ויזואליזציה של חלבון קינאז פעילות בראש-קבוע עכברים התנהגות באמצעות Vivo Two-פוטון מיקרוסקופ החיים הדמיה מיקרונטית

הנגיף העצבי, הידוע גם כשידור הסינפטית איטי, מטיל שליטה חזקה על תפקוד המוח במהלך מצבים התנהגותיים שונים, כגון לחץ, עוררות, תשומת לב, ו תנועה^{1,2,3, 4}. למרות חשיבותו, המחקר של מתי והיכן מתרחשים אירועים נוירומודולטוריים הוא עדיין בחיתוליו. נוירואומודולטורים, כולל אצטילכולין, דופמין, נוראדרנלין, סרוטונין, ונוירופפטידים רבים, להפעיל את G חלבון מצמידים קולטנים (GPCRs), אשר בתורו ההדק תאיים מסלולים השני עם חלון רחב של צירי זמן ועד משניות לשעות. בעוד כל מטפל עצבי מפעיל קבוצה ברורה של אירועים איתות, המחנה/חלבון קינאז a (pka) מסלול הוא מסלול מצוי במורד הזרם עבור הרבה נוירומודולטורים^1,5. מסלול המחנה/pka מווסת את היכולות הנוירואליות, העברת הסינפטית והפלסטיות^6,7,8,9, ולכן, מנגינות את הדינמיקה של רשת עצבית. מכיוון נוירונים שונים או סוגים עצביים לבטא סוגים שונים או רמות של קולטני עצבי מחדש¹⁰, את ההשפעות התאיים של אותו מיאואואואואואואואואואואואואואואוטור זהה עשוי להיות הטרוגנית על פני נוירונים שונים, ולכן, צריך להיות למדה ברזולוציה תאית. עד היום, הוא נשאר מאתגר לפקח על אירועים נוירומודולאליים בנוירונים בודדים בvivo במהלך ההתנהגות.

כדי ללמוד את הדינמיקה הטמפורלית של הנוירומודולציה, נדרש מודאליות של הקלטה מתאימה. מיקרודיאליזה ומחזורי סריקה מחזורית משמשים לעתים קרובות כדי ללמוד שחרור של נוירומודולטורים, אבל הם חסרים את הרזולוציה המרחבית לפקח על אירועים סלולריים^11,12. מקבילה לדינמיקה של סידן בשימוש כפרוקסי לפעילות החשמלית העצבית בדימות האוכלוסייה¹³, הדמיה pka עשוי לשמש כדי לקרוא את האירועים הנוירומודולדיטוריים ברחבי האוכלוסייה העצבית ברזולוציה התאית. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השימוש בכתבת הפעילות המשופרת של א-קינאז (AKAR) כדי לפקח על פעילויות ה-PKA בvivo במהלך התנהגות בעלי חיים. השיטה המתוארת כאן מאפשרת הדמיה בו של אוכלוסיות נירואליות ברזולוציה תת-תאית עם רזולוציה טמפורלית שעוקבת אחר אירועים נוירומודולטוריים פיזיולוגיים.

Akars מורכב מתורם ו לקבלה חלבונים פלואורסצנטי המקושרים על ידי pka זירחון המצע פפטיד ו forkhead הקשורים (fha) התחום הנקשר סרין זרחנת או טראונין של המצע^14,15. עם הפעלת מסלול PKA, פפטיד המצע של AKAR הוא זרחי. כתוצאה מכך, התחום FHA נקשר את פפטיד המצע זרחני, ובכך להביא את שני fluorophores לסמיכות, המכונה מצב סגור של AKAR. המצב הסגור של AKAR זרחט מגדיל את העברת האנרגיה של התהודה המוגברת (למעלה) בין התורם לבין הקבלה. מאז שיעור של akars זרחמיים קשורה לרמה של פעילות pka¹⁶, את כמות הסריג במדגם ביולוגי ניתן להשתמש כדי לכמת את הרמה של פעילות pka^{16,17,18, 19,20}.

גרסאות מוקדמות של AKARs תוכננו בעיקר עבור שני צבע הדמיה טימטרי¹⁴. כאשר הדמיה עמוקה יותר לרקמת המוח, השיטה הטיברמטרית סובלת מעיוות האותות בשל פיזור אור באורך הגל^17,18,21. כפי שמתואר להלן, מיקרוסקופ הדמיה של תקופת החיים הפלואורסצנטית (flim) מבטלת את הבעיה כי flim רק מודד פוטונים הנפלטים על ידי fluorophore התורם^18,21. כתוצאה מכך, הקוונפיקציה של הפלימטר של הסריג אינה מושפעת מעומק הרקמה¹⁷. בנוסף, "כהה" (כלומר, תשואה קוונטית נמוכה [QY]) המשתנה של הקבלה fluorophore ניתן להשתמש. פעולה זו משחררת ערוץ צבע כדי להקל על מדידת מדידה של תכונות נוירואליות אורתוגונאליות באמצעות הדמיה בו של חיישן שני או מסמן מורפולוגי^17,19,20.

הדמיה FLIM לכמת את הזמן כי fluorophore מבלה במצב נרגש, כלומר, החיים הפלואורסצנטית¹⁸. שובו של פלואור למדינת הקרקע, ולכן סופו של המדינה הנרגשת, לעתים קרובות מקשר עם פליטת פוטון. למרות פליטת פוטון עבור מולקולה נרגש בודדים הוא סטוכסטי, באוכלוסייה החיים מרושע הזריחה הוא מאפיין של fluorophore מסוים. כאשר אוכלוסייה טהורה של fluorophores מתרגש בו זמנית, הזריחה המתקבלת יהיה לאחר ריקבון מעריכי אחד. קבוע הזמן של ריקבון מעריכי זה מתאים לאורך חיים הזריחה הממוצע, אשר בדרך כלל נע בין אחד לארבע ננושניות עבור חלבונים פלואורסצנטי. שובו של התורם הנלהב fluorophore למדינה הקרקע יכול להתרחש גם על ידי לדאוג. בנוכחות של לדאוג, החיים הפלואורסצנטית של התורם fluorophore מופחת. האקארים הבלתי זרחנים מציגים. אורך חיים של התורמים הארוכים יותר עם זרחון על ידי PKA, החיישן מציג חיים קצרים יותר כי התורם ואת הקבלה fluorophores הובאו זה לזה, והוא מוגבר. הקוונפיקציה של החיים הפלואורסצנטית באוכלוסייה של AKARs ולכן מייצגת את רמת פעילות PKA.

גירסאות מוקדמות של AKARs לא השתמשו בהצלחה עבור הדמיה vivo ברזולוציה תא יחיד. זה נובע בעיקר משרעת האות נמוך של חיישני AKAR להפעלות פיזיולוגיות¹⁷. לאחרונה, על ידי השוואת באופן שיטתי חיישני AKAR זמינים עבור שני פוטון הדמיה מיקרוסקופ גלגול החיים (2pFLIM), חיישן שנקרא FLIM-AKAR נמצא כדי להערים על חיישנים חלופיים. יתר על כן, סדרה של משתני flim-akar שנקרא akar ממוקד (takars) פותחו כדי להמחיש פעילות pka במיקומים משניים ספציפיים: microtubules (takarα), ציטוסול (tAKARβ), אקטין (tAKARδ), filamentous אקטין (tAKARε), קרום (tAKARγ), וצפיפות פוסט-סינפטית (tAKARζ). בין טאטרים, takarα הגדילה את משרעת האות הרוויח על ידי נוראדרנלין על ידי 2.7-קיפול. זה מתאים עם הידע כי רוב pka בנוירונים מעוגנת microtubules במצב מנוחה^22,23. tAKARα היה האמן הטוב ביותר בין AKARs קיימים עבור 2pFLIM. יתר על כן, tAKARα זיהה פעילות מבחינה פיזיולוגית הרלוונטית PKA הרוויח על ידי נוירומודולטורים מרובים, ואת הביטוי של tAKARα לא לשנות פונקציות נוירואליות¹⁷.

לאחרונה, tAKARα השתמשו בהצלחה כדי להמחיש את הפעילויות PKA בראש קבוע עכברים התנהגות¹⁷. זה הוכח כי נאכף תנועה המופעל הפעילות pka בסומה של נוירונים בשכבה שטחית (שכבה 1 עד 3, עד עומק של ~ 300 יקרומטר מ pia) ב מנוע, חבית, ויזואלית מערבולות. פעילות PKA תנועה המופעל היה חלק תלוי על איתות באמצעות קולטנים β-אדרררגיות ו קולטני דופמין D1, אבל לא הושפע על ידי היריב D2 הקולטן הדופמין. עבודה זו ממחישה את היכולת של tAKARs לעקוב אחר אירועים נוירומודולליות בvivo באמצעות 2pFLIM.

בפרוטוקול הנוכחי, השיטה כולה לדימות פעילות PKA בעכברים הערים קבועים בראש במהלך פרדיגמה תנועה נאכף מתואר בשישה שלבים. ראשית, תוספת של יכולות 2pFLIM למיקרוסקופ רגיל 2-פוטון (איור 1). שנית, בניית הליכון ממונע (איור 2). שלישית, הביטוי של חיישן tAKARα בקליפת העכבר על ידי אלקטרופורציה של הרחם (IUE) של ה-DNA, או הזרקת סטריאוטקאית של וירוס הקשורים adeno (AAV). פרוטוקולים מצוינים עבור ניתוחים של iue^24,25 והזרקת סטריאוטקאית של חלקיקים ויראלי²⁶ פורסמו בעבר. הפרמטרים המרכזיים שבהם השתמשנו מתוארים להלן. . קדימה, התקנת חלון גולגולת פרוטוקולים מצוינים פורסמו בעבר עבור ניתוח חלון הגולגולת^27,28. מתוארים מספר שלבים ששונו מהפרוטוקולים הסטנדרטיים. . חמישית, מופיעה בvivo 2pFLIM שישית, הניתוח של התמונות 2pFLIM (איור 3 ואיור 4). גישה זו צריכה להיות ישימה בקלות רבים אחרים בראש קבוע התנהגות ושטחים המוח.

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של אורגון בריאות ומדע אוניברסיטת.

1.2Flim התקנת מיקרוסקופ

1. התקן מודול ספירת הפוטון (לפטין, טבלת החומרים) והתחבר למחשב (איור 1) לפי המדריך של היצרן.
   הערה: בדרך כלל, מדובר בלוח מחשבים המקבל קלט "מסונכרן" עבור התזמון של דופק הלייזר וכניסת פוטון מהצינור הפוטופולפי (PMT). זה גם מקבל תזמון השעון עבור פיקסלים, קווים, ומסגרות, מתוך שני פוטון בקרת הדמיה תוכנה. ה-פטין משתמש באותות השעון כדי להפריד פוטונים בודדים לפיקסלים ומסגרות שונים.
2. הוסף פוטודיודה עם רוחב פס של > 200 מגה-הרץ כדי למדוד את תזמון הלייזר. מניחים שמיכות זכוכית סטנדרטי בנתיב האור כדי לשקף חלק קטן של אור הלייזר לתוך פוטודיודה ממוקם בניצב לנתיב האור (איור 1). חבר את פלט ה-פוטודיודה לקלט "סנכרון" של ה-"מסונכרן".
   הערה: לייזרים מודרניים רבים גם פלט את העיתוי לייזר. עבור לייזרים אלה, פוטודיודה אינה הכרחית, וניתן לחבר ישירות את פלט הזמן לייזר לקלט המסונכרן של ה-פטין.
3. להחליף את PMT, במקרה של tAKARα, את הערוץ הירוק PMT, עם רעש נמוך, מהיר GaAsP PMT (איור 1). חבר את פלט ה-PMT לקלט האות של ה-פטין.
   1. הוסף מפצל אותות אופציונלי (איור 1) אם יש צורך ברכישה בו של עוצמה באמצעות ערוץ ההדמיה הרגיל של שני הפוטונים. חבר את פלט ה-PMT למפצל האותות וחבר את פלט המפצל למודול הדמיה של שני הפוטונים.
      הערה: GaAsP PMTs לתת מהיר יותר אותות פוטון בודד מאשר PMTs קונבנציונאלי ולאפשר קביעה מדויקת יותר של העיתוי פוטון. מודלים מסוימים של GaAsP PMTs יכול להיות מקורר 10-35 ° c מתחת לטמפרטורת הסביבה, המאפשר דיכוי של ספירות כהה לרמה מתחת כמה מאות לשנייה (בדרך כלל ≤ 200 ספירות/s). זו רמת רעש נמוכה חשוב למדידה מדויקת של תקופות חיים של הזריחה, משום רעש הפוטון לא יכול להיות מכובד בקלות או מופחתים מתוך עקומת החיים של הזריחה.
4. הוסף מסנן פליטת הקרינה הפלואורסצנטית המקזער את הזיהום הספקטרלי, אם בכלל, מתוך האישור fluorophore. לדוגמה, עבור takarα, 500 nm ± 20 מסנן המכשול nm עבור הערוץ הירוק משמש כדי להפחית את הזיהום מן הקבלה להגיע, אשר כהה (QY ~ 0.07) חלבון פלורסנט צהוב (yfp)^29,30. חבר אותות תזמון, כגון השעונים לפיקסלים בודדים בתמונה, לקווים ולמסגרות, בהתאם לתוכנת הבקרה ומתואר במדריך למשתמש של משתמשים בעלי משתמש. התקן את התוכנה המתאימה לבקרת נתונים ורכישה.
   הערה: חלק מיצרני ה-"פטין" (טבלת חומרים) מספקים את התוכנה שלהם לדימות של 2pFLIM. כאן משתמשים בתוכנה מותאמת אישית שנקראת פלימיקוסמת, שפותחה על ידי מעבדת יאסרודה (מקס פלאנק פלורידה, באמצעות תקשורת אישית). תוכנה זו פועלת כפונקציה משתמש הרחבה לתוכנת רכישה מסוימת של שני פוטונים (טבלת חומרים). הוא שולט ומתקשר עם ה-לפטין בעיתוי המתאים במהלך הדמיה של שני הפוטונים לרכישת תמונות 2pFLIM.

2. בניית הליכון ממונע

הערה: העיצוב של הליכון ממונע בנוי אישית מוצג באיור 2.

1. חותכים רולר קצף (Ø = 200 מ"מ) כדי 150 מ"מ באורך עם המסור מסור משובח. לחילופין, להדביק את שני החצאים של כדור קצף יחד למקם את הקלטת על התפר. באופן אופציונלי, להדביק מחצלת גומי עם פרופיל על הרולר כדי להגדיל את המתיחה על הרולר.
2. מקדחה 1/4 חור בקוטר אינץ ' במרכז הגלגלת על הצד השטוח של רולר או מקדחה 1/4 חור קוטר אינץ ' באמצע כל חצי של הכדור אם הכדור קצף משמש.
3. התקן 1/4 הציר פלדה קוטר אינץ דרך החור. הדבק את רולר קצף/הכדור אל הציר באמצעות קצף תואם דבק. באופן אופציונלי, לשנות שני מצמדים פיר גמיש (1/4 בקוטר הפנימי אינץ) כדי לחזק את הצימוד של הציר את הגלגלת קצף/כדור.
   הערה: שים לב כי דבקים נפוצים רבים עשויים להמיס קצף.
   1. עבור כל צימוד פיר, מקם את צימוד הפיר בצד השטוח ובמרכז לוחית המתכת של המלבן (0.7 מ"מ x 15 מ"מ x 76 מ"מ). . לרתך את הצלחת לצימוד הפיר מקדחה 1/4 חור אינץ במרכז הלוח כדי לאפשר התקנה של צימוד פיר שונה על הציר ושני חורים בורג לתוך לוחית המתכת לרוחב מהמרכז.
   2. התקן את הצימוד פיר על הציר על הגלגלת קצף/כדור. אם השימוש האחרון, לכופף מעט את הצלחת כדי להתאים את העקמומיות של הכדור. מקום ברגים לתוך החורים לרוחב כדי לתקן את הרולר/הכדור על הציר.
4. לקדוח ולהקיש על חוט 3/8-32 במרכז צלחת הכלוב ולהתקין את מקודד רוטרי. מקדחה חור בורג לתוך הבסיס של המנוע הימני זווית מנוע כדי לאפשר החזקה של המנוע על מחזיק ההודעה. חברו את מקודד הרוטרי ואת המנוע לסוף הציר באמצעות צימוד פיר גמיש.
5. התקן את ההליכון התאספו על לוח לחם אלומיניום באמצעות הצבות עבור מקודד ורוטרי מנוע (איור 2). חבר את כניסות המנוע לבקר מהירות, ואת הפלט מקודד רוטרי לקלט אנלוגי של רכישת נתוני המחשב (DAQ) הלוח.
   הערה: מהירות הסיבוב זוויתי מקודד על ידי מקודד רוטרי כמו מתח והוא סרוקים באמצעות תוכנה מותאמת אישית בשם AnimalTracker כתוב MATLAB.
6. התקן את המחזיק בלוח הקדמי התואם לסוגר זווית ימין. התקן הצבה מוצק על צלחת הלחם מול ההליכון ולהתקין את מחזיק לוחית הראש התאספו עם מסגרת זווית ימין על ההודעה (איור 2). ודא כי הסורגים מחזיק לוחית הראש מיושרים עם הציר כך העכבר יכול לאמץ מיקום הליכה נאותה ונוח על ההליכון (איור 2C).

3. ביטוי חיישן tAKARα בקליפת העכבר

1. באלקטרופורציה של הרחם
   1. הכנת פתרון ה-DNA עבור IUE על-ידי הוספת 0.2% הריכוז הסופי של צבע ירוק מהיר (עבור ויזואליזציה במהלך ההזרקה) ל-DNA פלמיד (3 על 4 μg/μL; המבנים חיישן המכיל מקדם הקאג, רצף חיישן, וירוס הפטיטיס מרמיטה לאחר ההמרה אלמנט התגובה [WPRE] משפר) מומס/מדולל במים או טריס-EDTA.
   2. להכין עכבר מתוזמן בהריון נקבה (למשל, C57BL/6) עבור IUE ב E16²⁴. לשפל את העכבר עם isofלוריאן (4% עבור אינדוקציה ו 1.5% עבור תחזוקה, ב 95% O2 עם 5% CO₂) ולהחיל הזרקה תת עורית של כאבים פרי-פעיל המכיל 5 מ"ג/ק"ג מלוקסיעם ו 4 מ"ג/ק"ג בופיטין. לחתוך לפתוח את חלל הבטן עם אזמל וזוג מספריים בזהירות לחשוף את קרני הרחם.
   3. הכנס 1 μL של פתרון ה-DNA לעובר בחדר הצדדי של חצי הכדור השני, כפי שמתואר בעבר²⁴.
   4. לבצע IUE רגיל²⁴ עבור נוירונים בקליפת המוח על ידי הצבת את כף הרגל החיובית לסיים בקליפת ושימוש 5 100-ms פולסים רבועים (38 V) ב 1 הרץ עם אלקטרופוראטור.
      הערה: אזורים קורטיקליים שונים יכולים להיות מיועדים לאלקטרופורציה על ידי שינוי מיקום כף הרגל של האלקטרודה ביחס לחדר הצדדי.
2. הזרקת סטריאוטקאית
   1. הכינו עכבר ביום שלאחר הלידה 30 לניתוח סטריאוטקאית²⁶. מורדם את העכבר כמתואר בשלב 3.1.2., ולהחיל הזרקה תת עורית של משככי כאבים פרי-פעיל המכיל 5 מ"ג/ק"ג Carprofen.
   2. לדלל aav מגרסה 2/1 (AAV2/1) ביטוי hsyn-takarα-wpre כדי סיכוייו נחוש מדעית (~ 1 x 10⁹-1 x 10¹⁰ genomes/μl) ב מזרק-מסוננים (0.2 יקרומטר ממברנה אצטט תאית) פוספט מאגור תמיסת מלח.
   3. מקדחה חור בקוטר ~ 500 יקרומטר באמצעות מקדחה כף יד תחת stereomicroscope בנקודות הציון הבאות עבור קליפת המנוע: 0.5 מ"מ קדמית לברגמה, 1.2 מ"מ לרוחב לקו האמצע.
   4. הר מזרק (למשל, שמן הידראולי מניפולטור, עם מחזיק מותאם אישית בבוכנה/זכוכית מאחז) כדי מניפולטור ממונע. הניחו את מחט ההזרקה בזווית של 15 ° ביחס למישור הברגמה-למדא. תוכנית תנועה אלכסונית על פני x ו z-צירים שווה ערך 700 יקרומטר ו 200 יקרומטר התקדמות לאורך הצירים האחורי הקדמי והגעיים, בהתאמה.
      הערה: כדי למנוע נזק הרקמה ישירות מעל שדה הדמיה מיועד, חלקיקי AAV מוזרק בזווית יחסית למישור bregma-למדא.
   5. הצב את קצהו של מחט ההזרקה בתוך הפיה במרכז חור המקדחה והפעל באיטיות את התנועה האלכסונית (~ 25 μm/s) המתוארים לעיל. הליך זה יהיה למקם את מרכז ההזרקה ב 1.2 מ"מ הקדמי לברגמה, 1.2 מ"מ לרוחב לקו האמצע, 0.2 מ"מ מתחת לפיה.
   6. הכנס 20 nL של חלקיקים ויראליים מדולל (~ 10 nL/מזערי). לחכות לפחות 10 דקות ובאיטיות למשוך את המחט ההזרקה (~ 12.5 μm/s).
   7. לסיים את הליך ההזרקה סטריאוטקאית ודבק/תפר את העור²⁶.

4. התקנת חלון הגולגולת

1. בצע את המיקום של חלון הגולגולת על עכברים ביטוי tAKARα דרך IUE (סעיף 3.1) או סטריאוטקאית הזרקה של חלקיקים ויראליים (סעיף 3.2), בין לאחר הלידה ימים 30 ו 60. עבור העכבר נגוע חלקיקים ויראלי, ליישם את חלון הגולגולת לפחות שבועיים לאחר הזרקת וירוס. התקן את חלון הגולגולת כפי שמתואר בעבר^27,28, עם הפרטים הבאים. להסית את העכבר כפי שמתואר בשלב 3.1.2., ולהחיל הזרקה תת עורית של משככי כאבים פרי-פעיל 0.075 mg/ק"ג בופריקס ואנטי דלקתית הסוכן Dexamethone ב 4 מ"ג/ק"ג.
2. הסירו את הקרום. ומשכי את שריר הצוואר הדבק את קצה העור לגולגולת עם דבק רקמה כדי למנוע חשיפה של שרירי הצוואר לאחר הניתוח.
3. להתייבש ולהסיר כל קרום מהגולגולת על ידי גירוד בעדינות באמצעות אזמל. הנח את לוחית ההדמיה (קוטר פנימי של 8 מ"מ) כדי להקיף את שדה ההדמיה המיועד. הדבק את צלחת הראש לגולגולת באמצעות דבק ציאנואקרילט מבוסס, ואחריו מלט אקריליק שיניים. לצורך הדבקה אופטימלית, ודא שלוחית העליונה נשענת על הגולגולת החשופה והיבשה. מאיץ דבק ניתן להשתמש כדי להאיץ את התקשות.
4. לצייר מעגל של 5 מ"מ קוטר מעל שדה הדמיה מיועד (קואורדינטות כפי שצוין בשלב 3.2.3) באמצעות מקדחה שיניים לחשוף את מאטר דורא.
5. החלת שכבה דקה של פולימר שקוף, הנקראת גם דורא מלאכותית, למשטח הדורא כדי לכסות את כל חלון הגולגולת. הפולימר יגן ויייצב. את מאטר הדורא מניחים שמיכות מעגלית סטרילי (בקוטר 5 מ"מ) על מאטר דורא. לאבטח את הכיסויים עם דבק ציאנואקרילט מוחל סביב קצות החלון ואחריו מלט אקריליק שיניים.

5. ב Vivo Two-פוטון הדמיה מיקרוסקופ חיים מיקרונטית

1. התחל הדמיה 2pFLIM ב או מעבר 2 שבועות לאחר ההתקנה של חלון הגולגולת (סעיף 4). מזער הפרעות נסיוניות עקב הלחץ על ידי טיפול תכוף והתערגת של העכבר לפני תחילת מחקר ההדמיה כדי לhabituate את העכבר.
2. קבע את אורך הגל לייזר שני-פוטון ל960 ננומטר באמצעות התוכנה השולטת על לייזר שני פוטון.
3. הרדים את העכבר באמצעות 4% isofלאנה. לאשר ההרדמה הנכונה על ידי הזנב צביטה והתבוננות שיעורי נשימה. כלומר, לא צריכה להיות תגובה לצביטה הזנב ואת קצב הנשימה יש להפחית ~ 1 נשימה לשנייה. כדי למזער את הזמן הפרוצדורלי המיותר ומכיוון שההרדמה נמשכת רק למשך 2-3 דקות, לא נעשה שימוש בחומרי סיכה לעיניים.
4. העבר את העכבר רדימים אל ההליכון ממונע (איור 2C) ו הר את לוחית הראש של העכבר על מחזיק לוחית הראש של ההתקנה הליכון (ראה איור 2 לפרטים). לנקות את פני השטח של שמיכות חלון הגולגולת על העכבר עם 70% אתנול.
5. מניחים את ההליכון ממונע עם העכבר רכוב תחת המטרה 2pFLIM. למרוח טיפה של מים מזוקקים בין המסווה של חלון הגולגולת ואת המטרה.
6. תן את העכבר רכוב להתעורר מתוך הרדמה ולהיות הסתגלות הליכון וסביבה מיקרוסקופ עבור לפחות 10 דקות לעקוב אחר קצב הנשימה של העכבר בעוד העכבר רכוב מתעורר מן ההרדמה.
7. נווטו למיקום ההזרקה תחת התאורה-אפינפרין. מסמך fiducial תכונות (כלומר, כלי דם) תחת ברייטפילד לסייע הדמיה של אותו אזור של ריבית (ROI) במהלך הפעלות הדמיה עוקבות.
8. לסלק את האור הנכנס שאינו האור הנפלט מרקמת המוח. כבה את מקור האור של האפינפרין וסגור את המארז של המתקן 2pFLIM. הפעל את ה-2pFLIM PMT על-ידי החלפת בקרת מתח החומרה.
9. לרכוש תמונה של מחסנית z 2pFLIM באמצעות תוכנת הרכישה 2pFLIM באמצעות ההגדרות המומלצות הבאות עבור הדמיה tAKARα-חיובי somata בעכברים ערים. הגדר את המסגרת בממוצע ל-3 מסגרות, מהירות סריקה ל-2 אלפיות שתיים, גודל תמונה ל-128 x 128 פיקסלים ושדה תצוגה ל-90-100 μm. כוונן את הגדרות הדימות בהתבסס על תצורת ההכנה והחומרה.
10. בדוק את התמונה הנרכשת ב-FLIMview (תוכנה מותאמת אישית שפותחה בתוך הבית; ראה סעיף 6). כוונן את הגדרות הדימות לאחר שלב 5.9 כדי למטב את ספירת הפוטון ולמזער את הלבנת התמונות.
    הערה: הפוטונים משולבים הפוטון לספור ב-ROI עבור הדמיה לכל החיים של הvivo tAKARα-חיובית ב-a ~ 1000-10000 בפוטונים בהתאם משרעת האות הנובעת גירוי מסוים (ראה דיון).
    1. במידת הצורך, השתמש בשדה מופחת של תצוגה, ירידה במהירות הסריקה, כוח לייזר מוגבר, ומספר גדל של מסגרות להיות ממוצעים כדי להגדיל את ספירות פוטון משולב ולהפחית את שגיאת שערוך במשך החיים. באותו זמן, הקפד להשתמש בכוח לייזר חיוני מינימלי, מסגרת בממוצע, וסריקה מהירות כדי למזער את הלבנת התמונות.
11. תמונה בפרק זמן קבוע (לדוגמה, כל 30-60 שישים) על-ידי חזרה על רכישת מחסנית z באמצעות הגדרות שנקבעו בשלב 5.10. לרכוש תמונות 2pFLIM בסיסית עבור לפחות 15 דקות במהירות אפס הליכון.
12. הגדר את מהירות סיבוב ההליכון ~ 15 ס"מ/s עבור 15 דקות תוך רכישת תמונות 2pFLIM. המשך הדמיה עבור ≥ 20 דקות לאחר החלפת סיבוב הליכון, כדי להעריך את משך הפעילות PKA לאחר הפסקת התנועה כפויה.

6. ניתוח תמונות של 2pFLIM

1. פתח את התמונות שנרכשו ב-FLIMview והגדר את הפרמטרים הבאים ב-FLIMview.
   הערה: פרטי הפרמטרים מתוארים בדיון.
   1. לחץ על ספירת פוטון בודד (SPC) שדות טווח מינימלי ומקסימלי ב FLIMview. הזינו ערך מינימלי ומקסימלי של טווח ה-SPC, בדרך כלל בין 1.2-2 ל-10-12 ₪ בהתאמה.
   2. לחץ על שדה t₀ Value ב FLIMview והזן את ערך ה-t₀ (בדרך כלל ~ 2 ns). לחץ על שדות החיים של הסף המינימלי לזוהר השדה ב FLIMview ולהזין את הערך הסף הרצוי 5-30 שבפוטונים.
2. לחץ על לחצן הקבוצה החדשה (N) והקצה שם קבוצת ניסוי. פעולה זו תיצור קבוצה המשלבת נתונים מכל תמונת FLIM שנוספה.
3. לחץ על לחצן roi ב שולטת roi מודול של FLIMVIEW ולצייר ROI סביב הסומה takarα-חיובית. הפחת את טווח מחסנית z, על-ידי הזזת המגבלה הנמוכה והעליונה של z במחווני הבקרה של מחסנית z ב- FLIMview, כדי למזער את זיהום האותות שמקורם בפוטונים ברקע בעומקים אחרים של z.
4. לחץ על כפתור + כדי להוסיף את תמונת flim לקבוצה (שלב 6.2). לחץ על לחצן חישוב כדי לחשב את אורך החיים ממוצע (LT, המכונה גם ממוצע פליטת פוטון זמן [המפט]), עבור ROI ואת שגיאת שערוך במשך החיים (δτ).
5. פתח את הקובץ הבא בסדרת ההדמיה 2pFLIM הכרותית. חזור על שלב 6.4. הקפד להתאים את המיקום של ההחזר ROI ו-z טווח למדוד את אותו tAKARα חיובי-חיובית לאורך זמן, כי יכול להיות הרקמה להיסחף לאורך זמן.
6. בחר את האפשרות Deltampet / מחלק 0 בתפריט הנפתח של הקבוצה שולטת במודול. לחץ על השדה בסיסית והזן את האינדקס (es) (לדוגמה, 1 2 3 4 5 עבור חמשת התמונות הראשונות בקבוצה שנוצרה בשלב 6.3). פעולה זו תגדיר את התמונות המשמשות לחישוב אורך חיים בסיסי (LT₀).
7. לחץ על העלילה כדי ליצור גרף המכיל את תגובת flim (ΔLT/LT₀) של takarα במהלך הניסוי ב-rois המוגדר. שינויים מנורמאליים בחיים (ΔLT) של ROIs בודדים על-ידי תקופת החיים הבסיסית המתאימה (LT₀) מאפשרים השוואה של פעילות pka במהלך תנועה על פני rois שונים.

החיישנים מאפשרים הדמיה של מסלולים רבים ושונים של אותות, כולל מסלול המחנה/PKA המעורב במניפולציה עצבית. הפרוטוקול הנוכחי מנצל את חיישן tAKARα שפותחה לאחרונה בשילוב עם 2pFLIM כדי להמחיש את פעילויות PKA לתוך הראש קבוע עכברים התנהגות. ניתן לשדרג את רוב שני הפוטונים הקיימים באמצעות יכולות 2pFLIM באמצעות הוספת שלושה לארבעה רכיבים, כפי שמודגם באיור 1 (ראו גם סעיף 1). כדי להמחיש את התמונה בתמונות שנרכשו ב-2pFLIM, כימות החיים המשמעות בוצעו על חלקות היסטוגרמה של תזמון פוטון שנאסף לכל פיקסל (איור 3 א, ב). משמעות החיים היתה דמיינו באמצעות תמונה בצבע מדומה, שבו גבוה (צבע קר) נמוך (צבע חם) מתכוון תקופות חיים נמוכות וגבוהות PKA, בהתאמה, מאז הפעלת PKA מוביל לירידה של החיים. יש לנקוט טיפול כדי לקבוע את טווח ה-SPC כראוי; טווח זה צריך להיות מוגדר בתוך מרווח לייזר הדופק (למשל, 12.5 ns של קצב הדופק של 80 MHz) עם ממצאים בקצה חומרה ממוזער (ראה גם סעיף 6 ו דיון). חישוב של פעילות PKA בתוך ROIs בוצעה על ידי שילוב LT של כל הפיקסלים בתוך ROI נתון (איור 3C, D). בראש קבוע עכברים ערים החיים הבזליים נע בין 1.3 ו 1.8 ns (איור 3E). הדמיה של tAKARα בקליפת המנוע בראש קבוע עכברים ער מותר עבור כימות בזמן אמת של פעילות PKA עם רזולוציה תאית במהלך תנועה בסיס ונאכף (איור 4). ניתן לחזור על הניסוי בימים ובחודשים. נאכף תנועה גורמים PKA פעילות באוכלוסיה של נוירונים בתוך שכבות שטחיות של קליפת העכבר מנוע17. פעילות זו מותנית בהפעלה עצבית באמצעות הפעלת β-אדרכולינרגיות וקולטני D117.

איור 1: סכימטי של מערכת 2pFLIM. 2pflim ניתן ליישם על מיקרוסקופ שני הפוטון קונבנציונאלי על ידי תוספת של רכיבי חומרה מודגשים צהוב: תזמון הפוטון מודול ספירת, שפופרת הרעש נמוך מהיר האור (PMT), פוטודיודה (נחוץ רק אם לייזר אין איתות פלט עבור תזמון לייזר), ומפצל אותות אופציונלי. דמות זו שונתה מ-Ma et al.17. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: עיצוב של הליכון ממונע בנוי אישית. (A) סכמטי של עיצוב ההליכון מלפנים (למעלה משמאל), צד (למעלה מימין), ותצוגות העליון (למטה משמאל). ההליכון (כדור קצף) הסרן מחובר מקודד רוטרי מנוע כי הם באופן קולקטיבי רכוב על שתי הצבות על צלחת לחם אלומיניום מוצק. לוחית הראש תואמת מחזיק על סוגר זווית ימין הוא קבוע לעמוד מוצק ממוקם מעל ההליכון. רישומים סכמטית הם לא לשנות את קנה המידה. חזית (ב) ו צד (ג) נוף תצלומים של ההליכון. המיקום הנכון של העכבר על ההליכון מוצג פאנל C. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: הקוונפיקציה של נתוני 2pFLIM. (א) תמונה flim עם כל פיקסל בצבע מדומה כדי לייצג את החיים הממוצע (LT), ביחס לתזמון הלייזר, של כל הפוטונים בפיקסל זה. (ב) שעות ההגעה פוטון בתוך פיקסל אחד (ריבוע סגול בלוח a) הותוו בהיסטוגרמה (פאנל שמאלי). גבולות האינטגרציה נקבעו כדי לקבוע את טווח ספירת הפוטון היחיד (SPC, אפור). בתוך טווח SPC, האינטגרל של תזמון פוטון חולקה על ידי המספר הכולל של פוטונים ולאחר מכן מופחתים על ידי t0 (1.65 ns, קו מקווקו), וכתוצאה מכך חיים מרושע (LT, מרחק בין קווים מקווקווים ומנוקד) של 1.74 ns. כימות החיים מתכוון של השדה כולו של נוף (ריבוע כחול אור בלוח A) מעורב שילוב של עיתוי פוטון שנאסף בכל הפיקסלים (הפאנל הימני), וכתוצאה מכך חיים ממוצע של 1.7 ns. מערכות insets מציגות את אותם הנתונים בקנה מידה למחצה יומן. (C ו -D) הכמת של חיים מתכוון לכל אזור של ריבית (ROI). (ג) דוגמה ייצוגית של תמונת 2pFLIM. שני ROIs נמשכו סביב שני somata בשכבה 2/3 של קליפת המנוע. (ד) פוטון עיתוי הפצות משולבים בכל הפיקסלים בתוך כל ROI (הפאנל השמאלי). תא ROIs היו מסומנים בצבע (כפי שמוצג בלוח C) אדום, תא 1; כחול, תא 2 ספירות פוטון מנורמלות מאפשרות השוואה של הפצות העיתוי פוטון בין שני ROIs (הפאנל הימני, ממוצע החיים; תא 1, 1.33 ns; תא 2, 1.73 ns). מערכות insets מציגות את אותם הנתונים בקנה מידה למחצה יומן. (ה) התפלגות מגרש של אורך חיים בסיס ממוצע מ 254 תאים התמונה בשכבות שטחיות של קליפת המנוע. L1 תאים (n = 186 תאים/11 בעלי חיים, הפאנל השמאלי), המתגוררים בתוך 100 יקרומטר מתחת לפיה, הביע takarα אחרי הזרקה סטריאוטקאית של AAV2/1-hsyn-takarα-wpre, ו-L2/3 התאים (n = 68 תאים/4 בעלי חיים, בלוח הימני 150) הביע את האיחוד לאחר הצורך. בבניית דנ א של הקאג אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: tAKARα מסלולים נאכף תנועה המושרה פעילויות PKA בקליפת המנוע. (א) העוצמה המייצגת (פאנל שמאלי) והחיים (לוחות האמצע והימין) תמונות של שלושה תאים L1 בקליפת המנוע. התא ROIs היה מקודד בצבע: כתום, תא 1; כחול, תא 2; צהוב, תא 3 (ב) פוטון עיתוי הפצות נמדד בתא 1 (הפאנל העליון) במהלך המצב הבזלי (סימן כתום, כפי שנמדד בלוח האמצעי Α) ו תנועה נאכף (לוקו., סימן כתום קל, כפי שנמדד בלוח הימני A). מונה פוטון מנורמל מותר להשוואה ישירה של התפלגות העיתוי פוטון (פאנל תחתון, ממוצע החיים: בסיס, 1.72 ns; תנועה, 1.42 ns). מערכות insets מציגות את אותם הנתונים בקנה מידה למחצה יומן. (ג) Δlifetime/חיים0 (ΔLT/LT0) עקבות של התאים המתאימים (הפאנל העליון, ראה פאנל A) עם מהירות התנועה נאכף ( הפאנל התחתון). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

. למחברים אין מה לגלות