כאן, אנו מתארים את ההרכבה של RNA פולימראז II (Pol II) מתחמי התארכות הדורשים רק די-אן-איי סינתטי ו-RNA olig, ומטוהרים פול II. מתחמי אלה שימושיים עבור מנגנוני לימוד בבסיס עיבוד שכונתיות של התעתיקים הקשורים למכלול התארכות פול השני.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
RNA מלאכותי פולימראז השני מכלולי התארכות לניתוח אירועים בעיבוד RNA
במאמר זה
סיכום
תקציר
הסינתזה של eukaryotic הוא תהליך ביוכימיים מורכב המחייב תמלול של תבנית DNA לתוך RNA מקודמת על ידי אנזים רב subunit RNA פולימראז II ו-co-transcript השילוב של RNA הקודמן כדי ליצור את mRNA בוגרת. במהלך סינתזה mRNA, מתחם התארכות RNA פולימראז II הוא יעד לרגולציה על ידי אוסף גדול של גורמי שעתוק השולטים בפעילות הקטליטית שלה, כמו גם הסגירה, השילוב, ו 3 '-עיבוד אנזימים היוצרים את mRNA בוגרת. בגלל המורכבות הטבועה של סינתזה של mRNA, מערכות ניסוי פשוטות יותר המאפשרות בידוד וחקירה של שלבי ההמרה השונים שלה יש תועלת רבה.
במאמר זה, אנו מתארים אחד מערכת ניסיונית פשוטה כזו המתאימה לחקירת הסגירה שיתוף RNA. מערכת זו מסתמכת על הגדרת RNA פולימראז II מתחמי התארכות התאספו מ פולימראז מטוהרים ובועות תעתיק מלאכותי. כאשר מקיבוע באמצעות ה-DNA biotinylated, אלה מתחמי התארכות RNA פולימו II מספקים כלי manipulable בקלות לניתוח מנגנוני הסגירה של RNA ומנגנונים שבהם מורכבות התארכות המגוייסים ומווסת את האנזים הסגירה במהלך שיתוף עם הסגירה של RNA. אנו מצפים מערכת זו יכול להיות מותאם ללימוד גיוס ו/או הרכבה של חלבונים או מתחמי חלבונים עם תפקידים בשלבים אחרים של התבגרות mRNA בשילוב למכלול התארכות RNA פולימראז II.
מבוא
Eukaryotic RNA (mRNA) סינתזה היא תהליך ביוכימיים מורכבים המערבת סינתזה של רנ א מעובד מעובד על ידי RNA פולימראז II ועיבוד של RNA הקודמן להניב mRNA בוגרת. פעולות עיבוד ה-RNA של הסגירה, החבור והפוליאדלציה מתבצעות במידה רבה באופן משותף. מתחם התארכות פול השני משמש כפיגום שמגוייסים ומתזמונים את פעילותם של רבים מאנזימי העיבוד של RNA. כתוצאה מכך, ההבנה האולטימטיבית של הדרך בה מופקים מערכת mrnas בוגרת, תסתמך במידה רבה על פיתוח מערכות נסיוניות כדי לאפשר ניתוח של המנגנונים הביוכימיים המשמשים לגיוס למכלול התארכות ו התקנה של אנזימים האחראים לסגירה משותפת, שחבור ופוליאדלציה.
לא באופן מפתיע, פיתוח מערכות נסיוניות כאלה היה קשה. מכשול גדול כבר המורכבות המדה....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הרכבת של מכלולי התארכות מלאכותיים ופול השני הליכה
- השתק 1 nmol של שאינם תבנית DNA oligo המכיל 3 ' ביוטין מולקולה על חרוזים מגנטיים.
הערה: ניתן לבצע את השלבים הבאים מראש כדי להתכונן לניסויים עתידיים. כל רצפי oligo המשמשים בפרוטוקול זה מסופקים בטבלה 1. ה-RNA oligos מסונתז עם 5 '-triphosphate שינויים.- הוסף 200 μL של חרוזים מגנטיים (10 מ"ג/mL) לתוך כריכת חלבון נמוך 1.5 mL שפופרת, ולאחר מכן מניחים על מדף מגנטי עבור 2 דקות.
- בעוד הצינור הוא על המדף המגנטי, להסיר את הנוזל מהצינור מבלי להפריע את החרוזים. כדי לשטוף את החרוזים, להסיר את הצינור מארון התקשורת, להוסיף 1 מ ל 5 mM טריס-HCl pH 7.5, 0.5 mM EDTA, 1 M הנ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
דמויות 2 ו- 3 להראות התגובה הייצוגית משמש ליצירת מתחמי הארכה מלאכותית המכילה תעתיקים של אורכים שונים על ידי הרחבת או פול השני ממקורות שונים. איור 4 מתאר כיצד אלה מתחמי התארכות ניתן להשתמש כדי לחשב שכונתיות ctd מותנית בסגירה של RNA.
איור 2A היא דיאגרמה של DNA ו-RNA מולקולות במערכות התארכות מלאכותיות. איור 2B.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מחקרים שמבקשים לבתר את האירועים ביחד למכלול התארכות פול השני כגון עיבוד רנ א ורגולציה של ההתארכות עצמה ניתן להקל מאוד על ידי שימוש במערכת אנזימים מאוד מטוהרים. הגדרת מערכות אנזימים כאלה יכולה להיות מאתגרת. התעתיק התלוי של היזם על ידי פול השני דורש לפחות חמישה גורמי שעתוק כלליים. הכנת הגורמים הללו והאגירה יכולה להימשך חודשים; מכאן, שלב הגבלת קצב בתהליך זה הוא לעתים קרובות פשוט הכנת קאדר של הגורמים התמלול הדרושים כדי להוות שעתוק בסיס במבחנה הבדיקה.
במאמר זה, אנו מתארים עיבוד של שיטות שפותחו בעבר.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
. למחברים אין מה לגלות
תודות
אנו מודים לס' שומאן על אספקת האנזים להגבלת היונקים. עבודה זו נתמכת בחלקו על ידי מענק למכון הסטורים למחקר רפואי מקרן הלן נלסון לחקר הרפואה בקרן הקהילה רבתי בקנזס סיטי. ניתן לגשת לנתונים המקוריים שבבסיס כתב יד זה ממאגר הנתונים המקורי של סטורס ב-http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1434.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| [α-32P] UTP (3000 Ci/mmol), 1 mCi | Perkin Elmer | NEG007H001MC | לתיוג רדיו RNA |
| 2x צבע טעינת RNA | אינגלנד Biolabs | B0363S | מומלץ מאוד. להכנת RNA במהלך העמסת ג'ל |
| 40% ביס:תמיסת אקרילאמיד | Biorad | 1610144 | |
| בקר סרום אלבומין (20 מ"ג/מ"ל) | New England Biolabs | B9000S | |
| Cdk7/Cyclin H/MAT1 (קומפלקס CAK) חלבון, פעיל, 10 ומיקרו; g | Millipore Sigma | 14-476 | משמש לזרחון Pol II CTD |
| DNA אוליגונוקלאוטידים | IDT | ראה טבלה 8 למפרטי טוהר | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Life Technologies Invitrogen | 65001 | השתמשנו גם בסטרפטווידין Dynabeads M-280 ללא בעיה אך מעדיפים חרוזי MyOne Streptavidin מכיוון שהם שוקעים לאט יותר |
| GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL) | Life Technologies Invitrogen | AM9516 | מומלץ מאוד. צובע כחול גלולת חומצת גרעין מה שהופך את התגובות להרבה יותר קלות לטיפול |
| אלקטרופורזה אנכית מקוררת כפולה סטנדרטית של Hoefer SE600 עם מרווחים של 1 מ"מ ו-15 מסרק היטב | Hoefer | SE600-15-1.5 | |
| MaXtract (1.5 מ"ל) | Qiagen | 129046 | מומלץ מאוד. מכיל ג'ל בצפיפות גבוהה היוצר מחסום יציב בין פאזה מימית לאורגנית; משפר את תפוקת ה-RNA במהלך מיצוי |
| תמיסת Proteinase K (20 מ"ג/מ"ל) | Life Technologies Invitrogen | 25530049 | |
| RNA oligonucleotides | Trilink | ראה טבלה 8 לפרטים נוספים | |
| שמרים פירופוספטאז אנאורגני (100 יחידות/מ"ל) | New England Biolabs | NEBM2403S | נדרש רק במהלך תגובות מכסה |
מקורות
- Liu, X., Bushnell, D. A., Kornberg, R. D. RNA polymerase II transcription: structure and mechanism. Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (1), 2-8 (2013).
- Daube, S. S., von Hippel, P. H. Functional transcription elongation complexes from synthetic RNA-DNA bubble du....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
