הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מחקר רעילות של תחמוצת אבץ חלקיקים בתרבות התא ו- Drosophila ילה מלאנוסטר

10.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59510

⸱

19 בספטמבר 2019

 ,  ,  ,  , 
1NUS Environmental Research Institute & Department of Anatomy, National University of Singapore, 2NUS Environmental Research Institute & School of Public Health, National University of Singapore, 3Department of Civil and Environmental Engineering, National University of Singapore, 4Department of Anatomy, National University of Singapore

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים פרוטוקול מפורט להערכת פרופילי הרעילות של חלקיקי תחמוצת אבץ (ZnO NPs) בפרט, סוג של מוות התאים בMRC5 ריאות האדם היווצרות ו רוס המבנה של הפרי זבוב Drosophila ילה.

תקציר

תחמוצת אבץ חלקיקי (ZnO NPs) יש מגוון רחב של יישומים, אבל מספר דוחות על רעילות ZnO NP-הקשורים גדל במהירות בשנים האחרונות. עם זאת, מחקרים שבהסבר המנגנון הבסיסי לרעילות ZnO NP המושרה הם scanty. קבענו את פרופילי הרעילות של ZnO NPs באמצעות שניהם בתוך מבחנה במודלים ניסיוני vivo. ירידה משמעותית בכדאיות התאים נצפתה ב-ZnO NP-חשופים MRC5 ריאות פיברותקיעות, מראה כי אין NPs להפעיל אפקטים ציטוטוקסיים. באופן דומה, מעניין, המעיים חשופים ל-ZnO NPs הציגו עלייה דרמטית ברמות מינים של חמצן תגובתי (ROS) בזבוב הפירות דרוזוהילה. מחקרים מעמיקים יותר נדרשים כדי ליצור הערכת סיכונים עבור השימוש המוגבר של NPs ZnO על ידי הצרכנים.

מבוא

ננוטכנולוגיה מתייחסת ליישום של חומרים ננו הנמצאים בשימוש בכל התחומים המדעיים, כולל רפואה, מדעי החומרים, וביוכימיה. לדוגמה, החומרים הידועים לפיזור האולטרה סגול, החישה הכימית ותכונות האנטי-מיקרוביאלית, כמו גם מוליכות חשמלית גבוהה, מנוצלים בייצור מוצרי צריכה שונים כגון אריזות מזון, קוסמטיקה, טקסטיל, גומי, סוללות, זרז לטיפול בגז זנב מכוניות, ויישומים הקשורים בביו-רפואית1,2,3.

עם זאת, היישומים המתפתחת של מוצרים מבוססי ZnO NP, המוביל חשיפה אנושית מוגברת ל-ZnO NPs, העלו חששות על תופעות לוואי פוטנציאליות שלהם על בריאות האדם. מספר מחקרים סלולריים מחוץ לתחום הוכיחו כי הNPs zno יכול לגרום ללחץ חמצוני, מכשירים אוטומטיים הקשורים ציטורעילות, דלקת, ו-גנוגיה4,5,6,7,8 . בעיקר, רעילות של הארגון zno היא נגרמת על ידי פירוק של zno כדי לשחרר zno2 + יונים, כמו גם את הפעילות מחדש של zno, וכתוצאה מכך יוני הסלולר וחוסר איזון מטבולי המקושרים עם לקויי הומאוסטזיס היוניים ו עיכוב של הובלת יונים4,7,9,10. חשוב מאוד, מחקרים הראו כי הדור של מיני חמצן תגובתי (ROS) הוא אחד המנגנונים העיקריים המשמשים הרעילות ZnO הקשורים NPs. מספיק נגד חמצון פעילות לאחר העלבון ROS הוכח להיות אחראי על הגורם הרעילות הציטוזה נזק DNA9. ההשפעות הרעילות של הNPs של זאין יש גם דווחו בדגמי בעלי חיים, כולל מכרסם1, zbrafish11,12, כמו גם את חסרי חוליות drosophila ילה13.

Drosophila ילה משמש מודל מבוסס בעלי חיים חלופיים עבור הקרנת רעילות של ישויות כימיות וננו (nms)14,15. וחשוב מכך, ישנן רמות גבוהות של דמיון גנטי ופיזיולוגי בין בני אדם לדרוסופילה המצדיק את השימוש בדרוסופילה כמודל vivo להערכת תגובות ביולוגיות למזהמים סביבתיים כגון nms 16. יתר על כן, ישנם יתרונות רבים של שימוש Drosophila ילה בשל גודלו הקטן, תוחלת חיים קצרה, האיומים הגנטיים, ותחזוקה קלה וחסכונית. יתר על כן, Drosophila ילה אומצה באופן נרחב לחקר הגנטיקה, מולקולרית והתפתחותית ביולוגיה, מאז הגנום המלא שלה היה מלא רצף לפני שנים בחזרה 2000, ולכן הופך אותו מתאים עבור מגוון של הקרנת תפוקה גבוהה ולהתמודדות עם שאלות ביולוגיות לא פתורות17,18,19,20,21. בשנים האחרונות, מספר מחקרים הקשורים לאימונוטוקסיקולוגיה באמצעות סוגים שונים של NPs בדרוזוהילה דווחו15,22,23,24. הידע הבסיסי הזה שהתקבל ממחקרים שנעשו באמצעות דרוזופילה עזר לספק תובנות נוספות להבנת הננו-טוקסיקולוגיה.

ROS הוא העבריין הידוע עבור הרעלת ציטוזה ורעילות הנגרמת על ידי NPs, בפרט, בסיס מתכת מבוסס NPs25. רוס הם מינים כימיים המכילים חמצן עם תכונות תגובתי גבוהה יותר מאשר חמצן מולקולרי. רדיקלים חופשיים כגון סופראוקסיד רדיקלים (O2-) ואפילו, מולקולות שאינן קיצוניות כגון מי חמצן (H2o2) יכול לשמש ROS. תחת המצב הפיזיולוגי הרגיל, הם נדרשים לשמור על הומאוסטזיס הסלולר26, עם זאת, מוגזם ROS בשל הפקת יתר או דיסרגולציה של מערכת ההגנה נוגד חמצון יכול לגרום ללחץ חמצוני, המוביל נזק לחלבונים, שומנים וחומצה deאוקסיריוונקלאית (DNA)27. למשל, כמו העלייה ברמות של רוס ו גלוטתיון (gsh) הרמה פוחתת במקביל, שיבוש אדנוזין טריפוספט (ATP) סינתזה מתרחש ו לקטט דהידרוגנאז (ldh) רמת מגדילה בינונית, ששיאה במוות התאים27.

כאן, אנו מספקים פרוטוקולים לביצוע ניתוחים סלולריים וגנטיים תוך שימוש בתאי יונקים מתורבתים ודרוזוהילה כדי לקבוע את ההשפעות השליליות הפוטנציאליות של אי-הצורך בNPs. מבט כולל על השיטה המשמשת לחקר רעילות של ZnO NPs מוצג באיור 1.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. מיון תאים פלואורסצנטית מופעל (FACS) ניתוח על תאים חיים/קבועים

  1. Sonicate ZnO NPs בהשעיה עבור 15 דקות.
  2. הכנת NPs בריכוזים שונים (g, 0, 10, 25, 50,100 ו 200 μg/mL) באמצעות 1 מ"ג/mL ZnO NP מניות פתרון לטיפול בתאים מתורבתים.
  3. זרעים MRC5 בריאות האדם (1 x 105 תאים/גם) על צלחת 6-היטב התרבות ביום מראש, ולאחר מכן לטפל בתאים עם 2 מ ל של הבית Zno NPs (בטריליטים) עבור 8 h, 16 h, ו 24 h.
  4. בכל רגע, לאסוף את התאים על ידי תפרידו ב 300 x g עבור 5 דקות.
  5. רוחצים את כדורי התא פעמיים עם תמיסת מלח באגירה מפוספרת (PBS).
  6. השהה מחדש את התאים באמצעות מאגר איגוד של 1x, המורכב מ-0.1 M הידרוקסיד/נתרן הידרוקסידי (NaOH), 1.4 M נתרן כלוריד (הנאגל), ו -25 מ"מ סידן כלוריד (CaCl2), בריכוז של 1 x 105 תאים לכל 100 μl.
  7. הוסף 5 μL של פלואורואסעין isothiocyanate (FITC) הכתם V ו 5 μL של propidium יודיד (PI) כתם דנ א, ו מספחת את התאים עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT; 25 ° c) בחושך.
  8. למעלה את הדגימות עם 400 μL נוספים של מאגר איגוד של 1x לפני מיון התאים על ידי הזרמת cy, try. מינימום של 10,000 תאים מנותח עבור כל דוגמה.
  9. בסדר את תרשים העמודות באמצעות העוצמה החציוני שהושגה.

2. חשיפת NPs לדרוזוהילה

  1. להוסיף 1 מ ל חלקיקי חלקיקים בריכוזים שונים לתוך מבחנות, ואחריו 9 מ ל של מזון לעוף כדי להפוך את הריכוז הסופי של 0.1 mg/mL, 0.25 mg/mL או 0.5 mg/mL ZnO NPs.
  2. מערבבים חלקיקים עם מזון ביסודיות בבקבוקונים באמצעות הפיפטה.
  3. אפשר לעוף מזון המכיל את ה-ZnO NPs להתקרר לפחות 2-3 h לפני השימוש.
  4. הציגו בתוכם גברים ונשים זבובים לתוך הבקבוקונים במשך 5 ימים, והרשו להם להזדווג ולהטיל ביצים (המופיעות ככתמים לבנים) על פני האוכל.
  5. להסיר את הזבובים הורים, ולאפשר לביצים לעבור פיתוח נוסף, אשר מורכב 4 שלבים התפתחותיים שונים (עובריים, זחל, גולמי ובוגרים הבמה).

3. חיתוך זבוב

  1. לאסוף מאוחר 3 הזחליםסינטסיומאיה מהקיר של הבקבוקונים לניתוח. ביצים טריות שהונחו בדרך כלל להתפתח לסוף 3 הזחלים סינטסיומאיה לאחר 72-120 h ב RT.
  2. נקו את צלחת החיתוך ומלאו את הבאר עם חיתוך בינוני/PBS.
  3. לנתח את הזחלים (בסוף 3שרואד instar) תחת stereomicroscope, באמצעות זוג מלקחיים.
  4. השתמש קצה של מלקחיים לעשות חור קטן לשבור לפתוח את שכבת הקוטיקולה של הזחלים. בזהירות למשוך את המעיים ולמקם אותו לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL המכילה את מדיום הדרוסופילה של שניידר, לפני השלב התיקון באמצעות 1 מ ל 4% פאראפורמלדהיד (PF).
  5. 3.5 לתקן את המעיים ב-PF עבור 10 דקות ב-RT, עבור ניסויים עוקבים, כגון כתמים חיסוני.

4. האיתור של רוס באמצעות דהידרואתידיום (היא) צביעת

  1. התייחסו לזחלים בריכוזים שונים של הזנו NPs כמתואר בשלב 2.1.
  2. לאחר הניתוח של המעיים מ 3 הזחליםסינטסיומאיה כמתואר לפי סעיף 3, דגירה את המעיים של שניידר בינוני הדרוזולה ב-RT לפני ביצוע מכתים רקמות. התמוססות 1 μL של הצבע שלה (מתוך ריכוז המניה של 30 מ"מ) ב 1 מ ל של המדיום של שניידר, ביצוע ריכוז העבודה הסופי של 10-30 μM לצבוע.
  3. מודמת את הבטן למשך 5 דקות ב-RT בחושך, ולאחר מכן רוחצים שלוש פעמים באמצעות המדיום של שניידר עבור כל 5 דקות.
  4. לתקן את הבטן עם 4% PF (צעד אופציונלי) ו הר את הבטן על שקופיות זכוכית, עם מדיום הרכבה אנטי לדעוך המכיל 4 ′, 6-diamidino-2-פניינילידול (DAPI). לכידת תמונות תחת מיקרוסקופ קונפוקלית וקד.

5. מדידת קרינה פלואורסצנטית באמצעות ImageJ תוכנה

  1. יבא את תמונות הזריחה שנתפסו שנרכשו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטית או מיקרוסקופ לייזר קונפוקלית לתוך תוכנת imagej.
  2. לחצו על התפריט ' ניתוח ' ובחרו ' קביעת מדידות'.
  3. בחר באמצעי הפלט כגון עוצמה משולבת בשטח וערך אפור ממוצע.
  4. לחץ על מדידה.
  5. בחר אזור ללא זריחה כדי להגדיר את הרקע.
  6. יצא את הנתונים לתוך הגיליון האלקטרוני של Excel וקבע את הזריחה הכוללת של התא הכולל (CTCF), באמצעות החישוב כמוצג להלן.
    CTCF = צפיפות משולבת-(שטח של תא נבחר X ממוצע הזריחה של קריאות רקע)
  7. בנה תרשים עמודות ובצע ניתוח סטטיסטי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

התאים שנחשפו NP עובדו עם ערכת הצביעת תא מגיב, ואחריו מיון התא באמצעות הזרמת cy, לנסות. ZnO NP-מטופלים תאים (למטה, הלוח הימני) התערוכה אחוז גבוה יותר של מוקדם (R3)/תאים מאוחר האפוטוטיים (R6) מאשר בתאי שליטה (R5, התחתון, פאנל שמאל). נמק מוות של תאים מסומן על ידי אר 4 (למעלה, הלוח הימני) (איור 2). התוצאות של שיטת ה-FITC/אנשין החמישי בטיפול בחומרים מטופלים מטעם מטופל מיוצג באיור 2.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

על מנת להעריך אם ZnO NP יכול לגרום אפופטוזיס ב MRC5 פיברותקיעות, אנו משתמשים בזרם cy, לנסות להבדיל בין התאים נמק או מוות של תאים האפוטוטיים. בתאים חיים רגילים, פוספולידיסרין (PS) מותאם לשפה הקרום של התא. אם ואפופטוזיס מתרחשת, PS הוא translocated מוקם לתוך העלון של קרום הפלזמה, המאפשר את הכריכה של אנשין V מתויג עם fluorescein (FITC אנשין V)29. מצד שני, propidium יודיד אדום-פלורסנט (PI), לצבוע את חומצת הגרעין, הוא אטום לתאי החיים ותאי האפוטוטיים אך כתמי תאים מתים30. זה מאפשר ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

המחקר היה נתמך על ידי מספר מענק R706-000-043-490. המחקר אינו מייצג את ההשקפה של נותן החסות המענק.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
15% מתיל 4-הידרוקסיבנזואטסיגמא אולדריץ'
4% פרפורמלדהידסיגמא אולדריץ'P6148
בקטו אגרBD biosciences
cncCK6/TM3, Sbמתנה מד"ר קרפולה T
קמח תירס, גלוקוז, מבשלת שמריםסיגמא אולדריץ'
סיאן ADP עם Summit SoftwareDAKOhttps://flow.usc.edu/files/2014/07/BC-Cyan-ADP-User-Guide-2016.pdf
Dihydroethidium (Hydroethidine)Thermo Fisher ScientificD11347
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit IBD biosciences556547
מיקרוסקופ פלואורסצנטיOlympus
Glucolinסופרמרקט
תוכנתImageJ NIH
MRC5 פיברובלסט ריאות אנושיATCCCCL-171
שניידר s Drosophila בינוניThermo Fisher Scientific21720-024
Vectashield antifade הרכבה עם DAPIVector LaboratoriesH-1200
Wild-type Canton-S; Sod2N308/CyONIG-FLY
ננו-חלקיקי תחמוצת אבץסיגמא אולדריץ'721077עיין בגיליון 2

מקורות

  1. Kim, Y. R., et al. Toxicity of 100 nm zinc oxide nanoparticles: a report of 90-day repeated oral administration in Sprague Dawley rats. International Journal of Nanomedicine. 9 Suppl 2, 109-126 (2014).
  2. Xie, Y., He, Y., Irwin, P. L., Jin, T., Shi, X. Antibacterial activity and mechanism of action of zinc oxide nanoparticles against Campylobacter jejuni. Applied and Environmental Microbiology. 77, 2325-2331 (2011).
  3. Colvin, V. L. The potential environmental impact of engineered nanomaterials. Nature Biotechnology. 21, 1166-1170 (2003).
  4. De Angelis, I., et al. Comparative study of ZnO and TiO(2) nanoparticles: physicochemical characterisation and toxicological effects on human colon carcinoma cells. Nanotoxicology. 7, 1361-1372 (2013).
  5. Johnson, B. M., et al. Acute exposure to ZnO nanoparticles induces autophagic immune cell death. Nanotoxicology. 9, 737-748 (2015).
  6. Singh, N., et al. NanoGenotoxicology: the DNA damaging potential of engineered nanomaterials. Biomaterials. 30, 3891-3914 (2009).
  7. Song, W., et al. Role of the dissolved zinc ion and reactive oxygen species in cytotoxicity of ZnO nanoparticles. Toxicology Letters. 199, 389-397 (2010).
  8. Wahab, R., et al. ZnO nanoparticles induced oxidative stress and apoptosis in HepG2 and MCF-7 cancer cells and their antibacterial activity. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 117, 267-276 (2014).
  9. Namvar, F., et al. Cytotoxic effects of biosynthesized zinc oxide nanoparticles on murine cell lines. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2015, (2015).
  10. Wong, S. W., Leung, P. T., Djurisic, A. B., Leung, K. M. Toxicities of nano zinc oxide to five marine organisms: influences of aggregate size and ion solubility. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 396, 609-618 (2010).
  11. Hua, J., Vijver, M. G., Richardson, M. K., Ahmad, F., Peijnenburg, W. J. Particle-specific toxic effects of differently shaped zinc oxide nanoparticles to zebrafish embryos (Danio rerio). Environmental Toxicology and Chemistry. 33, 2859-2868 (2014).
  12. Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish. Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).
  13. Alaraby, M., Annangi, B., Hernandez, A., Creus, A., Marcos, R. A comprehensive study of the harmful effects of ZnO nanoparticles using Drosophila melanogaster as an in vivo model. Journal of Hazardous Materials. 296, 166-174 (2015).
  14. Rand, M. D. Drosophotoxicology: the growing potential for Drosophila in neurotoxicology. Neurotoxicology and Teratology. 32, 74-83 (2010).
  15. Ong, C., Yung, L. Y., Cai, Y., Bay, B. H., Baeg, G. H. Drosophila melanogaster as a model organism to study nanotoxicity. Nanotoxicology. 9, 396-403 (2015).
  16. Hoffmann, J. A., Reichhart, J. M. Drosophila innate immunity: an evolutionary perspective. Nature Immunology. 3, 121-126 (2002).
  17. Hughes, T. T., et al. Drosophila as a genetic model for studying pathogenic human viruses. Virology. 423, 1-5 (2012).
  18. Jennings, B. H. Drosophila - a versatile model in biology & medicine. Materials Today. 14, 190-195 (2011).
  19. Adams, M. D., Sekelsky, J. J. From sequence to phenotype: reverse genetics in Drosophila melanogaster. Nature Reviews Genetics. 3, 189-198 (2002).
  20. Adams, M. D., et al. The genome sequence of Drosophila melanogaster. Science. 287, 2185-2195 (2000).
  21. Ong, C., et al. Silver nanoparticles disrupt germline stem cell maintenance in the Drosophila testis. Scientific Reports. 6, (2016).
  22. Alaraby, M., Demir, E., Hernandez, A., Marcos, R. Assessing potential harmful effects of CdSe quantum dots by using Drosophila melanogaster as in vivo model. Science of the Total Environment. 530-531, 66-75 (2015).
  23. Barik, B. K., Mishra, M. Nanoparticles as a potential teratogen: a lesson learnt from fruit fly. Nanotoxicology. , 1-27 (2018).
  24. Jovanovic, B., et al. The effects of a human food additive, titanium dioxide nanoparticles E171, on Drosophila melanogaster - a 20 generation dietary exposure experiment. Scientific Reports. 8, (2018).
  25. Cao, Y. The Toxicity of Nanoparticles to Human Endothelial Cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1048, 59-69 (2018).
  26. Akhtar, M. J., Ahamed, M., Alhadlaq, H. A., Alshamsan, A. Mechanism of ROS scavenging and antioxidant signalling by redox metallic and fullerene nanomaterials: Potential implications in ROS associated degenerative disorders. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1861, 802-813 (2017).
  27. Akter, M., et al. A systematic review on silver nanoparticles-induced cytotoxicity: Physicochemical properties and perspectives. Journal of Advanced Research. 9, 1-16 (2018).
  28. Vecchio, G. A fruit fly in the nanoworld: once again Drosophila contributes to environment and human health. Nanotoxicology. 9, 135-137 (2015).
  29. Marino, G., Kroemer, G. Mechanisms of apoptotic phosphatidylserine exposure. Cell Research. 23, 1247-1248 (2013).
  30. Stoddart, M. J. Cell Viability Assays: Introduction. Mammalian Cell Viability: Methods and Protocols. , Chapter 1 (2011).
  31. Yazdani, M. Concerns in the application of fluorescent probes DCDHF-DA, DHR 123 and DHE to measure reactive oxygen species in vitro. Toxicology in Vitro. 30, 578-582 (2015).
  32. Chen, J., Rogers, S. C., Kavdia, M. Analysis of kinetics of dihydroethidium fluorescence with superoxide using xanthine oxidase and hypoxanthine assay. Annals of Biomedical Engineering. 41, 327-337 (2013).
  33. Hartig, S. M. Basic image analysis and manipulation in ImageJ. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 14, Unit14.15 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

חיוניות תאיםמיני חמצן ריאקטיבייםציטומטריה זרימהמיקרוסקופיה פלואורסצנטיתמיקרוסקופיה קונפוקליתפיברובלסטים של ריאה מסוג MRC5ניתוח מעיצביעת Annexin V
מחקר רעילות של תחמוצת אבץ חלקיקים בתרבות התא ו- Drosophila ילה מלאנוסטר
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.