שימוש במאיץ ליניארי לניהול ניסויים רדיוביולוגיה ביולוגיה

סיכום

מאיצים ליניאריים קליניים יכולים לשמש כדי לקבוע את ההשפעות הביולוגיים של מגוון רחב של שיעורי מינון על תאים סרטניים. אנו דנים כיצד להגדיר מאיץ ליניארי עבור מבוסס התא בחני והוא אומר עבור תאים גזע כמו סרטן גדל כמו כדורי tumorspheres ההשעיה וקווי התאים הגדלים כמו תרבויות חסיד.

תקציר

טיפול הקרינה נשאר אחד אבני היסוד של ניהול סרטן. עבור רוב סוגי הסרטן, זהו הטיפול היעיל ביותר, לא כירורגי כדי debulk גידולים. כאן, אנו מתארים שיטה לאפשר האצת תאים סרטניים עם מאיץ ליניארי. קידום טכנולוגיית המאיץ הליניארי שיפר את הדיוק והיעילות של הטיפול בקרינה. ההשפעות הביולוגי של מגוון רחב של מנות קרינה וקצבי מינון ממשיכים להיות אזור אינטנסיבי של חקירה. שימוש במאיצים ליניארי יכול להקל על מחקרים אלה באמצעות מינונים רלוונטיים קלינית ושיעורי מינון.

מבוא

הקרנות היא טיפול יעיל עבור סוגים רבים של סרטן^1,2,3,4. מינון גבוה במיוחד הקרנה היא חדשה יחסית בטיפול בקרינה והיא מתאפשרת על ידי פיתוחים טכנולוגיים אחרונים במאיצים ליניארי⁵. היתרונות הקליניים של שיעור המינון הגבוה ביותר על פני מינון סטנדרטי הקרנה כוללים זמן טיפול מקוצר וניסיון משופר המטופל. מאיצים לינאריים מספקים גם הגדרה קלינית ללימודי הקרינה המבוססת על תרביות תאים. ההשלכות הביולוגי והתרפויטי של מינון הקרינה ושיעורי המינון מתמקדים בעניין של אונקולוגים קרינה וביולוגים במשך עשורים שלמים^6,7,8. אבל, הרדיוביולוגיה של תוספת במינון גבוה הקרנה הקרנה פלאש-שיעור מינון גבוה מאוד של קרינה-יש עדיין נחקר ביסודיות.

קרינת גמא משמשת רבות בביולוגיה רדיואקטיבית של תרבות התאים^9,10,¹¹. קרינה מושגת על ידי קרני גמא הנפלטת ממקורות איזוטופ רדיואקטיבי מדעיכה, בדרך כלל צסיום-137. שימוש במקורות רדיואקטיביים הוא מוסדר מאוד לעתים קרובות מוגבל. עם מקור מבוסס הקרנה, זה מאתגר לבדוק מגוון רחב של שיעורי מינון, הגבלת השירות שלה בניתוח של ההשפעות הביולוגית של המינון הקליני השגה שיעור¹².

היו מספר מחקרים הממחישים הן את המינון ואת ההשפעות שיעור המינון^{12,13,14,15,16,17}. במחקרים אלה, שימשו הן גמא-הקרנה מאיזוטופים רדיואקטיביים או קרני רנטגן שנוצרו ממאיצים ליניארי. מגוון של קווי תאים המייצגים סרטן ריאות, סרטן צוואר הרחם, גלינובלסטומה, ו מלנומה שימשו. השפעות קרינה על הישרדות התא, מעצר מחזור התא, ואפופטוזיס ונזק DNA הוערכו כמו קריאות^{12,13,14,15,16},¹⁷ . כאן, אנו מתארים שיטה להגדיר את ההשפעות הביולוגי של מינון קליני רלוונטי ושיעורי מינון על ידי אספקת רנטגן מבוסס קרינה באמצעות מאיץ ליניארי. יש לבצע מחקרים אלה בשיתוף פעולה הדוק בין הביולוגיה, אונקולוג הקרינה והפיזיקאי הרפואי.

פרוטוקול

1. הכנה תאית לתרבות התא ההשעיה

1. תרבות glioma גזע כמו תאים בתוך מדיה תרבות תא גזע בערך 5 x 10⁶ תא/10 ס"מ לוחות בחממה תרבות התא עם 5% CO₂, 95% לחות יחסית ב 37 ° c.
   הערה: תנאי תרבות התא זהה לאורך כל ההליכים. המדיה שבשימוש בפרוטוקול היא מדיה מלאה.
2. יומיים לפני הקרנה מתוזמנת, לאסוף בתאי גזע glioma מלוחית התרבות עם צינור 5 מ ל סטרילי לתוך שפופרת צנטריפוגה 15 מ ל בשכונה תרבות.
3. צנטריפוגה את התאים שנאספו ב 200 x g עבור 3 דקות בצנטריפוגה הדלפק.
4. השמט את הסופרנטאנט ועכל את הגלולה הסלולרית (כ-1 x 10⁷ תאים) עם 1 מ ל טריפסין-edta בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות כדי ליצור תא הבולם היחיד בטריפסין-edta. לנער בעדינות את החלק התחתון של צינורית צנטריפוגה כל 2 דקות במהלך העיכול כדי לוודא את התאים מתעכל ביסודיות.
5. הוסיפו 3 מ ל של מדיית תרבות תאי גזע (ראו את טבלת החומרים) כדי להרוות טריפסין. צנטריפוגה את התאים שנאספו ב 200 x g עבור 3 דקות בצנטריפוגה העליון הדלפק. למחוק את הסופרנטאנט ולשמור את הגלולה התא.
6. השהה מחדש את התאים עם 5 מ ל של מדיית תרבות התאים וספור את התאים באמצעות הומוציטומטר.
7. צלחת 5 x 10⁶ תאים ב2 10 ס"מ לוחות המכילים 10 מ ל של מדיה תרבות התא.
8. ממש לפני ההקרנה המתוכננת, לאסוף את התאים ולהיפטר supernatant לאחר צנטריפוגה כפי שמתואר בשלב 1.3. השהה מחדש את הגלולה הסלולרית עם 5 מ ל של מדיית תרבות התא. העבר 1 mL של השעיית התא לתוך צלחת 35 מ"מ המכיל 2 מ ל של מדיה תרבות התא.
   הערה: נפח המדיה הכולל הוא 3 מ"ל בלוח 35 מ"מ כדי להפוך את הנוזל 1 ס מ בגובה בצלחת.
9. העבר את התאים המוכלים במיכל משני, כגון קופסת פלסטיק או קצף, כדי להפחית את הסיכון להידבקות ולהביא את התאים במיכל למתקן ההקרנה בעגלת השירות.
10. הקרין את התאים כמתואר בשלב 4.

2. הכנה סלולרית לתרבות התא המצורפת

1. יום אחד לפני הקרנה, במכסה התרבותי של התאים, הסר את מדיית DMEM מלוחית תרבות התא של קו התא המחובר, כגון תאים HEK-293. ניתן לשאוב את התקשורת באמצעות פיפטה פסטר המחובר לוואקום.
2. שטוף תאים עם 5 מ ל של PBS סטרילי לצלחת התרבות כדי לשטוף את התקשורת שיורית.
3. פיפטה 1 מ ל טריפסין-אדטה לתוך קערת התרבות ולהטות בעדינות את לוחית התרבות כדי לוודא שמנה כולה מכוסה בטריפסין-אדטה.
4. טריזיליזציה של תאים בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. כיבוי התגובה טריפסין-EDTA עם 3 מ ל של מדיה DMEM זיכרון ולאסוף תאים עם צינור 5 מ ל לתוך 15 מ ל שפופרת צנטריפוגה במכסה התרבות.
5. צנטריפוגה את התאים שנאספו ב 200 x g עבור 3 דקות בצנטריפוגה העליון הדלפק. למחוק את הסופרנטאנט ולשמור את הגלולה התא.
6. השהה מחדש את התאים באמצעות 5 מ ל של מדיית DMEM וספור את התאים באמצעות הומוציטומטר.
7. צלחת 2 x 10⁵ תאים בצלחת 35 מ"מ באמצעות 3 מ"ל של מדיית תרבות התא לגובה של 1 ס מ של מדיה.
8. לאחר 24 שעות של תרבות התא בחממה ב 37 ° c, להעביר את התאים מצופה במיכל משני (כלומר, תיבת קצף מבודדים) למתקן הקרנה על עגלת השירות.
9. הקרין תאים כמתואר בשלב 4.

3. הכנה תאית להכתמים בעקבות הקרנה

1. הפשרת מטריצה מסחרית של מטריצת חלבון על הקרח ב -4 ° c בלילה. לפני הצינון 200 μL הצינורות ו 1.5 שפופרות צנטריפוגה mL ב 4 ° c בלילה.
2. באמצעות מטריצה מעשית מקורר מטריצת חלבון עם טיפים לפני מצוננים ו 1.5 mL שפופרות צנטריפוגה ב 200 μL לכל צינור.
3. לדלל 200 μL של מטריצה חלבון ממומנת בטרום מקורר 20 מ ל של מדיית תרבות התא כדי לבצע 1% מדיה מטריצה חלבון מטריתאי.
4. המקום שמיכות מעוקר (22 מ"מ x 22 מ"מ) בצלחת 35 מ"מ. מקום 400 μL של 1% מדיה מטריצות חלבון בתוך הכיסויים.
5. מניחים את הצלחת 35 מ"מ לתוך חממה לתרבות התא ב 37 ° c עבור 1 h כדי לאפשר מטריצת חלבון מגלותא לפולימולזציה על הכיסויים.
6. בעת שימוש בתרבות התא ההשעיה, לבצע השעיה תא בודד כפי שמתואר בשלבים 1.1 כדי 1.5.
7. צלחת 5 x 10⁴ תאים על מילוח חלבון מצופה מטריצה מצופים ממוקם בצלחת 35 mm. החזר תאים מצופים לחממה של תרבות התא למשך הלילה כדי להבטיח שהתאים נתמכים על ידי מטריצת החלבון. הנפח הכולל של המדיה בלוח צריך להיות 3 מ ל כדי להפוך את גובה המדיה להגיע 1 ס מ בצלחת התרבות.
8. להתבונן בתאים תחת מיקרוסקופ שדה בהיר עם עדשת ההגדלה 10x המטרה. התאים צריכים להתפשט על שמיכות במקום צף. העבר את הצלחת התרבותית עם תאים מצופים למכולה משנית כגון קופסת קצף למתקן ההקרנה בעגלת השירות ומקרין את התאים כמתואר בשלב 4.
9. בעת שימוש בתרביות תאים מחוברות (לדוגמה, HEK-293 תאים), לעכל תאים כמתואר בשלבים 2.1 ל2.6. מקום 5 x 10⁴ תאים על שובר כיסוי סטרילי בצלחת 35 מ"מ יום אחד לפני ההקרנה כדי לוודא תאים מחוברים באופן מלא משטח coverslip ידי התבוננות בהם תחת מיקרוסקופ כמו בשלב 3.9. השתמש 3 mL של מדיית DMEM כדי להפוך את הנוזל 1 ס"מ גובה בצלחת.
10. לאחר הגדלת תאים על שמיכות לילה או עד יום אחד, להעביר את קערת התרבות עם תאים מצופים במיכל משני למתקן הקרנה. עגלת השירות עשויה לשמש להפחתת הסיכון לניקוז. הקרין תאים כמתואר בשלב 4.

4. הקרנה עם מאיץ ליניארי (LINAC)

1. באמצעות תוכנת המסוף של linac, להגדיר את מאיץ גנטרי ו הקולמטר כדי 0 °, לפתוח את הלסתות X ו-Y ל סימטרי 20 X 20 ס מ² גודל שדה ולבטל את מספרי העלים המרובים (mlcs) אם קיים.
   הערה: לlinacs יכול להיות מצב חופשי של מסנן שיטוח (FFF), המאפשר שיעורי מינון גבוהים מאוד. כפי שהשם מרמז, קרינה זו אינה אחידה (שטוחה), ושיעור המינון הגבוה מושגת רק במרכז הקרן. במקרה זה משתמשים בשדה 7 x 7 ס מ² .
2. מניחים לפחות 5 ס מ החומר המקבילה של מים על ספת הטיפול. מניחים את הצלחת התא להיות לקרינה ב 400 MU/min (שיעור מינון סטנדרטי) על החומר המקבילה מים ומרכז אותו על הכוונת LINAC.
3. מניחים את התאים להיות לקרינה בעומק של מנה מקסימלית 6 MV X-ray קרן, סביב 1.5 ס"מ. מניחים עוד 1 ס מ של מים המקבילה החומר על גבי המנה. בשילוב עם 1 ס מ של בינוני לאורך התאים מושעה, זה מציב את התאים בעומק ממוצע של 1.5 ס מ.
4. צרף את המצביע הקדמי לראש ה-LINAC. הארך את המצביע הקדמי עד שהוא ייצור קשר עם פני השטח של חומר ההצטברות ושים לב למרחק. התאימו את גובה הטבלה עד שהמרחק מהמקור למשטח ההצטברות הוא 100 ס מ.
   הערה: ניתן לאשר את המרחק עם אינדיקטור המרחק האופטי. לחילופין, ניתן להשתמש במחוון המרחק האופטי במקום המצביע הקדמי כדי להגדיר את המקור למשטח הצטברות עד 100 ס מ.
5. חשב את המספר המתאים של יחידות הצג (MU) כדי לספק את המינון הרצוי של הקרינה לתאים ולתכנת את המאיץ לספק ב 400 MU/min.
   הערה: עבור הגדרת המקור אל פני השטח (SSD) ב-LINAC מכויל כדי לספק 1 cGy/MU בעומק המינון המרבי, המספר הנדרש של יחידות הצג מחושב באמצעות מינון MU = (cGy)/(1 cGy/MU)/של (20x20), היכן מעמדים לגורם פלט. יש לשנות חישוב זה עבור LINACs באמצעות הגדרות כיול חלופיות.
6. השאר את כספת הטיפול וודא שכל האנשים האחרים יצאו. ולפי שאין תאים אחרים בחדר, או שהם יקבלו מינונים נמוכים של קרינה. . סגור את דלת הכספת
7. אשר את גודל השדה, MU ו-MU/מינימום במסוף ולאחר מכן הפעל את הקרן.
8. חזור על שלבים 4.3-4.8 עבור התאים הניתנים לקרינה בקצב מינון גבוה יותר או נמוך יותר.
   1. כדי להשיג שיעורי מינון גבוה יותר (למשל, 2100 MU/min או יותר) עם המאיץ, להקטין את SSD כדי להגדיל את קצב המינון האפקטיבי לתאים לפי החוק הריבועי ההופכי: DoseRateEffective = Doserate * (100 ס"מ/SSD_New)².
   2. עבור שיעורי במינון נמוך (למשל, 20 MU/min), להגדיל את המקור למרחק פני השטח (SSD_New) כדי להקטין את קצב המינון. לדוגמה, ניתן להניח את הצלחת תרבות התא על רצפת חדר הטיפולים.
   3. חשב מחדש את הגדרת יחידת הצג על המאיץ אם יש צורך בכיוונון זה, באמצעות מינון MU = (cGy)/(1 cGy/MU)/של (20x20)/(100 ס"מ/SSD_New)². לקבלת מידע נוסף על חישובי MU, עיין בסימוכין של מקדרמוט ואורטון¹⁸.
9. קבע את קצב המינון ב-Gy/דקה על-ידי DoseRate (Gy/דקות) = מינון (Gy) * (MU/min)/MU. לדוגמה, 4 Gy נמסר ב 400 MU/min דורש 380 MU, כך 4 * 400/380 = 4.2 Gy/min. ראה שולחן 1.

איור 1 : הגדרת צלחת תרבות התא על מאיץ ליניארי. (א) מאיץ ליניארי קליני מוצג. (ב) 5 ס מ של חומר שווה מים מונח על ספת הטיפול. (ג) צלחת תרבות התא מונחת על פני השטח של החומר. (ד) התבשיל ממורכז באמצעות כלי האצה בשדה הטיפול המוצג על ידי שדה האור המרובע. (ה) 1 ס מ מים חומר שווה ערך ממוקם על גבי הצלחת תרבות התא. מקור לפני השטח (SSD) נבדק באמצעות מחוון מרחק אופטי (F, G) או מצביע קדמי (H, I). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

5. מאמר ביולוגי לאחר הקרנה

1. לאחר הקרנה, החזר את התאים לחממה של תרבות התא באותו אופן כפי שמתואר לעיל (שלב 1.9, 2.8 ו-3.10).
2. בהתאם לצורך, יש להתאים מגוון רחב של שכתוב ביולוגי כדי להשתלב בפרויקט המחקר.
   הערה: כאן, אנו מציגים ניתוח מחזור תאים מייצג¹⁶ כדוגמה לבדיקה ביולוגית בעקבות הקרנה.

תוצאות

כדי לחקור את האפקט של מחזור התא של שיעור מינון סטנדרטי תוספת מינון גבוה הקרנה על ידי מאיץ ליניארי, שלוש דגימות של תאים גזע glioma הוכנו באמצעות פרוטוקול זה ואסף 24 שעות לאחר הקרנה¹⁷: אחד בקרת דגימת זה לא היה לקרינה (איור 2א), מדגם אחד הקרינה עם 400 MU/min (יחידת לפקח, 4.2 gy/min סטנדרטי מינון, איור 2ב) כדי 4 Gy, ועוד דוגמה הקרינה עם מינימום של 2100 MU/min (21.2 gy/דקות תוספת מינון גבוה יותר,

דיון

הקרנות הוא חלק אינטגרלי של ניהול סרטן. מאמצים שוטפים מבקשים לשפר את היעילות והיעילות של טיפול בקרינה. פיתוחים בטכנולוגיית המאיץ הליניארי סיפקו את ההזדמנות לטפל בחולים בדיוק ובטיחות חסרי תקדים. מכיוון שרוב המטופלים מטופלים עם קרני רנטגן גבוהות ממאיצים ליניארי, מחקרים בוחנים את ההשפעות הביולוגיים של מגוון רחב של שיעורי מינון שבוצעו על מאיצים ליניאריים ניתן להחיל בקלות על חולים. היו כמה דוחות החלת מאיצים ליניאריים למחקר ביולוגיה קרינה, אבל תוצאות מעורבים ומחקרים נוספים נחוצים^13,

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
<חזק>חומרי
גליומה תא דמוי גזע 387			מתנה מד"ר ג'רמי ריץ'
293 תאים	ATCC	CRL-1573
נוירונים תרבית תאי גזע מדיה תרמו	פישר מדעי	21103049	נוירו-בסיסיTM מדיה
DMEM	תרמו פישר מדעי	10569044
סרום בקר עוברי	תרמו פישר	16000044
פניצילין/סטרפטומיצין	תרמו פישר סיינטיפיק	15140-122
חלבון EGF אנושי רקומביננטי	R& D Systems	236-EG-01M
אנושי רקומביננטי בסיסי	D Systems	4114-TC-01M
B-27 ומסחר; תוסף	Thermo Fisher Scientific	17504044
נתרן פירובט	Thermo Fisher Scientific	11360070
L-גלוטמין	תרמו פישר Scientific	25030164
Tripsin-EDTA	Thermo Fisher	25200056
מטריצת פרוטן חוץ-תאית	Corning	354277	MatrigelTM
אתנול	פישר כימי	A4094
<חזק>ציוד
10 ס"מ צלחת תרבית תאים	דנוויל	T1110
3.5 ס"מ צלחת תרבית תאים	ארה"ב סיינטיפיק בע"מ.	CC7682-3340
22x22 מ"מ כיסוי זכוכית להחליק	אלקטרונים מיקרוסקופיה מדעי	72210-10
15 מ"ל צינור צנטריפוגה	תומאס סיינטיפיק	1159M36
50 מ"ל צינור צנטריפוגה	תומאס סיינטיפיק	1158R10
5 מ"ל פיפטה	פישר סיינטיפיק	14-955-233
פיפט סייד	פישר סיינטיפיק	13-681-06
מערבל מערבולת	פישר סיינטיפיק	02-215-414
צנטריפוגה	Eppendorf	5810R
מאיץ ליניארי	Varian	n/a
חומר שווה ערך למים	Sun Nuclear Corporation	557	מים מוצקיםTM
<הכנת ריאגנטים>
מדיה DMEM	10% סרום בקר עוברי (FBS), 2 מ"מ L-גלוטמין, 100 יחידות/מ"ל פניצילין G, 100 ומיקרו; גרם/מ"ל סטרפטומיצין ב-500 מ"ל מדיה
מדיה תרבית תאי גזע	10 מ"ל תוסף B27, 20 ומיקרו; g hFGF, 20 ומיקרו; g hEGF, 2 מ"מ L-גלוטמין, 100 יחידות/מ"ל פניצילין G, 100 ומיקרו; גרם/מ"ל סטרפטומיצין ב-500 מ"ל מדיה