כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור מערכת ביופסיה בחינם צף של העור על מקטעים לביופסיה של מעטפת המאפשרת זיהוי של מחלות היווצרות המחלה מסוים של מחלת אלפא מעורב במחלת פרקינסון מספר חלבונים של מערכת העצבים ההיקפית
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מיקוד אלפא Synuclein אגרגטים בתוך עורית היקפיים סיבים עצביים על ידי Free-צפה אימונוofלואונסנציה החופשית
במאמר זה
סיכום
תקציר
עד היום, עבור רוב מחלות ניווניות רק האבחון הסופי לאחר המוות histopathological זמין. עבור מחלת פרקינסון (PD), האבחון עדיין מסתמך רק על סימנים קליניים של מעורבות מוטורית המופיעים מאוחר יותר בקורס המחלה, כאשר רוב הנוירונים הדוגיים האלה כבר אבדו. מכאן, יש צורך חזק בסמנים שיכולים לזהות חולים בתחילת המחלה או בסיכון לפתח אותו. במהלך השנים האחרונות, ביופסיה העור הוכיחה להיות כלי מחקר מעולה ואבחון עבור מחלות עצבים היקפיים כגון נוירופתיה סיבים קטנים. מעניין, נוירופתיה סיבים קטנים ומערכת האלפא synuclein (αSyn) הפקדות עצביות הוכחו על ידי ביופסיה בעור חולי PD. אכן, ביופסיה העור יש את היתרון הגדול של להיות נגיש בקלות, פולשני מינימלית הליך כאבים המאפשר ניתוח של רקמת העצבים ההיקפית נוטה הפתולוגיה. יתר על כן, האפשרות של חזרה על ביופסיה של העור במהלך המעקב של החולה אותו מאפשר ללמוד את הקשר האורך עם התקדמות המחלה. הגדרת פרוטוקול אמין מתוקננת כדי לחקור את הנוכחות של אגרגטים αSyn בסיבי עצב העור של החולה PD. פרוטוקול זה כולל כמה שלבים הקיבעון קצר, הפסקה קריוטום ולאחר מכן בחינם צף הimmunofluorescence כפולה עם שני נוגדנים ספציפיים: אנטי חלבון מוצר גנטי 9.5 (PGP 9.5) כדי לסמן את סיבי העצב עורית ו 5G4 לגילוי . אגרגטים αSyn זהו מגוון, רגיש וקל לבצע פרוטוקול שניתן גם להחיל על המיקוד חלבונים אחרים של עניין עצבי העור. היכולת לסמן אגרגטים αSyn הוא צעד נוסף קדימה לשימוש ביופסיה של העור ככלי להקמת אבחנה טרום לנתיחה לפני המוות של PD.
מבוא
ביופסיה העור רכשה חשיבות רבה כמו כלי אבחון ומחקר בתחום של הפרעות נוירולוגיות1. אכן, אפידרמיס ו דרמיס מכילים שופע סיבי העצב החושי החושים (מיאלואידית ובלתי מיאלואידית), nociceptive קצוות עצביים חינם, קולטני חישה ואינבציה אוטונומי של בלוטות הזיעה, כלי, בלוטות החלב ושרירים הרקטור השרירום 2. שתיים.
באמצע המאה ה -20, ההתקנה עבור אימונוהיסטוכימיה של הנוגדן pgp 9.5 מותר הראיות של שימור נרחב של העור באפידרמיס האדם3. Pgp 9.5 הוא carboxyl-טרמינל הידרוקלז מופץ באופן שווה לאורך אקסונים של מערכת העצבים המרכזית וההיקפית (היקפית). הזמינות של הנוגדן הזה מותר לא רק כדי להבהיר ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הפרוטוקול אושר על ידי ועדת האתיקה של הקנטראל וכל הנושאים הרשומים העניקו הסכמה מושכלת למחקר.
1. העור אוסף ביופסיה
- תן רופא מוסמך לבצע את ביופסיה העור בסביבה קלינית מתאימה.
- בחר את האזור כדי לבצע את ביופסיה העור ולנקות אותו עם ספוגית אלכוהול.
- הכינו את פתרון ההרדמה עם 1 cc של לידוקאין 2%.
- , עם המחט במקביל לאזור. תזריק תת-עורי הרדמה מקומית
- לאחר בדיקת ההשפעה של הרדמה, לקחת את 3 הפונץ ' חד פעמי ולהחיל הסיבוב ואת הלחץ העדין כלפי מטה כדי לסובב אותו למטה דרך האפידרמיס ואת dermis, עד השומן התת עורי הוא הגיע.
- . למשוך את האגרוף
- השתמש מלקחיים חד פעמיים כדי למשוך בעדינות את העור לחבר.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בעקבות ההליך המתואר (איור 1), גילינו אגרגטים αSyn, המסומנים עם נוגדן 5G4, במבנה עצבי העורי innervating מבנים אוטונומית של חולי PD. מורפולוגיה של הפיקדונות אלפא-synuclein מופיע כאות מנוקד לאורך האקטונים של עצבי העורי (איור 2). אכן, ניצול פרוטוקול זה 19 חולים PD ו -17 שולטת ביופסיה בעור בשלושה אתרים אנטומיים (צוואר הרחם, הירך ואת הרגל המרוחק) מצאנו כי 5G4 היה 81% של רגישות ו 86% של ספציפיות לגבי פקדים בריאים P-αSyn היו 56% של רגישות ו-100% של ספציפיות ל
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
אנו מתארים את שיטת הimmunofluorescence צף חינם עבור ביופסיות עור לאבחון של PD: הוא מנצל את החיסוני כפול עם אנטי PGP הנוגדן 9.5, סמן panaxonal, ו-anti-5G4, נוגדן מסוים מזהה הטופס הצבור של αSyn.
היתרונות הגדולים של ביופסיה של העור למטרת אבחון ב PD ואולי בהפרעות אחרות חלבון הפרעות מסוימות הם: 1) גישה ישירה רקמת העצבים נוטה למחלות על ידי טכניקה פולשנית במקצת, ובכך עם נחישות טובה הצפויה רגישות עבור אגרגטים αSyn מאשר נוזלים ביולוגיים כמו דם או שדרתי; 2) את ההזדמנות לזהות ולכמת צפיפות סיבים עצביים בא.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
. למחברים אין מה לגלות
תודות
אנו מודים לפרקינסון שוויץ ו ABREOC (המועצה המייעצת של המחקר המדעי של ה-"אנטה Ospedaliero)" על תמיכתם הכספית של מחקר זה.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 5G4 (אנטי אנושי ואלפא; Syneclein 5G4) | Analytik Jena Roboscreen | 847-0102004001 | עכבר חד שבטי |
| AlexaFluor 488 עז אנטי ארנב IgG | Invitrogen | 1971418 2 מ"ג/מ"ל | |
| AlexaFluor 594 עיזים נגד עכבר IgG | Invitrogen | 1922849 | 2 מ"ג/מ"ל |
| תמיסת מימן פוספט דיסודיום מימן פוספט | Merk Millipore | 106586 | |
| אתילן גליקול | סיגמא-אולדריץ' | 324558 | |
| גליצרול | סיגמא-אולדריץ' | G7757 | |
| ל-ליזין מונוהידרוכלוריד | סיגמא-אולדריץ' | L5626 | |
| פרפורמלדהיד | אולדריץ' כימיה | ||
| PGP9.5 | Abcam | ab15503 | ארנב פוליקלונלי |
| נתרן כלוריד | סיגמא | S3014 | |
| נתרן דימימן פוספט מונוהידרט | Merck Millipore | 106346 | |
| נתרן (מטא)פריודיאט | סיגמא-אולדריץ' | S1878 | |
| טריזמה בסיס | סיגמא | T1503 | |
| טריטון X-100 | סיגמא-אולדריץ' | X100 | |
| Vectashield | מעבדות וקטור | H-1000 | מדיום הרכבה |
מקורות
- McArthur, J. C., Griffin, J. W. Another Tool for the neurologist's Tollbox. Annals of Neurology. 57, 163-167 (2005).
- Wilkinson, P. F., Millington, R. Skin. , Cambridge University Press. Cambridge. ISBN 978-0-521-10681-8 49-50 (2009).
- Weddell, G., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
