אנו מתארים פרוטוקול מפורט להערכת פרופילי הרעילות של חלקיקי תחמוצת אבץ (ZnO NPs) בפרט, סוג של מוות התאים בMRC5 ריאות האדם היווצרות ו רוס המבנה של הפרי זבוב Drosophila ילה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מחקר רעילות של תחמוצת אבץ חלקיקים בתרבות התא ו- Drosophila ילה מלאנוסטר
במאמר זה
סיכום
תקציר
תחמוצת אבץ חלקיקי (ZnO NPs) יש מגוון רחב של יישומים, אבל מספר דוחות על רעילות ZnO NP-הקשורים גדל במהירות בשנים האחרונות. עם זאת, מחקרים שבהסבר המנגנון הבסיסי לרעילות ZnO NP המושרה הם scanty. קבענו את פרופילי הרעילות של ZnO NPs באמצעות שניהם בתוך מבחנה במודלים ניסיוני vivo. ירידה משמעותית בכדאיות התאים נצפתה ב-ZnO NP-חשופים MRC5 ריאות פיברותקיעות, מראה כי אין NPs להפעיל אפקטים ציטוטוקסיים. באופן דומה, מעניין, המעיים חשופים ל-ZnO NPs הציגו עלייה דרמטית ברמות מינים של חמצן תגובתי (ROS) בזבוב הפירות דרוזוהילה. מחקרים מעמיקים יותר נדרשים כדי ליצור הערכת סיכונים עבור השימוש המוגבר של NPs ZnO על ידי הצרכנים.
מבוא
ננוטכנולוגיה מתייחסת ליישום של חומרים ננו הנמצאים בשימוש בכל התחומים המדעיים, כולל רפואה, מדעי החומרים, וביוכימיה. לדוגמה, החומרים הידועים לפיזור האולטרה סגול, החישה הכימית ותכונות האנטי-מיקרוביאלית, כמו גם מוליכות חשמלית גבוהה, מנוצלים בייצור מוצרי צריכה שונים כגון אריזות מזון, קוסמטיקה, טקסטיל, גומי, סוללות, זרז לטיפול בגז זנב מכוניות, ויישומים הקשורים בביו-רפואית1,2,3.
עם זאת, היישומים המתפתחת של מוצרים מבוססי ZnO NP, המוביל חשיפה אנושית מוגברת ל-ZnO NPs, העלו חששות על תופעות לוואי פוטנציאליות שלהם על בריאות האדם. מספר מחקרים סלולריים מחוץ לתחום....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. מיון תאים פלואורסצנטית מופעל (FACS) ניתוח על תאים חיים/קבועים
- Sonicate ZnO NPs בהשעיה עבור 15 דקות.
- הכנת NPs בריכוזים שונים (g, 0, 10, 25, 50,100 ו 200 μg/mL) באמצעות 1 מ"ג/mL ZnO NP מניות פתרון לטיפול בתאים מתורבתים.
- זרעים MRC5 בריאות האדם (1 x 105 תאים/גם) על צלחת 6-היטב התרבות ביום מראש, ולאחר מכן לטפל בתאים עם 2 מ ל של הבית Zno NPs (בטריליטים) עבור 8 h, 16 h, ו 24 h.
- בכל רגע, לאסוף את התאים על ידי תפרידו ב 300 x g עבור 5 דקות.
- רוחצים את כדורי התא פעמיים עם תמיסת מלח באגירה מפוספרת (PBS).
- השהה מחדש את התאים באמצעות מאגר איגוד של 1x, המורכב מ-0.1 M הידרוקסיד/נתרן הידרוקסידי (NaOH), 1.....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
התאים שנחשפו NP עובדו עם ערכת הצביעת תא מגיב, ואחריו מיון התא באמצעות הזרמת cy, לנסות. ZnO NP-מטופלים תאים (למטה, הלוח הימני) התערוכה אחוז גבוה יותר של מוקדם (R3)/תאים מאוחר האפוטוטיים (R6) מאשר בתאי שליטה (R5, התחתון, פאנל שמאל). נמק מוות של תאים מסומן על ידי אר 4 (למעלה, הלוח הימני) (איור 2). התוצאות של שיטת ה-FITC/אנשין החמישי בטיפול בחומרים מטופלים מטעם מטופל מיוצג באיור 2.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
על מנת להעריך אם ZnO NP יכול לגרום אפופטוזיס ב MRC5 פיברותקיעות, אנו משתמשים בזרם cy, לנסות להבדיל בין התאים נמק או מוות של תאים האפוטוטיים. בתאים חיים רגילים, פוספולידיסרין (PS) מותאם לשפה הקרום של התא. אם ואפופטוזיס מתרחשת, PS הוא translocated מוקם לתוך העלון של קרום הפלזמה, המאפשר את הכריכה של אנשין V מתויג עם fluorescein (FITC אנשין V)29. מצד שני, propidium יודיד אדום-פלורסנט (PI), לצבוע את חומצת הגרעין, הוא אטום לתאי החיים ותאי האפוטוטיים אך כתמי תאים מתים30. זה מאפשר .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.
תודות
המחקר היה נתמך על ידי מספר מענק R706-000-043-490. המחקר אינו מייצג את ההשקפה של נותן החסות המענק.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 15% מתיל 4-הידרוקסיבנזואט | סיגמא אולדריץ' | ||
| 4% פרפורמלדהיד | סיגמא אולדריץ' | P6148 | |
| בקטו אגר | BD biosciences | ||
| cncCK6/TM3, Sb | מתנה מד"ר קרפולה T | ||
| קמח תירס, גלוקוז, מבשלת שמרים | סיגמא אולדריץ' | ||
| סיאן ADP עם Summit Software | DAKO | https://flow.usc.edu/files/2014/07/BC-Cyan-ADP-User-Guide-2016.pdf | |
| Dihydroethidium (Hydroethidine) | Thermo Fisher Scientific | D11347 | |
| FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD biosciences | 556547 | |
| מיקרוסקופ פלואורסצנטי | Olympus | ||
| Glucolin | סופרמרקט | ||
| תוכנת | ImageJ NIH | ||
| MRC5 פיברובלסט ריאות אנושי | ATCC | CCL-171 | |
| שניידר s Drosophila בינוני | Thermo Fisher Scientific | 21720-024 | |
| Vectashield antifade הרכבה עם DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Wild-type Canton-S; Sod2N308/CyO | NIG-FLY | ||
| ננו-חלקיקי תחמוצת אבץ | סיגמא אולדריץ' | 721077 | עיין בגיליון 2 |
מקורות
- Kim, Y. R., et al. Toxicity of 100 nm zinc oxide nanoparticles: a report of 90-day repeated oral administration in Sprague Dawley rats. International Journal of Nanomedicine. 9 Suppl 2, 109-126 (2014).
- Xie, Y., He, Y., Irwin, P. L., Jin, T., Shi, X.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
