Method Article

יישום של מיקרוסקופ רפלקציה הפרעות עבור הדמיה ללא תווית, במהירות גבוהה של Microtubules

DOI:

10.3791/59520

⸱

August 8th, 2019

 , 
1Department of Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University, 2Harvard Medical School, Harvard University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה הוא מדריך ליישום מיקרוסקופ הפרעות הפרעה על מיקרוסקופ מתקן פלואורסצנטית רגיל עבור תוויות ללא תווית, ניגודיות גבוהה, הדמיה במהירות גבוהה של microtubules באמצעות משטחי החוץ מבחנה assays.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ישנן מספר שיטות לדמיין biomolecules מטוהרים ליד משטחים. סה כ-פנימי השתקפות פלואורסצנטית (TIRF) מיקרוסקופ היא שיטה נפוצה, אבל יש את החיסרון כי זה דורש תיוג פלורסנט, אשר יכול להפריע לפעילות של המולקולות. כמו כן, הלבנת והנזק לתמונות הן חששות. במקרה של microtubules, גילינו כי תמונות של איכות דומה ל-TIRF ניתן להשיג באמצעות מיקרוסקופ הפרעות רפלקציה (IRM). הדבר מרמז על כך ש-IRM עשוי להיות טכניקה כללית לצורך המחשה של הדינמיקה של biomolecules גדולים ושל oligomers בתוך מבחנה. במאמר זה, אנו מראים כיצד ניתן לשנות מיקרוסקופ פלואורסצנטית פשוט להשגת תמונות IRM. IRM קל והרבה יותר זול ליישם מאשר טכניקות ניגודיות אחרות כגון הפרעות דיפרנציאליות חדות מיקרוסקופיה או פיזור אינטרמטרי. הוא גם רגיש פחות פגמים פני השטח ואת הפתרון זיהומים מיקרוסקופית שדה ושלכת באמצעות IRM, יחד עם תוכנת ניתוח התמונה המתוארת בנייר זה, שדה התצוגה וקצב המסגרות מוגבל רק על-ידי המצלמה; עם מצלמה sCMOS ואת אורך שדה רחב מיקרוכדורית ניתן למדוד עם דיוק עד 20 ננומטר עם רוחב פס של 10 Hz.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדמיה ללא תווית של microtubules הוא עניין כפי שהוא חוסם את הצורך תיוג פלורסנט של טובולין כדי ליצור ניגודיות בתמונות. תיוג פלורסנט יש החסרונות מספר: זה לא ריאלי אם ריכוז החלבון הוא נמוך1 ו-photobleaching לבנה ו-photobleaching הגבלת זמן התצפית. מספר טכניקות שימשו לתמונה ללא תווית microtubules, כולל וידאו משופר הפרעות דיפרנציאליות מיקרוסקופית הניגוד (DIC) ו ושלכת מיקרוסקופ2,3,4,5. לאחרונה, מיקרוסקופ פיזור הפרעות בהפרעות (iSCAT)6, מיקרוסקופ מסתובב קוהרנטי-פיזור (rocs)7 ומיקרוסקופ הפרעות אור מרחבית (רזה)8, יש גם שימשו. כל הטכניקות הללו מסוגלות הדמיה microtubules והוכיחו להיות ערך עבור לימוד מיקרואוכדורית. עם זאת, לכל אחד מהם יש מגבלות משלהם. ב-DIC הניגודיות תלויה בזווית שבין המיקרו-כדורית לציר הפריזמה של נוארסקי.  בשדה האפל, האות המיקרוכדורית מושפל באור מפוזר מזיהומים או פגמים במשטחים. למרות iSCAT מציג רגישות יוצאת דופן (למטה לחלבונים בודדים) ו ROCS יכול התמונה microtubules עמוק יותר לתוך המדגם, שתי השיטות הן בדרישה טכנית, הדורשות סורקי לייזר.

פרוטוקול זה מדגים כיצד מיקרוסקופ הפרעות רפלקציה (IRM)9,10 ניתן להגדיר כטכניקה חלופית עבור הדמיה ללא תווית של microtubules. IRM קל ליישם כפי שהוא דורש רק את התוספת של מראה 50/50 זולה למיקרוסקופ פלורסנט רגיל. כאשר נעשה שימוש בשילוב עם התוכנה המתוארת כאן, IRM מפיק תמונות מיקרוכדורית בחדות גבוהה, ניתן לדמות שדות גדולים של תצוגה במהירות גבוהה, מחייב יישור חד פעמי, והוא יכול בקלות להשתלב עם טכניקות אחרות כגון הדמיה פלואורסצנטית.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. שינוי מיקרוסקופ ועדשה אובייקטיבית

  1. הכנס מראה 50/50 לתוך גלגל המסנן של מיקרוסקופ הפלורסנט באמצעות קוביית סינון מתאימה (איור 1). לטפל במראה 50/50 עם טיפול לעתים קרובות יש להם ציפוי נגד השתקפות.
    הערה: השתמשנו 50/50 מראה בקוביית מסנן ריקה של המיקרוסקופ. השיקוף 50/50 מוכנס במקום שבו ממוקמת השיקוף הדיקרואיק.
  2. השתמש במטרה גבוהה הגדלה/גבוהה NA שמן.
    הערה: בפרוטוקול זה השתמשנו במטרה של 100x/1.3 NA.

2. הכנה קאמרית לדבוק במיקרוטובוקלס לפני השטח

  1. ניקוי שקופיות מיקרוסקופ ו 22 מ"מ x 22 מילימטר שמיכות (עבור מיקרוסקופ זקוף) או 22 מ"מ x 22 מ"מ ו 18 מ"מ x 18 מ"מ שמיכות (עבור מיקרוסקופים הפוכה). שנה את המשטח לפי הצורך. לדוגמה, לנקות את הכיסויים באמצעות אבקת כביסה אלקליין (ראה טבלת חומרים) ואחריו 100% אתנול עם שטיפת מים מזוקקים בין ואחרי11.
  2. גזור 3 מילימטר רצועות רחב של סרט פרפין פלסטיק (ראה טבלת חומרים) באמצעות להב תער ושקופית אחרת מיקרוסקופ כקצה.
  3. מניחים שני הסרט הפרפין פלסטיק שקופיות 3 מ ' בנפרד על שובר נקי 22 x 22mm לכסות. ואז למקם שמיכות 18 מ"מ x 18 מ"מ כדי ליצור ערוץ. אם באמצעות מיקרוסקופ זקוף, למקם את הרצועות על גבי שקופית מיקרוסקופ נקי ולאחר מכן למקם שמיכות על גבי.
  4. מניחים את הcoverslip (או שקופית) על בלוק חום ב 100 ° c עבור 10-30 s עבור הסרט פרפין ליצור ערוץ אטום.
  5. זרימה ב 50 μg/mL של נוגדן (ברינקלי מאגר 1980 (BRB80)) על ידי זלוף באמצעות פיפטה. . מודטה למשך 10 דקות
    הערה: אנו משתמשים בנוגדנים אנטי-רומדנים כדי לאגד זרעים מיקרודכדורית המסומנים לפני השטח. לחילופין, ניתן להשתמש באבידין כדי לאגד זרעים מיקרוכדורית ביוטין או לחלקיקי זהב ביולוגיים. כדי פשוט להסתכל microtubules בהעדר טובולין בפתרון (כלומר, שיטת לא דינמי), נוגדן אנטי טובולין ניתן להשתמש.
  6. שטוף חמש פעמים עם BRB80 מאגר. מומלץ לסנן את הפתרונות באמצעות מסנן של 0.22 יקרומטר.
  7. זרימה ב 1% poloxamer 407 (משולש סופולימר triblock) ב BRB80 לחסום את פני השטח מפני איגוד לא ספציפי. . מודטה למשך 10 דקות
  8. שטוף חמש פעמים עם BRB80 מאגר.
  9. המדגם מוכן להיות ממוקם על המיקרוסקופ. כדי למנוע את הדגימה מייבוש, להוסיף שתי טיפות של BRB80 מאגר בקצות הערוץ ולחדש בעת הצורך.

3. יישור מיקרוסקופ

  1. מניחים את הדגימה על הבמה במיקרוסקופ. . תדליק את מקור התאורה של האפינפרין
  2. . תתרכז במשטח הדגימה תוכלו להתבונן משטחים מרובים כמטרה מועברת למעלה ולמטה עקב השתקפות הגב של האור מן האופטיקה בתוך הנתיב האופטי. שיטה טובה למצוא את משטח המדגם היא להתמקד בקצה הסרט פרפין. לאחר השטח נמצא, להגדיר את שדה התצוגה למרכז החדר.
  3. המרכז את הסרעפת בשדה התצוגה על-ידי סגירתו במחצית הדרך ושימוש בברגים הכוונון. לאחר היישור, פתח מחדש את הסרעפת.
    הערה: התאמת בורג צריך רק להיעשות מתמיד, אולי כל 3-6 חודשים או כאשר פתרון בעיות.
  4. שקופית בעדשה ברטרנד כדי לראות את האישון היציאה (מטוס מוקד) של המטרה.
  5. סגור את דיאפרגמה הצמצם (AD) מעבר לקצות האישון של המטרה.
  6. השתמש בורגי ההתאמה כדי למרכז את המודעה עם תלמיד היציאה. בדיקה כפולה על ידי פתיחת המודעה והתאמת הקצוות שלה עם אלה של התלמיד יציאה.
    הערה: יש לבצע התאמה זו רק כדי לעשות זאת.
  7. הגדר את דיאפרגמה הצמצם על 2/3 של NA של המטרה. ראה סעיף 7 להליכים מפורטים למיטוב דיאפרגמה הצמצם.

4. הדמיה microtubules מיוצב או 40 ננומטר זהב

הערה: microtubules מיוצב וחלקיקי זהב לשמש דגימות שליטה טובה. מומלץ משטח תמונה המצורפת microtubules או חלקיקי זהב כצעד הראשון כדי להעריך את ביצועי IRM ולעזור בקביעת פתיחת הצמצם האופטימלי הסרעפת (סעיף 7).

  1. להגדיר את זמן החשיפה של המצלמה 10 ms ולהתאים את התאורה כדי להרוות כמעט את טווח דינמי המצלמה.
  2. זרימה 10 μl של guanylyl-(אלפא, בטא)-מתילן-diphosphonate (gmpccp)-או microol מיוצב מיקרוטוקלס ב BRB804,12,13 (או 40 ננומטר חלקיקי זהב) על ידי פרזיה באמצעות פיפטה למדגם טרי ולפקח איגוד על ידי הדמיה של פני השטח. ברגע 10-20 microtubules מאוגדים בתוך שדה התצוגה, לשטוף את המדגם 2x עם BRB80.
    הערה: עם מיקרוסקופ מיושר היטב, המיקרוטובולים צריכים להיות גלויים ללא חיסור הרקע.
  3. לרכוש 10 תמונות על ידי קביעת הפקיעה שעה עם 1 תקופת השהיה השנייה עבור 10 שניות (ב 10 ms חשיפה).
  4. לרכוש תמונת רקע. כדי לעשות זאת, להעביר את השלב באמצעות בקר הבמה או תוכנת המחשב לאורך ציר הערוץ ארוך תוך רכישת 100 תמונות ללא דיחוי (כלומר, הזרמת קרוב 100 fps @ 10 ms חשיפה).
    הערה: הרקע הוא החציון של 100 תמונות. על ידי נקיטת החציון, פרופיל תאורה ותכונות נייחים אחרים כמו לכלוך על האופטיקה נשמרים כל השאר מסוננים. לא צריך להיות הטיה על המדגם כמו זה יוביל לשנות את מיקום הציר כמו השלב מועבר ובסופו של דבר לבזות את תמונת הרקע. אם לא ניתן למנוע את ההטיה, אז שיטה חלופית היא לרכוש תמונות רקע ממוצעים לפני הזרמת הזרעים.
  5. לעיבוד וניתוח של התמונות, עבור לשלב 6.

5. הדמיה מיקרודינמיקה

  1. כדי להשתמש בטובולין המוח, הגדר את טמפרטורת התנור לדוגמה ל-37 ° c.
  2. זרימה ב 10 μl של gmpccp התייצב מחדש זרעים מיקרו ב11 על ידי זלוף באמצעות פיפטה למדגם טרי ולנטר אותם קשירה על פני השטח על ידי הדמיה פני השטח חיים (כלומר, בעת הזרמת). לאחר 10-20 הזרעים מאוגדים בשדה התצוגה, לשטוף את המדגם באמצעות נפח 2x ערוץ עם BRB80 (BRB80 צריך להיות מראש עד 37 ° צ' או לפחות בטמפרטורת החדר).
    הערה: עם מיקרוסקופ מיושר היטב, הזרעים צריכים להיות גלויים ללא חיסור הרקע.
  3. זרימה בתמהיל הפילמור (7.5 μm מטובולין + 1 מ"מ guanosine טריפוספט) + 1 מ"מ (dtt) במאגר BRB80). למדידת צמיחה מיקרוכדורית, לקבוע זמן פקיעה באמצעות תוכנת הרכישה לרכוש תמונה כל 5 שניות (0.2 מסגרות לשנייה (fps)) עבור 15 דקות.
  4. כדי לשפר את הניגודיות, לרכוש 10 תמונות (במקום אחד) בכל נקודה וממוצע אותם. עבור הצטמקות מיקרוטובית, לרכוש תמונות ב 100 fps על ידי הגדרת העיכוב זמן 0 ו זמן חשיפה של 10ms (fps גבוה יותר אפשרי עם אזורים קטנים יותר של ריבית בהתאם למצלמה בשימוש).
  5. לרכוש תמונת רקע כמו בשלב 4.4.

6. עיבוד תמונה וניתוח

הערה: לצורך ניתוח, פרוטוקול זה משתמש בפיג14 אך הקורא חופשי להשתמש בכל תוכנה שהיא/הוא מתאים לו.

  1. פתח תמונות רקע שמורות.
  2. חישוב התמונה החציוני (כלומר רקע) באמצעות תמונה > הפרוייקט ' מחסנית ≫ Z ' ≫ חציון.
  3. פתח סרט למיקרו-כדורית כערימה (זהה עבור microtubules שאינם דינאמיים) באמצעות הקובץ ≫ פתיחה.
  4. הפחת את תמונת הרקע מהמחסנית באמצעות תהליך > מחשבון תמונה. הקפד לבדוק את התוצאה "32bit (ציפה)" אופציה.
  5. עבור microtubules דינאמי, באמצעות הכלי קו לצייר קו לאורך המיקרוכדורית של עניין ולהוסיף אותו לאזור של מנהל הריבית על ידי לחיצה על "t". חזור על כל המיקרוטובולים המעניינים.
  6. עבור microtubules דינאמי, הפעל את מאקרו Multi-Kymo (קובץ משלים 1). המאקרו יפיק וידאו ו-kymograph עבור כל מיקרוטוכדורית במנהל ROI. . כל מיקרוטוכדורית יקבלו מזהה ייחודי
  7. עבור microtubules דינאמי, להפעיל את המאקרו Kymo ניתוח (קובץ משלים 2) ובצע את הצעדים שלה כדי למדוד את שיעורי הצמיחה ואת שיעורי הצטמקות של microtubules.

7. גודל הסרעפת הצמצם

הערה: גורם חשוב להשגת תמונות חדות גבוהה של microtubules באמצעות IRM הוא הגדרת הצמצם מספריים תאורה (INA) כראוי10,15. ניתן לשנות את האפשרות לשנות את הגודל של קרן התאורה הנכנסת באישון של המטרה הנשלט על-ידי גודל המודעה (ad ממוקם במישור המשלים עם התלמיד היציאה (מטוס מוקד לאחור) של המטרה , איור 1):
figure-protocol-1
כאשר DAD הוא קוטר של סרעפת הצמצם, fהמטרה היא אורך המוקד של המטרה ו -Dep הוא קוטר של המטרה של היציאה של היעד. בדרך כלל, ה-AD נשאר פתוח לחלוטין עבור הדמיה פלואורסצנטית, כך INA שווה NAשל המטרה. במיקרוסקופ פלואורסצנטית, סולם המודעה אינו מצביע על קוטרו, ולכן אי אפשר לחשב אותה. ניתן לכייל את גודל המודעה בעזרת מטרה. עם זאת, הדבר אינו נחוץ מכיוון שגודל המודעה יתוקן לגודל היוצר את הניגודיות הגבוהה ביותר.

  1. הכינו דגימה של microtubules התייצב על ידי מיקרוטובוקלס מיוצב על פני השטח (שלבים 4.1-4.2).
    הערה: השתמשנו טטרמתירומדאן בתווית microtubules16 (Ex: 550 ננומטר, Em: 580 nm).
  2. הביאו microtubules לתוך המוקד באמצעות מיקרוסקופ התמקדות כפתור תוך הדמיה בלתי מרוכזת (אם microtubules אינם מתויג, לדמות אותם עם IRM15 או DIC5).
  3. הגדר חשיפה למצלמה 10 ms באמצעות תוכנת המצלמה.
    הערה: חשיפה זו היא שרירותית וחשיפה של 100 ms יעבוד גם.
  4. סגור את המודעה לפתח הקטן ביותר שלה. כוונן את התאורה כדי להרוות כמעט את הטווח הדינמי של המצלמה או עד למקסימום האפשרי.
    הערה: כמדריך, השתמש בטבלת המראה המסופקת בדרך כלל על-ידי תוכנת הרכישה.
  5. לרכוש 10 תמונות (על ידי זרימה או לקיחת תמונה כל שנייה) של שדה של נוף המכיל 10 + microtubules.
  6. לרכוש תמונת רקע כמו בשלב 4.4.
  7. שנה את גודל ה-AD וחזור על שלבים 7.5-7.6 לכל טווח הפתיחה של המודעה (מסגירת האישון ועד לגודל היציאה, איור 2). בכל פעם שגודל המודעה משתנה, התאימו את עוצמת התאורה שתתאים לשלב 7.4.
  8. עבור כל שדה תצוגה שנרכש, הפחת את הרקע המתאים באמצעות תהליך > מחשבון תמונה ובחירת "חיסור" מהתפריט הנפתח. ודא כי האפשרות "32bit (ציפה)" מסומנת. לאחר מכן, הממוצע תמונות שנוצרו באמצעות תמונה > חסנית > פרוייקט Z > ממוצע.
  9. מדוד את יחס הרעש לרקע (SBR) של המיקרוטובולים המוגדרים כעוצמה הממוצעת של האות המיקרו-כדורית (האינטנסיביות של המיקרו-כדורית פחות את עוצמת הרקע) מחולקת בסטיית התקן של הרקע ( איור 3).
  10. לקבוע את גודל AD האופטימלי (כלומר אופטימלית INA) על ידי חישוב sbr הממוצע של microtubules עבור כל גודל הפתיחה ולהגדיר את גודל המודעה לאחד לייצר את sbr הגבוהה ביותר (איור 2). ייתכן שקיים מגוון של גדלי AD המייצרים ניגודיות דומה15.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כפי שהוזכר לעיל, עם מיקרוסקופ מיושר היטב, microtubules צריכים להיות גלויים ללא הרקע חיסור (איור 4A). הפחתת הרקע (איור 4B) מגבירה את הניגודיות של המיקרו-כדורית (איור 4b). כדי לשפר עוד יותר את הניגודיות, ממוצע או סינון פורייה או שילוב של שניהם ניתן להשתמש (איור 4D, F, E). הקווים סריקות באיור 4G מראה את השיפור המצטבר של איכות התמונה. שים לב להפחתת רעשי הרקע בכל שלב בעיבוד.

דוגמאות לקימוגרפים של מיקרוטוכדורית שנוצרו מסרטים בזמן הפקיעה מוצגים באיור 5. קטעי וידאו נרכשו בשני תעריפי מסגרת: 0.2 fps (איטי) ו 100 fps (מהר). הראשון מתאים למדידת קצבי צמיחה, והאחרון מתאים יותר למדידת שיעור הצטמקות המהווה סדר גודל מהיר יותר מקצב הצמיחה.

עבור המקרה שבו חלקיקי זהב משמשים להגדרת המיקרוסקופ, תמונה לדוגמה מוצג באיור 6. חלקיקי זהב היו מחוברים בפסיביות לפני השטח. בעוד 40 מומלצים חלקיקים ננומטר, ניתן גם לדמות 20 חלקיקים nm, עדיין בניגוד נמוך.

figure-results-1
איור 1. ייצוג סכימטי של IRM. (א) אפינפרין-תאורה ממקור האור עובר דרך דיאפרגמה הצמצם לפני שהגיע 50/50 המראה. הסרעפת הצמצם מגדירה את רוחב הקרן ובכך NA התאורה. מראה 50/50 משקף באופן חלקי את האור עד המטרה כדי להאיר את המדגם. אור שמשתקף מן המדגם נאסף ולאחר מכן מוקרן על שבב המצלמה (על ידי עדשת הצינור) שבו הוא מפריע ליצור את התמונה. ניגודיות תמונה היא תוצאה של ההפרעה בין האור המשתקף מממשק הזכוכית/המים (I1) והאור המשתקף מממשק המים/המיקרוכדורית (I2). בהתאם למרחק המיקרוכדורית/פני השטח (h), ההפרש בין הנתיב האופטי בין I1 ו-I2 יגרום בונה (אות בהיר) או הרסני (אות כהה) או כל דבר בין. לדוגמה, אם אור עם אורך גל של 600 ננומטר משמש לדימות, הניגוד ישתנה בין כהה לבהיר כאשר שינויים בגובה המיקרו-כדורית על-ידי כ 100 ננומטר. הכוכבית מציינת מישורים מהמשלים (משתנה מ-15). (ב) דוגמה להתקנת השיקוף 50/50. קוביית פילטר מתאימה נפתחה והמראה הוכנס למקום בו מראה דיקרואיק בדרך כלל. המראה הונחה לפי הוראות יצרן. לאחר מכן הקוביה הוכנסה לגלגל הסינון שהוכנס חזרה למיקרוסקופ (לא הוצג). במהלך ההתקנה, שימשו כפפות, והמראה הוחזקו רק בקצוות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2. הגדרת דיאפרגמה של צמצם אופטימלית. (A) אותו שדה של השקפה היה בתמונה בפתח הצמצם שונים הסרעפת ללא חיסור הרקע. באופן חזותי, הניגוד גדל ככל שגודל הסרעפת עלה עד שהוא הגיע לרמה והחל לבזות לאחר מכן. זה אושר על ידי (ב) sbr מדידות של תמונות רקע מופחתים. קווי שגיאה הם סטיית תקן.  סרגלי קנה מידה הם 500 יקרומטר (AD) ו-3 יקרומטר (microtubules). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3. . מדידת יחס הרעש לרקע מיקרוטובולים היו מבודדים. באזורי עניין כל אזור מעניין היה thresholded להפריד את המיקרוכדורית מהרקע. האות המיקרוכדורית הממוצעת הושגה מסריקת קו על פני המיקרוכדורית. רוחב שורת הסריקה הוגדר כשווה לאורך המיקרו-כדורית. בדרך זו, כל נקודה בסריקה מהווה ממוצע של האותות של כל הפיקסלים לאורך ציר המיקרו-כדורית המקביל לנקודה זו. רעשי הרקע הם סטיית התקן של כל הפיקסלים שמתחת לסף מנותקים.  אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4. עיבוד תמונה. לאחר רכישת תמונות raw (א), הרקע (ב) היה מופחתים (ג) כדי לשפר את הניגודיות המיקרוכדורית. כדי לשפר עוד יותר את הניגודיות התמונות היו ממוצעים (D) או פורייה מסוננים (E) או שניהם (F). השורה סורקת (G), אשר מיקומו מצוין על-ידי הקו האדום המקווקו (a) הם צבע מותאם לתמונות השונות ב ( א) ל (F). המספרים בפינה התחתונה הם ממוצע SBRs נמדד עבור כל שדה הראייה. סרגל קנה המידה הוא 5 יקרומטר (שונה מ15). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5. דוגמאות של קימוגרפים. (א) הדוגמאות kymograph של מיקרודינמיקה שנוצר מסרטים בזמן פקיעה שנרכשו ב 0.2 fps. (ב) kymograph המתאר דוגמה של אירוע הצטמקות שנוצר מסרט שנרכש ב 100 fps. קווים מקווקווים מסמנים את הזרעים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6
איור 6. דוגמה של חלקיקי זהב בתמונה עם IRM. זהב חלקיקים של גדלים 20 ו 40 ננומטר היו מחוברים בפסיביות על פני השטח. 10 תמונות נרכשו. לאחר החיסור הרקע, התמונות היו ממוצעים כדי לשפר את הניגודיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-7
איור 7. אורך מיקרוכדורית מעקב אחר דיוק בתמונות IRM. Microtubules התייצב (כלומר, אורכים קבועים) היו התמונה 200x ב 100 fps אז בממוצע כדי 10 fps כדי לשפר את הניגודיות. לאחר מכן, אורכם של microtubules נמדדה באמצעות תוכנת מעקב של פייסטה17 . עבור כל מיקרוכדורית האורך הממוצע וסטיית התקן חושבו כפי שמוצג בדמות (קו מקווקו מייצג את הקווים האדומים הממוצע מייצג את סטיית התקן, אורך = 3971 ± 20 ננומטר. דיוק המעקב הכולל היה הממוצע של סטיית התקן של כל microtubules מסומנים (n = 6 microtubules x 20 נקודות נתונים = 120 נקודות נתונים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

קובץ משלים 1. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. 

קובץ משלים 2. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. 

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה הפגין את השימוש המוצלח ב-IRM לדימות ולמדידה של הדינמיקה המיקרוכדורית. הטיפול צריך לתת נכונה להגדיר את הצמצם מספריים תאורה כפי שיש לו את ההשפעה החזקה ביותר על ניגודיות התמונה. גם, באמצעות הצמצם מספריים גבוהה (NA) מטרות חשוב לקבלת ברזולוציה גבוהה/תמונות חדות גבוהה, כמו מטרת NA גבוהה יותר יש אור גבוה יותר איסוף כוח לעומת מטרות NA נמוכה. המנקה את פני השטח ואת הפתרונות השתמשו הנמוך את הרעש כמו עפר בסופו של דבר הצמדת אל פני השטח והוספת (במהלך הניסוי) מיוחד כמו רעש לתמונות. הרכישה של תמונת רקע חשובה, כמו גם היא מסירה את התאורה מתאים, רעש סטטי וחריגות פני השטח.

שינוי מומלץ הוא להציג מסנן מעבר ארוך (> 600 ננומטר) בנתיב התאורה. הספקטרום של מקורות אור לבן בדרך כלל מכיל אורכי גל UV אשר יכול לפגוע microtubules. בנוסף, שימוש באורך גל ארוך עבור IRM שימושי כאשר משלבים את IRM עם הקרינה הפלואורסצנטית (למשל, כשאתה לומד את ההשפעה של חלבונים הקשורים למיקרו-כדורית (מפות) על מיקרוטוכדורית. להיות מודע לכך כאשר הדמיה לתקופה של שעות, לדוגמה להיסחף (במיוחד לאורך הציר האופטי) מקטין את ניגוד התמונה עקב סטייה של מישור התמונה מהמטוס ברקע. מיקרוסקופים מודרני מצוידים לעתים קרובות עם מנגנוני ייצוב (למשל, פוקוס מושלם (ניקון), מיקוד מובהק .2 (Zeiss), IX3-ZDC2 (אולימפוס)). פתרון אלטרנטיבי הוא לייצב את ההתקנה באופן פסיבי או פעיל18 או על ידי תיקון להיסחף19,20,21. בסופו של דבר, ניגודיות מיקרוכדורית יכולה להיות מוגברת על ידי הקטנת גודל הסרעפת (a 70% פתיחה היא בחירה טובה כפי שהוא איזון בין הניגודיות הגוברת והשדה של גודל תצוגה)15.

בעוד IRM מתאים לדימות microtubules הוא לא רגיש מספיק כדי לזהות חלבונים בודדים. עבור יישום כזה, iSCAT היא טכניקה מתאימה יותר. באופן דומה, זריחה ו-iSCAT מתאימים יותר אם מעקב אחר דיוק של פחות מ 10 ננומטר נדרש. עבור IRM, דיוק המעקב הנמדד הוא ~ 20 ננומטר כמוצג באיור 7.

שימוש ב-IRM בפני השטח יכול ללכת מעבר microtubules; למשל, מנועים מולקולריים יכול להיות מתויג עם חלקיקי זהב מעקב כפי שהם אינטראקציה עם microtubules. בנוסף לצורה מתקדמת יותר של IRM המכונה מיקרוסקופ ניגודיות רפלקטיבי (RICM)22 יכול, בעיקרון, לשמש כדי לשפר עוד יותר את הניגודיות microtubules ולקבל דיוק מעקב גבוה יותר.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין קונפליקטים של עניין לגלות.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים לאנה לוקניאק ויין-ווי קואו לקריאה ביקורתית והערות על הפרוטוקול.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
מיקרוסקופNikonTi-Eclipseמיקרוסקופ הפוך המשמש לביצוע
מפצל קרן 50/50Chroma21000בעת הקנייה הקפד לבחור את מידות המפצל המתאימות לקוביה המשמשת במיקרוסקופ
NIKON PLAN FLUOR 100X/0.5-1.3 מטרת האיריסNikonMRH02902Imaging מטרה. למטרה זו יש קשתית כוונון NA שנפתחה
לחומר ניקוי אוניברסליSigma-aAldrichZ637181-2Lמשמש לניקוי כיסויים ושקופיות
סרט פרפין מפלסטיק (שם מסחרי Parafilm M)Sigma-aAldrichP7793משמש לבניית תעלות זרימה
נוגדן נגד TAMRAInvitrogenA-6397משמש לקשירת מולקולות המסומנות על ידי TAMRA (למשל מיקרו-צינוריות) למשטח הדגימה. RRID (AB_2536196)
Poloxamer 407 (שם מסחרי Pluronic F-127)Sigma-aAldrichמשמש לחסימת פני התעלה למניעת קשירה לא ספציפית
של ננו-חלקיקי זהב 40 ננומטרSigma-aAldrich753637משמש כמדגם בקרה
ננו-חלקיקי זהב 20 ננומטרSigma-aAldrich753610משמש כמדגם בקרה
Zyla 4.2 מצלמהAndorZyla 4.22048x2048 פיקסלים (6.5&מיקרו; m גודל פיקסלים) עם יעילות קוונטית של 72% וטווח דינמי של 16 סיביות
מעקב Feistahttps://www.bcube-dresden.de/fiesta/wiki/FIESTA
מיקרו-צינורותשהוכנו בבית (ראה הפניות בטקסט)
NA 1.3 Mucasol תוכנת מיוצבים

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. One-step purification of assembly-competent tubulin from diverse eukaryotic sources. Molecular Biology of the Cell. 23 (22), 4393-4401 (2012).">Widlund, P. O., et al. One-step purification of assembly-competent tubulin from diverse eukaryotic sources. Molecular Biology of the Cell. 23 (22), 4393-4401 (2012).
  2. Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies. The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1437-1448 (1988).">Walker, R. A., et al. Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies. The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1437-1448 (1988).
  3. Dynamics of microtubules visualized by darkfield microscopy: Treadmilling and dynamic instability. Cell Motility and the Cytoskeleton. 10 (1-2), 229-236 (1988).">Hotani, H., Horio, T. Dynamics of microtubules visualized by darkfield microscopy: Treadmilling and dynamic instability. Cell Motility and the Cytoskeleton. 10 (1-2), 229-236 (1988).
  4. Flexural rigidity of microtubules and actin filaments measured from thermal fluctuations in shape. The Journal of Cell Biology. 120 (4), 923-934 (1993).">Gittes, F., Mickey, B., Nettleton, J., Howard, J. Flexural rigidity of microtubules and actin filaments measured from thermal fluctuations in shape. The Journal of Cell Biology. 120 (4), 923-934 (1993).
  5. LED illumination for video-enhanced DIC imaging of single microtubules. J Microsc. 226 (Pt 1), 1-5 (2007).">Bormuth, V., Howard, J., Schäffer, E. LED illumination for video-enhanced DIC imaging of single microtubules. J Microsc. 226 (Pt 1), 1-5 (2007).
  6. Label-free Imaging of Microtubules with Sub-nm Precision Using Interferometric Scattering Microscopy. Biophysical Journal. 110 (1), 214-217 (2016).">Andrecka, J., Ortega Arroyo, J., Lewis, K., Cross, R. A., Kukura, P. Label-free Imaging of Microtubules with Sub-nm Precision Using Interferometric Scattering Microscopy. Biophysical Journal. 110 (1), 214-217 (2016).
  7. Label-free Imaging and Bending Analysis of Microtubules by ROCS Microscopy and Optical Trapping. Biophysical Journal. 114 (1), 168-177 (2018).">Koch, M. D., Rohrbach, A. Label-free Imaging and Bending Analysis of Microtubules by ROCS Microscopy and Optical Trapping. Biophysical Journal. 114 (1), 168-177 (2018).
  8. Label-Free Imaging of Single Microtubule Dynamics Using Spatial Light Interference Microscopy. ACS Nano. 11 (1), 647-655 (2017).">Kandel, M. E., Teng, K. W., Selvin, P. R., Popescu, G. Label-Free Imaging of Single Microtubule Dynamics Using Spatial Light Interference Microscopy. ACS Nano. 11 (1), 647-655 (2017).
  9. The Mechanism of Adhesion of Cells to Glass. The Journal of Cell Biology. 20 (2), 199-215 (1964).">Curtis, A. S. G. The Mechanism of Adhesion of Cells to Glass. The Journal of Cell Biology. 20 (2), 199-215 (1964).
  10. [2] Reflection interference contrast microscopy. Methods in Enzymology. 361, 34-47 (2003).">Weber, I. [2] Reflection interference contrast microscopy. Methods in Enzymology. 361, 34-47 (2003).
  11. Chapter 13 - Microtubule Dynamics Reconstituted In Vitro and Imaged by Single-Molecule Fluorescence Microscopy. Methods in Cell Biology. 95, 221-245 (2010).">Gell, C., et al. Chapter 13 - Microtubule Dynamics Reconstituted In Vitro and Imaged by Single-Molecule Fluorescence Microscopy. Methods in Cell Biology. 95, 221-245 (2010).
  12. Chapter 14 - Studying Kinesin Motors by Optical 3D-Nanometry in Gliding Motility Assays. Methods in Cell Biology. 95, 247-271 (2010).">Nitzsche, B., et al. Chapter 14 - Studying Kinesin Motors by Optical 3D-Nanometry in Gliding Motility Assays. Methods in Cell Biology. 95, 247-271 (2010).
  13. Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol. Nature. 277 (5698), 665-667 (1979).">Schiff, P. B., Fant, J., Horwitz, S. B. Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol. Nature. 277 (5698), 665-667 (1979).
  14. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).">Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  15. Label-free high-speed wide-field imaging of single microtubules using interference reflection microscopy. Journal of Microscopy. 272 (1), 60-66 (2018).">Mahamdeh, M., Simmert, S., Luchniak, A., Schäffer, E., Howard, J. Label-free high-speed wide-field imaging of single microtubules using interference reflection microscopy. Journal of Microscopy. 272 (1), 60-66 (2018).
  16. [39] Preparation of modified tubulins. Methods in Enzymology. 196, 478-485 (1991).">Hyman, A., et al. [39] Preparation of modified tubulins. Methods in Enzymology. 196, 478-485 (1991).
  17. Tracking Single Particles and Elongated Filaments with Nanometer Precision. Biophysical Journal. 100 (11), 2820-2828 (2011).">Ruhnow, F., Zwicker, D., Diez, S. Tracking Single Particles and Elongated Filaments with Nanometer Precision. Biophysical Journal. 100 (11), 2820-2828 (2011).
  18. Optical tweezers with millikelvin precision of temperature-controlled objectives and base-pair resolution. Optics Express. 17 (19), 17190-17199 (2009).">Mahamdeh, M., Schäffer, E. Optical tweezers with millikelvin precision of temperature-controlled objectives and base-pair resolution. Optics Express. 17 (19), 17190-17199 (2009).
  19. Stabilizing method for reflection interference contrast microscopy. Applied Optics. 47 (12), 2070-2075 (2008).">Kim, K., Saleh, O. A. Stabilizing method for reflection interference contrast microscopy. Applied Optics. 47 (12), 2070-2075 (2008).
  20. Interferometric scattering microscopy and its combination with single-molecule fluorescence imaging. Nature Protocols. 11 (4), 617-633 (2016).">Ortega Arroyo, J., Cole, D., Kukura, P. Interferometric scattering microscopy and its combination with single-molecule fluorescence imaging. Nature Protocols. 11 (4), 617-633 (2016).
  21. Stabilization of an optical microscope to 0.1 nm in three dimensions. Appl Opt. 46 (3), 421-427 (2007).">Carter, A. R., King, G. M., Ulrich, T. A., Halsey, W., Alchenberger, D., Perkins, T. T. Stabilization of an optical microscope to 0.1 nm in three dimensions. Appl Opt. 46 (3), 421-427 (2007).
  22. Quantitative Reflection Interference Contrast Microscopy (RICM) in Soft Matter and Cell Adhesion. ChemPhysChem. 10 (16), 2752-2768 (2009).">Limozin, L., Sengupta, K. Quantitative Reflection Interference Contrast Microscopy (RICM) in Soft Matter and Cell Adhesion. ChemPhysChem. 10 (16), 2752-2768 (2009).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Interference Reflection MicroscopyLabel free ImagingMicrotubule DynamicsHigh speed ImagingFluorescence Microscope ModificationAperture Diaphragm AlignmentSignal to noise RatioBackground SubtractionTime lapse AcquisitionKinograph Analysis

Related Articles