ויזואליזציה של חלבון קינאז פעילות בראש-קבוע עכברים התנהגות באמצעות Vivo Two-פוטון מיקרוסקופ החיים הדמיה מיקרונטית

Summary

הליך זה מוצג להמחיש החלבון קינאז פעילות בעכברים קבועים ומתנהגים. כתבת הפעילות המשופרת של א-קינאז, tAKARα, מתבטאת בנוירונים בקליפת הגולגולת והפכה לנגישה להדמיה דרך חלון גולגולתי. מיקרוסקופ הדמיה של שני פוטון באורך החיים משמש כדי להמחיש פעילויות PKA ב vivo במהלך תנועה נאכף.

Abstract

הנוירואומודולציה מפעילה שליטה. חזקה על תפקוד המוח בעיות נוירולוגיות ופסיכיאטריות. למרות החשיבות שלהם, טכנולוגיות למעקב אחר אירועים נוירומודולטוריים עם רזולוציה תאית רק מתחילים להופיע. נוירומודולטיות, כגון דופמין, נוראדרנלין, אצטילכולין, וסרוטונין, ההדק אירועים תאיים מאותת באמצעות משולב חלבון G שלהם קולטנים כדי לווסת את היכולת הנוירולית, תקשורת סינפטית, ועוד עצבי ובכך להסדיר את עיבוד המידע ברשת העצבית. הנוירומודולטורים שהוזכרו לעיל מתכנסים אל המסלול של המחנה/חלבון קינאז A (PKA). לכן, ב vivo PKA הדמיה עם רזולוציה תא יחיד פותחה כבדיקה עבור אירועים נוירומודולאליות באופן אנלוגי לדימות סידן לפעילויות חשמל עצבי. להלן, שיטה מוצגת כדי להמחיש פעילות PKA ברמה של נוירונים בודדים בקליפת הראש-קבוע עכברים מתנהגים. לשם כך, נעשה שימוש בכתב משופר מבית א-קינאז (AKAR), הקרוי tAKARα, המבוסס על העברת אנרגיית תהודה של Förster (לדאוג). זה חיישן ה-pka מקודד גנטית הוא הציג לתוך קליפת המנוע באמצעות אלקטרופורציה הרחם (iue) של DNA פלמידים, או הזרקה סטריאוטקטית של וירוס הקשורים adeno (aav). שינויי השימוש בשיטת הצילום הם הדמיה באמצעות שני פוטון מיקרוסקופ גלגול החיים (2pFLIM), אשר מציע יתרונות על פני מדידות מחדש של מדידת מדידה עבור לכמת את האות ברקמת המוח פיזור אור. כדי ללמוד פעילויות PKA במהלך תנועה נאכף, tAKARα היא התמונה באמצעות חלון הגולגולת כרונית מעל קליפת הראש של הערה, הראשי קבוע עכברים, אשר לרוץ או לנוח על מהירות מבוקרת ממונע הליכון. גישה זו הדמיה יחולו על אזורים רבים אחרים במוח כדי ללמוד התנהגות הנגרמת המושרה פעילויות PKA ועל חיישנים אחרים מבוססי FLIM מבוסס על הדמיה vivo.

Introduction

הנגיף העצבי, הידוע גם כשידור הסינפטית איטי, מטיל שליטה חזקה על תפקוד המוח במהלך מצבים התנהגותיים שונים, כגון לחץ, עוררות, תשומת לב, ו תנועה^{1,2,3, 4}. למרות חשיבותו, המחקר של מתי והיכן מתרחשים אירועים נוירומודולטוריים הוא עדיין בחיתוליו. נוירואומודולטורים, כולל אצטילכולין, דופמין, נוראדרנלין, סרוטונין, ונוירופפטידים רבים, להפעיל את G חלבון מצמידים קולטנים (GPCRs), אשר בתורו ההדק תאיים מסלולים השני עם חלון רחב של צירי זמן ועד משניות לשעות. בעוד כל מטפל עצבי מפעיל קבוצה ברורה של אירועים איתות, המחנה/חלבון קינאז a (pka) מסלול הוא מסלול מצוי במורד הזרם עבור הרבה נוירומודולטורים^1,5. מסלול המחנה/pka מווסת את היכולות הנוירואליות, העברת הסינפטית והפלסטיות^6,7,8,9, ולכן, מנגינות את הדינמיקה של רשת עצבית. מכיוון נוירונים שונים או סוגים עצביים לבטא סוגים שונים או רמות של קולטני עצבי מחדש¹⁰, את ההשפעות התאיים של אותו מיאואואואואואואואואואואואואואואוטור זהה עשוי להיות הטרוגנית על פני נוירונים שונים, ולכן, צריך להיות למדה ברזולוציה תאית. עד היום, הוא נשאר מאתגר לפקח על אירועים נוירומודולאליים בנוירונים בודדים בvivo במהלך ההתנהגות.

כדי ללמוד את הדינמיקה הטמפורלית של הנוירומודולציה, נדרש מודאליות של הקלטה מתאימה. מיקרודיאליזה ומחזורי סריקה מחזורית משמשים לעתים קרובות כדי ללמוד שחרור של נוירומודולטורים, אבל הם חסרים את הרזולוציה המרחבית לפקח על אירועים סלולריים^11,12. מקבילה לדינמיקה של סידן בשימוש כפרוקסי לפעילות החשמלית העצבית בדימות האוכלוסייה¹³, הדמיה pka עשוי לשמש כדי לקרוא את האירועים הנוירומודולדיטוריים ברחבי האוכלוסייה העצבית ברזולוציה התאית. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השימוש בכתבת הפעילות המשופרת של א-קינאז (AKAR) כדי לפקח על פעילויות ה-PKA בvivo במהלך התנהגות בעלי חיים. השיטה המתוארת כאן מאפשרת הדמיה בו של אוכלוסיות נירואליות ברזולוציה תת-תאית עם רזולוציה טמפורלית שעוקבת אחר אירועים נוירומודולטוריים פיזיולוגיים.

Akars מורכב מתורם ו לקבלה חלבונים פלואורסצנטי המקושרים על ידי pka זירחון המצע פפטיד ו forkhead הקשורים (fha) התחום הנקשר סרין זרחנת או טראונין של המצע^14,15. עם הפעלת מסלול PKA, פפטיד המצע של AKAR הוא זרחי. כתוצאה מכך, התחום FHA נקשר את פפטיד המצע זרחני, ובכך להביא את שני fluorophores לסמיכות, המכונה מצב סגור של AKAR. המצב הסגור של AKAR זרחט מגדיל את העברת האנרגיה של התהודה המוגברת (למעלה) בין התורם לבין הקבלה. מאז שיעור של akars זרחמיים קשורה לרמה של פעילות pka¹⁶, את כמות הסריג במדגם ביולוגי ניתן להשתמש כדי לכמת את הרמה של פעילות pka^{16,17,18, 19,20}.

גרסאות מוקדמות של AKARs תוכננו בעיקר עבור שני צבע הדמיה טימטרי¹⁴. כאשר הדמיה עמוקה יותר לרקמת המוח, השיטה הטיברמטרית סובלת מעיוות האותות בשל פיזור אור באורך הגל^17,18,21. כפי שמתואר להלן, מיקרוסקופ הדמיה של תקופת החיים הפלואורסצנטית (flim) מבטלת את הבעיה כי flim רק מודד פוטונים הנפלטים על ידי fluorophore התורם^18,21. כתוצאה מכך, הקוונפיקציה של הפלימטר של הסריג אינה מושפעת מעומק הרקמה¹⁷. בנוסף, "כהה" (כלומר, תשואה קוונטית נמוכה [QY]) המשתנה של הקבלה fluorophore ניתן להשתמש. פעולה זו משחררת ערוץ צבע כדי להקל על מדידת מדידה של תכונות נוירואליות אורתוגונאליות באמצעות הדמיה בו של חיישן שני או מסמן מורפולוגי^17,19,20.

הדמיה FLIM לכמת את הזמן כי fluorophore מבלה במצב נרגש, כלומר, החיים הפלואורסצנטית¹⁸. שובו של פלואור למדינת הקרקע, ולכן סופו של המדינה הנרגשת, לעתים קרובות מקשר עם פליטת פוטון. למרות פליטת פוטון עבור מולקולה נרגש בודדים הוא סטוכסטי, באוכלוסייה החיים מרושע הזריחה הוא מאפיין של fluorophore מסוים. כאשר אוכלוסייה טהורה של fluorophores מתרגש בו זמנית, הזריחה המתקבלת יהיה לאחר ריקבון מעריכי אחד. קבוע הזמן של ריקבון מעריכי זה מתאים לאורך חיים הזריחה הממוצע, אשר בדרך כלל נע בין אחד לארבע ננושניות עבור חלבונים פלואורסצנטי. שובו של התורם הנלהב fluorophore למדינה הקרקע יכול להתרחש גם על ידי לדאוג. בנוכחות של לדאוג, החיים הפלואורסצנטית של התורם fluorophore מופחת. האקארים הבלתי זרחנים מציגים. אורך חיים של התורמים הארוכים יותר עם זרחון על ידי PKA, החיישן מציג חיים קצרים יותר כי התורם ואת הקבלה fluorophores הובאו זה לזה, והוא מוגבר. הקוונפיקציה של החיים הפלואורסצנטית באוכלוסייה של AKARs ולכן מייצגת את רמת פעילות PKA.

גירסאות מוקדמות של AKARs לא השתמשו בהצלחה עבור הדמיה vivo ברזולוציה תא יחיד. זה נובע בעיקר משרעת האות נמוך של חיישני AKAR להפעלות פיזיולוגיות¹⁷. לאחרונה, על ידי השוואת באופן שיטתי חיישני AKAR זמינים עבור שני פוטון הדמיה מיקרוסקופ גלגול החיים (2pFLIM), חיישן שנקרא FLIM-AKAR נמצא כדי להערים על חיישנים חלופיים. יתר על כן, סדרה של משתני flim-akar שנקרא akar ממוקד (takars) פותחו כדי להמחיש פעילות pka במיקומים משניים ספציפיים: microtubules (takarα), ציטוסול (tAKARβ), אקטין (tAKARδ), filamentous אקטין (tAKARε), קרום (tAKARγ), וצפיפות פוסט-סינפטית (tAKARζ). בין טאטרים, takarα הגדילה את משרעת האות הרוויח על ידי נוראדרנלין על ידי 2.7-קיפול. זה מתאים עם הידע כי רוב pka בנוירונים מעוגנת microtubules במצב מנוחה^22,23. tAKARα היה האמן הטוב ביותר בין AKARs קיימים עבור 2pFLIM. יתר על כן, tAKARα זיהה פעילות מבחינה פיזיולוגית הרלוונטית PKA הרוויח על ידי נוירומודולטורים מרובים, ואת הביטוי של tAKARα לא לשנות פונקציות נוירואליות¹⁷.

לאחרונה, tAKARα השתמשו בהצלחה כדי להמחיש את הפעילויות PKA בראש קבוע עכברים התנהגות¹⁷. זה הוכח כי נאכף תנועה המופעל הפעילות pka בסומה של נוירונים בשכבה שטחית (שכבה 1 עד 3, עד עומק של ~ 300 יקרומטר מ pia) ב מנוע, חבית, ויזואלית מערבולות. פעילות PKA תנועה המופעל היה חלק תלוי על איתות באמצעות קולטנים β-אדרררגיות ו קולטני דופמין D1, אבל לא הושפע על ידי היריב D2 הקולטן הדופמין. עבודה זו ממחישה את היכולת של tAKARs לעקוב אחר אירועים נוירומודולליות בvivo באמצעות 2pFLIM.

בפרוטוקול הנוכחי, השיטה כולה לדימות פעילות PKA בעכברים הערים קבועים בראש במהלך פרדיגמה תנועה נאכף מתואר בשישה שלבים. ראשית, תוספת של יכולות 2pFLIM למיקרוסקופ רגיל 2-פוטון (איור 1). שנית, בניית הליכון ממונע (איור 2). שלישית, הביטוי של חיישן tAKARα בקליפת העכבר על ידי אלקטרופורציה של הרחם (IUE) של ה-DNA, או הזרקת סטריאוטקאית של וירוס הקשורים adeno (AAV). פרוטוקולים מצוינים עבור ניתוחים של iue^24,25 והזרקת סטריאוטקאית של חלקיקים ויראלי²⁶ פורסמו בעבר. הפרמטרים המרכזיים שבהם השתמשנו מתוארים להלן. . קדימה, התקנת חלון גולגולת פרוטוקולים מצוינים פורסמו בעבר עבור ניתוח חלון הגולגולת^27,28. מתוארים מספר שלבים ששונו מהפרוטוקולים הסטנדרטיים. . חמישית, מופיעה בvivo 2pFLIM שישית, הניתוח של התמונות 2pFLIM (איור 3 ואיור 4). גישה זו צריכה להיות ישימה בקלות רבים אחרים בראש קבוע התנהגות ושטחים המוח.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של אורגון בריאות ומדע אוניברסיטת.

1.2Flim התקנת מיקרוסקופ

1. התקן מודול ספירת הפוטון (לפטין, טבלת החומרים) והתחבר למחשב (איור 1) לפי המדריך של היצרן.
   הערה: בדרך כלל, מדובר בלוח מחשבים המקבל קלט "מסונכרן" עבור התזמון של דופק הלייזר וכניסת פוטון מהצינור הפוטופולפי (PMT). זה גם מקבל תזמון השעון עבור פיקסלים, קווים, ומסגרות, מתוך שני פוטון בקרת הדמיה תוכנה. ה-פטין משתמש באותות השעון כדי להפריד פוטונים בודדים לפיקסלים ומסגרות שונים.
2. הוסף פוטודיודה עם רוחב פס של > 200 מגה-הרץ כדי למדוד את תזמון הלייזר. מניחים שמיכות זכוכית סטנדרטי בנתיב האור כדי לשקף חלק קטן של אור הלייזר לתוך פוטודיודה ממוקם בניצב לנתיב האור (איור 1). חבר את פלט ה-פוטודיודה לקלט "סנכרון" של ה-"מסונכרן".
   הערה: לייזרים מודרניים רבים גם פלט את העיתוי לייזר. עבור לייזרים אלה, פוטודיודה אינה הכרחית, וניתן לחבר ישירות את פלט הזמן לייזר לקלט המסונכרן של ה-פטין.
3. להחליף את PMT, במקרה של tAKARα, את הערוץ הירוק PMT, עם רעש נמוך, מהיר GaAsP PMT (איור 1). חבר את פלט ה-PMT לקלט האות של ה-פטין.
   1. הוסף מפצל אותות אופציונלי (איור 1) אם יש צורך ברכישה בו של עוצמה באמצעות ערוץ ההדמיה הרגיל של שני הפוטונים. חבר את פלט ה-PMT למפצל האותות וחבר את פלט המפצל למודול הדמיה של שני הפוטונים.
      הערה: GaAsP PMTs לתת מהיר יותר אותות פוטון בודד מאשר PMTs קונבנציונאלי ולאפשר קביעה מדויקת יותר של העיתוי פוטון. מודלים מסוימים של GaAsP PMTs יכול להיות מקורר 10-35 ° c מתחת לטמפרטורת הסביבה, המאפשר דיכוי של ספירות כהה לרמה מתחת כמה מאות לשנייה (בדרך כלל ≤ 200 ספירות/s). זו רמת רעש נמוכה חשוב למדידה מדויקת של תקופות חיים של הזריחה, משום רעש הפוטון לא יכול להיות מכובד בקלות או מופחתים מתוך עקומת החיים של הזריחה.
4. הוסף מסנן פליטת הקרינה הפלואורסצנטית המקזער את הזיהום הספקטרלי, אם בכלל, מתוך האישור fluorophore. לדוגמה, עבור takarα, 500 nm ± 20 מסנן המכשול nm עבור הערוץ הירוק משמש כדי להפחית את הזיהום מן הקבלה להגיע, אשר כהה (QY ~ 0.07) חלבון פלורסנט צהוב (yfp)^29,30. חבר אותות תזמון, כגון השעונים לפיקסלים בודדים בתמונה, לקווים ולמסגרות, בהתאם לתוכנת הבקרה ומתואר במדריך למשתמש של משתמשים בעלי משתמש. התקן את התוכנה המתאימה לבקרת נתונים ורכישה.
   הערה: חלק מיצרני ה-"פטין" (טבלת חומרים) מספקים את התוכנה שלהם לדימות של 2pFLIM. כאן משתמשים בתוכנה מותאמת אישית שנקראת פלימיקוסמת, שפותחה על ידי מעבדת יאסרודה (מקס פלאנק פלורידה, באמצעות תקשורת אישית). תוכנה זו פועלת כפונקציה משתמש הרחבה לתוכנת רכישה מסוימת של שני פוטונים (טבלת חומרים). הוא שולט ומתקשר עם ה-לפטין בעיתוי המתאים במהלך הדמיה של שני הפוטונים לרכישת תמונות 2pFLIM.

2. בניית הליכון ממונע

הערה: העיצוב של הליכון ממונע בנוי אישית מוצג באיור 2.

1. חותכים רולר קצף (Ø = 200 מ"מ) כדי 150 מ"מ באורך עם המסור מסור משובח. לחילופין, להדביק את שני החצאים של כדור קצף יחד למקם את הקלטת על התפר. באופן אופציונלי, להדביק מחצלת גומי עם פרופיל על הרולר כדי להגדיל את המתיחה על הרולר.
2. מקדחה 1/4 חור בקוטר אינץ ' במרכז הגלגלת על הצד השטוח של רולר או מקדחה 1/4 חור קוטר אינץ ' באמצע כל חצי של הכדור אם הכדור קצף משמש.
3. התקן 1/4 הציר פלדה קוטר אינץ דרך החור. הדבק את רולר קצף/הכדור אל הציר באמצעות קצף תואם דבק. באופן אופציונלי, לשנות שני מצמדים פיר גמיש (1/4 בקוטר הפנימי אינץ) כדי לחזק את הצימוד של הציר את הגלגלת קצף/כדור.
   הערה: שים לב כי דבקים נפוצים רבים עשויים להמיס קצף.
   1. עבור כל צימוד פיר, מקם את צימוד הפיר בצד השטוח ובמרכז לוחית המתכת של המלבן (0.7 מ"מ x 15 מ"מ x 76 מ"מ). . לרתך את הצלחת לצימוד הפיר מקדחה 1/4 חור אינץ במרכז הלוח כדי לאפשר התקנה של צימוד פיר שונה על הציר ושני חורים בורג לתוך לוחית המתכת לרוחב מהמרכז.
   2. התקן את הצימוד פיר על הציר על הגלגלת קצף/כדור. אם השימוש האחרון, לכופף מעט את הצלחת כדי להתאים את העקמומיות של הכדור. מקום ברגים לתוך החורים לרוחב כדי לתקן את הרולר/הכדור על הציר.
4. לקדוח ולהקיש על חוט 3/8-32 במרכז צלחת הכלוב ולהתקין את מקודד רוטרי. מקדחה חור בורג לתוך הבסיס של המנוע הימני זווית מנוע כדי לאפשר החזקה של המנוע על מחזיק ההודעה. חברו את מקודד הרוטרי ואת המנוע לסוף הציר באמצעות צימוד פיר גמיש.
5. התקן את ההליכון התאספו על לוח לחם אלומיניום באמצעות הצבות עבור מקודד ורוטרי מנוע (איור 2). חבר את כניסות המנוע לבקר מהירות, ואת הפלט מקודד רוטרי לקלט אנלוגי של רכישת נתוני המחשב (DAQ) הלוח.
   הערה: מהירות הסיבוב זוויתי מקודד על ידי מקודד רוטרי כמו מתח והוא סרוקים באמצעות תוכנה מותאמת אישית בשם AnimalTracker כתוב MATLAB.
6. התקן את המחזיק בלוח הקדמי התואם לסוגר זווית ימין. התקן הצבה מוצק על צלחת הלחם מול ההליכון ולהתקין את מחזיק לוחית הראש התאספו עם מסגרת זווית ימין על ההודעה (איור 2). ודא כי הסורגים מחזיק לוחית הראש מיושרים עם הציר כך העכבר יכול לאמץ מיקום הליכה נאותה ונוח על ההליכון (איור 2C).

3. ביטוי חיישן tAKARα בקליפת העכבר

1. באלקטרופורציה של הרחם
   1. הכנת פתרון ה-DNA עבור IUE על-ידי הוספת 0.2% הריכוז הסופי של צבע ירוק מהיר (עבור ויזואליזציה במהלך ההזרקה) ל-DNA פלמיד (3 על 4 μg/μL; המבנים חיישן המכיל מקדם הקאג, רצף חיישן, וירוס הפטיטיס מרמיטה לאחר ההמרה אלמנט התגובה [WPRE] משפר) מומס/מדולל במים או טריס-EDTA.
   2. להכין עכבר מתוזמן בהריון נקבה (למשל, C57BL/6) עבור IUE ב E16²⁴. לשפל את העכבר עם isofלוריאן (4% עבור אינדוקציה ו 1.5% עבור תחזוקה, ב 95% O2 עם 5% CO₂) ולהחיל הזרקה תת עורית של כאבים פרי-פעיל המכיל 5 מ"ג/ק"ג מלוקסיעם ו 4 מ"ג/ק"ג בופיטין. לחתוך לפתוח את חלל הבטן עם אזמל וזוג מספריים בזהירות לחשוף את קרני הרחם.
   3. הכנס 1 μL של פתרון ה-DNA לעובר בחדר הצדדי של חצי הכדור השני, כפי שמתואר בעבר²⁴.
   4. לבצע IUE רגיל²⁴ עבור נוירונים בקליפת המוח על ידי הצבת את כף הרגל החיובית לסיים בקליפת ושימוש 5 100-ms פולסים רבועים (38 V) ב 1 הרץ עם אלקטרופוראטור.
      הערה: אזורים קורטיקליים שונים יכולים להיות מיועדים לאלקטרופורציה על ידי שינוי מיקום כף הרגל של האלקטרודה ביחס לחדר הצדדי.
2. הזרקת סטריאוטקאית
   1. הכינו עכבר ביום שלאחר הלידה 30 לניתוח סטריאוטקאית²⁶. מורדם את העכבר כמתואר בשלב 3.1.2., ולהחיל הזרקה תת עורית של משככי כאבים פרי-פעיל המכיל 5 מ"ג/ק"ג Carprofen.
   2. לדלל aav מגרסה 2/1 (AAV2/1) ביטוי hsyn-takarα-wpre כדי סיכוייו נחוש מדעית (~ 1 x 10⁹-1 x 10¹⁰ genomes/μl) ב מזרק-מסוננים (0.2 יקרומטר ממברנה אצטט תאית) פוספט מאגור תמיסת מלח.
   3. מקדחה חור בקוטר ~ 500 יקרומטר באמצעות מקדחה כף יד תחת stereomicroscope בנקודות הציון הבאות עבור קליפת המנוע: 0.5 מ"מ קדמית לברגמה, 1.2 מ"מ לרוחב לקו האמצע.
   4. הר מזרק (למשל, שמן הידראולי מניפולטור, עם מחזיק מותאם אישית בבוכנה/זכוכית מאחז) כדי מניפולטור ממונע. הניחו את מחט ההזרקה בזווית של 15 ° ביחס למישור הברגמה-למדא. תוכנית תנועה אלכסונית על פני x ו z-צירים שווה ערך 700 יקרומטר ו 200 יקרומטר התקדמות לאורך הצירים האחורי הקדמי והגעיים, בהתאמה.
      הערה: כדי למנוע נזק הרקמה ישירות מעל שדה הדמיה מיועד, חלקיקי AAV מוזרק בזווית יחסית למישור bregma-למדא.
   5. הצב את קצהו של מחט ההזרקה בתוך הפיה במרכז חור המקדחה והפעל באיטיות את התנועה האלכסונית (~ 25 μm/s) המתוארים לעיל. הליך זה יהיה למקם את מרכז ההזרקה ב 1.2 מ"מ הקדמי לברגמה, 1.2 מ"מ לרוחב לקו האמצע, 0.2 מ"מ מתחת לפיה.
   6. הכנס 20 nL של חלקיקים ויראליים מדולל (~ 10 nL/מזערי). לחכות לפחות 10 דקות ובאיטיות למשוך את המחט ההזרקה (~ 12.5 μm/s).
   7. לסיים את הליך ההזרקה סטריאוטקאית ודבק/תפר את העור²⁶.

4. התקנת חלון הגולגולת

1. בצע את המיקום של חלון הגולגולת על עכברים ביטוי tAKARα דרך IUE (סעיף 3.1) או סטריאוטקאית הזרקה של חלקיקים ויראליים (סעיף 3.2), בין לאחר הלידה ימים 30 ו 60. עבור העכבר נגוע חלקיקים ויראלי, ליישם את חלון הגולגולת לפחות שבועיים לאחר הזרקת וירוס. התקן את חלון הגולגולת כפי שמתואר בעבר^27,28, עם הפרטים הבאים. להסית את העכבר כפי שמתואר בשלב 3.1.2., ולהחיל הזרקה תת עורית של משככי כאבים פרי-פעיל 0.075 mg/ק"ג בופריקס ואנטי דלקתית הסוכן Dexamethone ב 4 מ"ג/ק"ג.
2. הסירו את הקרום. ומשכי את שריר הצוואר הדבק את קצה העור לגולגולת עם דבק רקמה כדי למנוע חשיפה של שרירי הצוואר לאחר הניתוח.
3. להתייבש ולהסיר כל קרום מהגולגולת על ידי גירוד בעדינות באמצעות אזמל. הנח את לוחית ההדמיה (קוטר פנימי של 8 מ"מ) כדי להקיף את שדה ההדמיה המיועד. הדבק את צלחת הראש לגולגולת באמצעות דבק ציאנואקרילט מבוסס, ואחריו מלט אקריליק שיניים. לצורך הדבקה אופטימלית, ודא שלוחית העליונה נשענת על הגולגולת החשופה והיבשה. מאיץ דבק ניתן להשתמש כדי להאיץ את התקשות.
4. לצייר מעגל של 5 מ"מ קוטר מעל שדה הדמיה מיועד (קואורדינטות כפי שצוין בשלב 3.2.3) באמצעות מקדחה שיניים לחשוף את מאטר דורא.
5. החלת שכבה דקה של פולימר שקוף, הנקראת גם דורא מלאכותית, למשטח הדורא כדי לכסות את כל חלון הגולגולת. הפולימר יגן ויייצב. את מאטר הדורא מניחים שמיכות מעגלית סטרילי (בקוטר 5 מ"מ) על מאטר דורא. לאבטח את הכיסויים עם דבק ציאנואקרילט מוחל סביב קצות החלון ואחריו מלט אקריליק שיניים.

5. ב Vivo Two-פוטון הדמיה מיקרוסקופ חיים מיקרונטית

1. התחל הדמיה 2pFLIM ב או מעבר 2 שבועות לאחר ההתקנה של חלון הגולגולת (סעיף 4). מזער הפרעות נסיוניות עקב הלחץ על ידי טיפול תכוף והתערגת של העכבר לפני תחילת מחקר ההדמיה כדי לhabituate את העכבר.
2. קבע את אורך הגל לייזר שני-פוטון ל960 ננומטר באמצעות התוכנה השולטת על לייזר שני פוטון.
3. הרדים את העכבר באמצעות 4% isofלאנה. לאשר ההרדמה הנכונה על ידי הזנב צביטה והתבוננות שיעורי נשימה. כלומר, לא צריכה להיות תגובה לצביטה הזנב ואת קצב הנשימה יש להפחית ~ 1 נשימה לשנייה. כדי למזער את הזמן הפרוצדורלי המיותר ומכיוון שההרדמה נמשכת רק למשך 2-3 דקות, לא נעשה שימוש בחומרי סיכה לעיניים.
4. העבר את העכבר רדימים אל ההליכון ממונע (איור 2C) ו הר את לוחית הראש של העכבר על מחזיק לוחית הראש של ההתקנה הליכון (ראה איור 2 לפרטים). לנקות את פני השטח של שמיכות חלון הגולגולת על העכבר עם 70% אתנול.
5. מניחים את ההליכון ממונע עם העכבר רכוב תחת המטרה 2pFLIM. למרוח טיפה של מים מזוקקים בין המסווה של חלון הגולגולת ואת המטרה.
6. תן את העכבר רכוב להתעורר מתוך הרדמה ולהיות הסתגלות הליכון וסביבה מיקרוסקופ עבור לפחות 10 דקות לעקוב אחר קצב הנשימה של העכבר בעוד העכבר רכוב מתעורר מן ההרדמה.
7. נווטו למיקום ההזרקה תחת התאורה-אפינפרין. מסמך fiducial תכונות (כלומר, כלי דם) תחת ברייטפילד לסייע הדמיה של אותו אזור של ריבית (ROI) במהלך הפעלות הדמיה עוקבות.
8. לסלק את האור הנכנס שאינו האור הנפלט מרקמת המוח. כבה את מקור האור של האפינפרין וסגור את המארז של המתקן 2pFLIM. הפעל את ה-2pFLIM PMT על-ידי החלפת בקרת מתח החומרה.
9. לרכוש תמונה של מחסנית z 2pFLIM באמצעות תוכנת הרכישה 2pFLIM באמצעות ההגדרות המומלצות הבאות עבור הדמיה tAKARα-חיובי somata בעכברים ערים. הגדר את המסגרת בממוצע ל-3 מסגרות, מהירות סריקה ל-2 אלפיות שתיים, גודל תמונה ל-128 x 128 פיקסלים ושדה תצוגה ל-90-100 μm. כוונן את הגדרות הדימות בהתבסס על תצורת ההכנה והחומרה.
10. בדוק את התמונה הנרכשת ב-FLIMview (תוכנה מותאמת אישית שפותחה בתוך הבית; ראה סעיף 6). כוונן את הגדרות הדימות לאחר שלב 5.9 כדי למטב את ספירת הפוטון ולמזער את הלבנת התמונות.
    הערה: הפוטונים משולבים הפוטון לספור ב-ROI עבור הדמיה לכל החיים של הvivo tAKARα-חיובית ב-a ~ 1000-10000 בפוטונים בהתאם משרעת האות הנובעת גירוי מסוים (ראה דיון).
    1. במידת הצורך, השתמש בשדה מופחת של תצוגה, ירידה במהירות הסריקה, כוח לייזר מוגבר, ומספר גדל של מסגרות להיות ממוצעים כדי להגדיל את ספירות פוטון משולב ולהפחית את שגיאת שערוך במשך החיים. באותו זמן, הקפד להשתמש בכוח לייזר חיוני מינימלי, מסגרת בממוצע, וסריקה מהירות כדי למזער את הלבנת התמונות.
11. תמונה בפרק זמן קבוע (לדוגמה, כל 30-60 שישים) על-ידי חזרה על רכישת מחסנית z באמצעות הגדרות שנקבעו בשלב 5.10. לרכוש תמונות 2pFLIM בסיסית עבור לפחות 15 דקות במהירות אפס הליכון.
12. הגדר את מהירות סיבוב ההליכון ~ 15 ס"מ/s עבור 15 דקות תוך רכישת תמונות 2pFLIM. המשך הדמיה עבור ≥ 20 דקות לאחר החלפת סיבוב הליכון, כדי להעריך את משך הפעילות PKA לאחר הפסקת התנועה כפויה.

6. ניתוח תמונות של 2pFLIM

1. פתח את התמונות שנרכשו ב-FLIMview והגדר את הפרמטרים הבאים ב-FLIMview.
   הערה: פרטי הפרמטרים מתוארים בדיון.
   1. לחץ על ספירת פוטון בודד (SPC) שדות טווח מינימלי ומקסימלי ב FLIMview. הזינו ערך מינימלי ומקסימלי של טווח ה-SPC, בדרך כלל בין 1.2-2 ל-10-12 ₪ בהתאמה.
   2. לחץ על שדה t₀ Value ב FLIMview והזן את ערך ה-t₀ (בדרך כלל ~ 2 ns). לחץ על שדות החיים של הסף המינימלי לזוהר השדה ב FLIMview ולהזין את הערך הסף הרצוי 5-30 שבפוטונים.
2. לחץ על לחצן הקבוצה החדשה (N) והקצה שם קבוצת ניסוי. פעולה זו תיצור קבוצה המשלבת נתונים מכל תמונת FLIM שנוספה.
3. לחץ על לחצן roi ב שולטת roi מודול של FLIMVIEW ולצייר ROI סביב הסומה takarα-חיובית. הפחת את טווח מחסנית z, על-ידי הזזת המגבלה הנמוכה והעליונה של z במחווני הבקרה של מחסנית z ב- FLIMview, כדי למזער את זיהום האותות שמקורם בפוטונים ברקע בעומקים אחרים של z.
4. לחץ על כפתור + כדי להוסיף את תמונת flim לקבוצה (שלב 6.2). לחץ על לחצן חישוב כדי לחשב את אורך החיים ממוצע (LT, המכונה גם ממוצע פליטת פוטון זמן [המפט]), עבור ROI ואת שגיאת שערוך במשך החיים (δτ).
5. פתח את הקובץ הבא בסדרת ההדמיה 2pFLIM הכרותית. חזור על שלב 6.4. הקפד להתאים את המיקום של ההחזר ROI ו-z טווח למדוד את אותו tAKARα חיובי-חיובית לאורך זמן, כי יכול להיות הרקמה להיסחף לאורך זמן.
6. בחר את האפשרות Deltampet / מחלק 0 בתפריט הנפתח של הקבוצה שולטת במודול. לחץ על השדה בסיסית והזן את האינדקס (es) (לדוגמה, 1 2 3 4 5 עבור חמשת התמונות הראשונות בקבוצה שנוצרה בשלב 6.3). פעולה זו תגדיר את התמונות המשמשות לחישוב אורך חיים בסיסי (LT₀).
7. לחץ על העלילה כדי ליצור גרף המכיל את תגובת flim (ΔLT/LT₀) של takarα במהלך הניסוי ב-rois המוגדר. שינויים מנורמאליים בחיים (ΔLT) של ROIs בודדים על-ידי תקופת החיים הבסיסית המתאימה (LT₀) מאפשרים השוואה של פעילות pka במהלך תנועה על פני rois שונים.

Results

החיישנים מאפשרים הדמיה של מסלולים רבים ושונים של אותות, כולל מסלול המחנה/PKA המעורב במניפולציה עצבית. הפרוטוקול הנוכחי מנצל את חיישן tAKARα שפותחה לאחרונה בשילוב עם 2pFLIM כדי להמחיש את פעילויות PKA לתוך הראש קבוע עכברים התנהגות. ניתן לשדרג את רוב שני הפוטונים הקיימים באמצעות יכולות 2pFLIM באמצעות הוספת שלושה לארבעה רכיבים, כפי שמודגם באיור 1 (ראו גם סעיף 1). כדי להמחיש את התמונה בתמונות שנרכשו ב-2pFLIM, כימות החיים המשמעות בוצעו על חלקות היסטוגרמה של תזמון פ...

Discussion

פרוטוקול זה מדגים את השימוש של חיישן-FLIM מחיישנים tAKARα כדי להמחיש את הפעילות העצבית-הפעלת PKA פעולה בראש-קבוע עכברים התנהגות. יישום זה מבוסס על בדיקות נרחבות ומאפיין של tAKARα ב מבחנה ובvivo להפגין כי האות FLIM שהושג הוא רלוונטי לאירועים נוירומודולטיים פיזיולוגיים¹⁷. כאן, אחד ביישום vivo, פעילות PKA המושרה בקליפת המנוע, משמש כדי לתאר את ההליכים לאספקת החיישן למוח, ניתוח בעלי חיים עבור דימות, חומרה ותוכנה דרישות עבור התנהגות ורכישת נתונים הדמיה , תוכנות ואלגוריתמים לניתוחי נתונים בהדמיה.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 μ m מסנן מזרק אצטט תאית	Nalgene	190-2520	שלב 3.2.2.
16x 0.8 NA מטרת טבילה במים	Nikon	MRP07220	שלב 5.5.
כבל 3 פינים	דיגיטלי ארה"ב	CA-MIC3-SH-NC	שלב 2.5. כדי לחבר חיישן סיבוב לכניסת ה-DAQ של לוח לחם האלומיניום של המיקרוסקופ
	Thorlabs	MB1012	שלב 2.5.
תוכנת AnimalTracker MATLAB	N/A N/	A	שלב 2.5 וסעיפים 5 - 6. יסופק על פי בקשה למחבר הראשי
מסנן מחסום מעבר פס	Chroma	ET500-40m	שלב 1.4.
צלחת כלוב	Thorlabs	CP01	שלב 2.4. משמש כהרכבה לחיישן סיבוב
קוצים מפלדת פחמן למקדחה מיקרו, קוטר קצה 0.5 מ"מ	FST	19007-05	שלבים 3.2.3. ו-4.4.
כיסוי עגול (קוטר 5 מ"מ)	VWR	101413-528	שלב 4.5.
מחזיק מחט הזרקה בהתאמה אישית	N/A	N/	A שלב 3.2.4. פרטים טכניים נמסרו על פי בקשה למחבר הראשי
אקריליק דנטלי	ייטס מוטלואיד	44114	שלבים 4.3. ו-4.5.
מקדחה דנטלית; Microtorque ii	מוצרי ראם	66699	שלבים 3.2.3. ו-4.4.
פולימר שקוף Dowsil	The Dow Chemical Company	3-4680	שלב 4.5.
אלקטרודה אלקטרודה	בקס	LF650P5	שלב 3.1.4.
אלקטרופורטור	Bex	CUY21	שלב 3.1.4.
FCF ירוק מהיר	Sigma-aldrich	F7258-25G	שלב 3.1.1.
תוכנת FLIMimage MATLAB	N/A N/	A	סעיף 5. מסופק באדיבות על ידי ד"ר ריוהיי יאסודה, מקס פלאנק פלורידה
FLIMview תוכנת MATLAB	N/A N/		A סעיפים 5. ו-6. יסופק על פי בקשה למחבר הראשי
דבק תואם קצף (דבק לבן גורילה)	גורילה	5201204	שלב 2.3.
לוחית ראש	N/A	N/A	שלב 4.3. פרטים טכניים מסופקים על פי בקשה למחבר הראשי
מחזיק לוחית ראש	N/A	N/A	שלב 2.6. פרטים טכניים מסופקים על פי בקשה מחבר ראשי, בשימוש בשילוב עם תושבת עמוד הרכבה ותושבת בזווית ישרה
מיקרומניפולטור הידראולי	Narishige	MO-10	שלב 3.2.4.
דבק קרייזי	דבק קרייזי	KG82648R	שלב 4.3. דבק מבוסס ציאנואקרילט
צינור פוטו-מכפיל מהיר בעל רעש נמוך	Hamamatsu	H7422PA-40 או H10769PA-40	שלב 1.3.
MATLAB 2012b	Mathworks	N/A	שלבים 2.6, וסעיפים 5 ו-6. משמש להפעלת תוכנת רכישת מיקרוסקופ וניתוח נתונים
מנוע	Zhengke	ZGA37RG	שלב 2.4.
בקר מהירות מנוע	Elenker	EK-G00015A1-1	שלב 2.5.
מיקרומניפולטור ממונע	סאטר	MP-285	שלב 3.2.4.
בסיס הרכבה	Thorlabs	BA1S	שלב 2.5. משמש לעמודים למנוע וחיישן בשילוב עם עמוד הרכבה PH4 ו-TR2
	Thorlabs	P14	שלב 2.6. משמש לעמוד מחזיק לוחית ראש בשילוב עם בסיס עמוד הרכבה PB2
	Thorlabs	PB2	שלב 2.6. משמש לעמוד מחזיק לוחית ראש בשילוב עם
תושבת עמוד הרכבה	Thorlabs	C1515	שלב 2.6. משמש בשילוב עם תושבת זווית ישרה ומחזיק לוחית ראש עמוד
אופטי	Thorlabs	TR2	שלב 2.5. משמש לעמודים למנוע וחיישן בשילוב עם BA1S ו-PH4
מלח חוצץ פוספט	Ν/Α	ν/α	שלב 3.2.2. פרוטוקול: פרוטוקולי קולד ספרינג הארבור 2006, doi: 10.1101/pbd.rec8247
Photodiode	Thorlabs	FDS010	שלב 1.2.
מודול ספירת תזמון פוטונים	בקר והיקל	SPC-150	שלב 1.1.
פלסמיד: tAKAR ואלפא; (CAG-tAKAR&אלפא;-WPRE)	Addgene	119913	שלב 3.1.3.
מחזיק התפקיד	Thorlabs	PH4	שלב 2.5. משמש לעמודים למנוע וחיישן בשילוב עם BA1S ו-TR2
תושבת זווית ישרה	Thorlabs	AB90	שלב 2.6 בשימוש בשילוב עם תושבת עמוד הרכבה ומחזיק לוחית ראש
מקודד סיבוב	אמריקאי דיגיטלי	MA3-A10-250-N	שלב 2.4.
שטיח גומי	Rubber-Cal	B01DCR5LUG	שלב 2.1.
צימוד פיר (1/4 אינץ' x 1/4 אינץ')	McMaster	6208K433	שלבים 2.3. ו-2.4.
ScanImage 3.6	Svoboda Lab/Vidrio Technology	N/A	שלבים 5.9. ו-6.1.
מפצל אותות	בקר והיקל	HPM-CON-02	שלב 1.3.1.
ציר נירוסטה (קוטר 1/4 אינץ', L = 12 אינץ')	McMaster	1327K66	שלב 2.3.
מערכת יישור סטריאוטקסית	David kopf	1900	שלבים 3.2. ו-4.1. שונה; מיקרומניפולטור סאטר, מחזיק מחט הזרקה בהתאמה אישית, מיקרומניפולטור הידראולי מיקרוסקופ
דו-פוטוני	N/A	N/	A סעיף 5. נבנה על בסיס מערכת מיקרוסקופיה מודולרית in vivo multiphoton (MIMMS) מקמפוס המחקר HHMI Janelia (https://www.janelia.org/open-science/mimms)
דבק רקמות Vetbond	3M	14006	שלב 3.2.6.
וירוס: tAKAR ואלפא; (AAV2/1 hSyn-tAKARα-WPRE)	Addgene	119921	שלב 3.2.2.
רולר קצף PE לבן (8 אינץ 'x 12 אינץ')	מפעלי ייצור בע"מ.	30-2261	שלב 2.1.1.
חצאי כדור פוליסטירן לבן	גרהםמתוק	קוטר 200 מ"מ 2 חצאים חלולים	שלב 2.1.1.
Zipkicker	PACER	PT29	שלב 4.3. מאיץ הקשחה