאגר FACS קר.
14. הוסף propidium יודיד (PI) (5 μg/mL) מיד לפני מיון cytometric הזרימה.
    הערה: לתאי מברשת יש צורה לא סדירה עם מספר תהליכים שעלולים להגביר את הדבקות שלהם במסננים (איור 3ג). השוונו 30 מ"מ ל 70 מ"מ ו 100 מ"מ מסננים ומצא כי מסנני הנקבוביות גדול יותר מבטיח תשואה טובה יותר. בנוסף, נשחקו יסודית של ההשעיה התא לאחר עיכול פפאין משפרת באופן משמעותי את התשואות תא מברשת. אנו ממליצים להשתמש במחט 18g עבור נשחקו הראשונית ואחריו קטן נשא (21 או 23 G מחט) לדיסוציאציה עדינה יותר של תאים.

4. הזרם Cy, לנסות להזרים אסטרטגיה

1. זיהוי תאים מפסולת באמצעות זווית פיזור לפנים ולצד. לא לכלול את doublets באמצעות גובה פיזור הקדמי ורוחב ורוחב פיזור הצד ורוחבו. Doublets יהיו התאים בעלי ערכי רוחב גבוהים.
2. בתוך התאים היחידים, זהה את התאים החיים כאוכלוסיה שהיא PI שלילית.
3. בתוך התאים היחידים החיים, זהה את CD45 נמוך לתאים שליליים בהתבסס על פקד isotype.
4. בתוך CD45 תאים נמוכים/שליליים, לזהות את התאים החיוביים EpCAM כי הם גם eGFP חיובי (בערוץ FITC). זוהי האוכלוסייה של תאי מברשת (איור 2א).

Results

הליך זה יושם בהצלחה כדי לבודד תאים מברשת הקנה הנשימה עבור רצפי RNA רצף³. לאחר בידוד של קנה הנשימה ואת העיכול של הרקמה עם פרוטוקול 2-step (איור 1), תאים נאספו והוכתם עם התווית FLUORESCENTLY ו-epcam לאחר החרגה של תאים מתים עם PI. לאחר היציאה doublets מבוסס על מאפייני פיזור בצד הקדמי, הגדרת תאי מברשת נמוך/שלילי עבור CD45, חיובי עבור EpCAM ו חיובי עבור eGFP (איור 2א). תאי מברשת מיוצגים ~ 0.16-0.42% מתאים CD45^{נמוך/מינוס}

Discussion

מצאנו כי שילוב של טיפול במינון גבוה dispase עבור 40 דקות ואחריו טיפול פפאין קצר (30 דקות) מספק פרוטוקול אופטימלי לעיכול הקנה ובידוד תא מברשת. שילוב זה גם נמנע מעיכול נרחב ומייצר את התשואה הגבוהה ביותר של תאי מברשת, לעומת פרוטוקולים חלופיים.

בעוד העיכול הריאה לחלץ תאים המטפאות יש הסתמך באופן קלאסי על אנזימים העיכול מתון כמו קולגן הרביעי¹⁵, בידוד של תאים אפיתל דורש פרוטוקולים מורכבים יותר. תא בודד השעיות של תאים אפיתל קשה יותר להשיג בגלל הצמתים צר וחסיד מחייב אותם זה לזה ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<חזק>נוגדנים
אנטי-GFP (עז פוליקלונלית Ig)	Abcam	cat# ab5450
APC נגד עכבר CD326 (EpCAM)  (G8.8)	חתול Biolegend	#118214
APC Rat IgG2a, k בקרת איזוטיפ	חתול Biolegend	#400511
חתול DAPI	Biolegend	422801
חמור נגד עזים IgG (H+L) נוגדן משני נספג מאוד, Alexa Fluor 488	Life Technologies/חתול בדיקות מולקולריות	#A-11055
עז רגילה IgG	R& D Systems	cat#AB-108-C
Pacific Blue נגד עכבר CD45 (30F-11)	Biolegend	cat#103126
Pacific Blue Rat IgG2b, k בקרת איזוטיפ	Biolegend	cat#400627
TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) נוגדן	Biolegend	cat#101320
כימיקלים, פפטידים וחלבונים רקומביננטיים
Dispase	חתול ג'יבקו	# 17105041
DNase I	Sigma	cat# 10104159001
HEPES-Tyrode' s מאגר ללא סידן (10 מ"מ HEPES, 135 מ"מ NaCl, 2.8 מ"מ KCl, 1 מ"מ MgCl<תת>2, 12 מ"מ NaHCO3, 0.4 mM NaH2PO4, 0.25% BSA, 5.5 mM גלוקוז. מוכן במים של 18.2 מגה-הם ומסונן דרך 0.22 ומיקרו; m מסנן	Boston BioProducts	cat# PY-912
Tyrode' s תמיסה (חוצץ HEPES) 140 מ"מ NaCl, 5 מ"מ KCl, 25 מ"מ HEPES, 2 מ"מ CaCl2, 2 מ"מ MgCl2 ו-10 מ"מ גלוקוז. מוכן במים של 18.2 מגה-הם ומסונן דרך 0.22 ומיקרו; מסנן M. )	Boston BioProducts	cat# BSS-355
L-Cysteine	Sigma	cat# C7352
Leupeptin trifluoroacetate salt	Sigma	cat# L2023
פפאין מלטקס פפאיה	סיגמא	cat# P3125
Propidium iodide	Sigma	cat# P4170
<מודלים ניסיוניים חזקים>: אורגניזמים/זנים
ChATBAC-eGFP (B6. Cg-TG (RP23-268L19-EGFP) 2Mik / J)	מעבדת ג'קסון	7902
<חזק>ציוד< / חזק >
LSM 800 עם מערכת קונפוקלית של Airyscan  ב-a  Zeiss Axio Observer Z1 מיקרוסקופ הפוך	Zeiss
LSR		647465<
חד פעמי חזק> חד פעמי
1.5 מ"ל	תומאס סיינטיפיק	1157C86
5 מ"ל צינור עגול תחתון פויסטרן, סגנון 12 מ"מ x 75 מ"מ	פלקון	14-959-1A
50 מ"ל צינור חרוטי מפוליפרופילן, 30 מ"מ x 115 מ"מ בסגנון	פלקון	352098
נוצות חד פעמי אזמל מס' 12	פישר סיינטיפיק	NC9999403
, 100 מ"מ x 15 מ"מ סגנון	פלקון	351029
מסננת תאים סטריליים, 100 μ מ	חתול פישרברנד	#22363549