מאמר שיטה

קביעת צפיפות צינור המרה בכבד העכבר

DOI:

10.3791/59587

⸱

30 באפריל 2019

 , 
1Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine, 2Medical Scientist Training Program (MSTP), Baylor College of Medicine, 3Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים שיטה פשוטה למדי ורגיש לקוונפיקציה מדויקת של צפיפות צינור המרה בכבד העכבר. שיטה זו יכולה לסייע בקביעת ההשפעות של מכפילי גנטי וסביבתי ואת האפקטיביות של טיפולים פוטנציאליים מודלים העכבר של מחלות המרה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העכבר משמש באופן נרחב כאורגניזם מודל ללמוד מחלות המרה. כדי להעריך את התפתחות ותפקוד של מערכת המרה, טכניקות שונות משמשות, כולל סרום כימיה, ניתוח היסטולוגית, וכתמים חיסוני עבור סמנים ספציפיים. למרות טכניקות אלה יכול לספק מידע חשוב על מערכת המרה, הם לעתים קרובות לא מציגים תמונה מלאה של צינור המרה (BD) מומים התפתחותיים על פני הכבד כולו. זה חלק בשל היכולת האיתנה של כבד העכבר כדי לנקז את המרה אפילו בבעלי חיים עם ליקוי משמעותי בפיתוח המרה. כאן אנו מציגים שיטה פשוטה כדי לחשב את המספר הממוצע של BDs המשויכים כל וריד הפורטל (PV) בסעיפים המכסים את כל האונות של עכברים מוטציה/טרנסגניים. בשיטה זו, כבדים מורכבים ומנות בצורה סטריאוטימית כדי להקל על השוואה בין גנוטיפים שונים ותנאים ניסיוניים. BDs מזוהים באמצעות מיקרוסקופ קל של מיקרוקרטין ויטראז ', ולאחר מכן נספר ומחולק על ידי המספר הכולל של PVs להציג באזור הכבד. לדוגמה, אנו מראים כיצד שיטה זו יכולה להבחין בבירור בין עכברים מסוג פראי לבין מודל עכבר של תסמונת אלאלאין. השיטה המוצגת כאן אינה יכולה להיות מחליפה לטכניקות המבראות את המבנה התלת-מימדי של עץ המרה. עם זאת, הוא מציע דרך קלה וישירה כדי לאמוד את פיתוח BD להעריך את מידת היווצרות התגובה ductular בעכברים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עץ המרה הוא חלק מכריע בכבד היונקים, ומאפשר למעבר המרה מהפטציטים לבטן. תעלות המרה בתוך הכבד (BDs) נוצרות על ידי המרה, אשר מבדילים בין הפוטנציאל הפוטנציאלי באמצעות חריץ וTGFβ איתות1,2. המפרט הנכון והמחויבות של המרה וההרכבה שלהם לתוך BDs בוגרת הם קריטיים לפיתוח עץ המרה הפנימי של הדלקת הכבד. כמו הכבד גדל במהלך הפיתוח או על התחדשות איברים, מערכת המרה צריך להתפתח לאורך הכבד כדי להבטיח ניקוז המרה תקין. יתר על כן, מספר מחלות syndromic ושאינם סינכדרומית התוצאה בפאולסיטי של BDs3. בנוסף, מספר מחלות הכבד חריפה וכרוניות להצמיח תגובות ductular כביכול בכבד, אשר מוגדרים כנוכחות של מספר משמעותי של תאים ....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל בעלי החיים שוכנו במתקן לבעלי חיים של המכשול בביילור קולג ' לרפואה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים והנחיות וועדות שימוש בפרוטוקולים בעלי חיים מאושרים.

1. אוסף של רקמת הכבד של העכבר

  1. הכנת העכבר לקציר הכבד
    1. המתת החסד של העכבר באמצעות isofלוריאן.
    2. לבצע נקע בצוואר הרחם של העכבר כדי להבטיח מוות.
    3. לעשות חתך רוחבי בערך סנטימטר אחד מתחת לכלוב הצלעות.
    4. לחשוף את כל המשטח. הגחוני של הכבד
  2. אוסף של כבד העכבר
    1. בזהירות, עם מספריים קטנים, חותכים את הרצועות חיבור הכבד לאיברים אחרים בבטן.
    2. חותכים דרך BD המשותף כדי לנתק את הכבד מן המעי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעבר תועדו פגמים המרה ב Jag1 +/– בעלי חיים, מודל העכבר של algs8. כדי לקבוע את היחס BD ל-PV, שP30 מנות כבדי העכבר ומוכתמות במשותף עבור CK8 ו CK19 (wsCK) יחד עם סמן כלי הדם αSMA. לאחר מכן אנו מ, לאחר מכן את כל PVs כל האונות בכבד. כפי שמוצג באיור 2A, הגדרתי pvs כמו כלי αSMA-ויטראז ' בעלי כתמים wsCK סמוכים (ראשי חץ). המבנים הαSMA והמוכתמת ללא wsCK היו ורידים מרכזיים ואין לכלול אותם בניתוח (חץ).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתוח של פיתוח BD ותיקון בעכברים הוא כלי חשוב בלימוד פתוגנזה ומנגנון של הפרעות כיס הולסטטי. בנוסף, התפתחות הטיפולים החדשים תלויה בקביעת הפנוטיפים ובהתאם לתהליך המדידה. פנוטיפ הנוכחי במודלים העכבר כרוך בדרך כלל סרום כימיה, היסטולוגיה בכבד וכתמים חיסוני עבור מסוג תא סמנים ספציפיים. למרות טכניקות אלה לייצר מידע חשוב על מבנה ותפקוד של מערכת המרה, הם לא מספקים מדד ישיר של ההשפעות של מניפולציה גנטית נתונה על מספר BDs. בפתולוגיה אנאטומית, BD דלות בחולים אנושיים נקבעת באמצעות ניתוח של BD כדי PV יחס בסעיף ביופסיה

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגוד אינטרסים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מכירים את התמיכה של המכון הלאומי לבריאות (NIH) (R01 GM084135 ו R01 DK109982), פרס פיילוט/היתכנות ממרכז הרפואי של טקסס מרכז מחלת העיכול תחת NIH P30 DK56338, ופרס מאיץ של תסמונת אלג'אין . הקרן הרפואית

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
איזותזיה (איזופלורן)הנרי שיין11695-6776-2
מייבשבל-ארט16-800-552
10% PFAמיקרוסקופיה אלקטרונית מדעי15712
שפופרת 50 מ"לThermoScientific339653
70% אתנולדקון מעבדות2401
95% אתנולדקון מעבדות2801
100% אתנולDecon Laboratories2701
HistoChoiceVWR Life SciencesH103-4Lסוכן סליקה
Omnisette Tissue CassetteFisher HealthCare15-197-710E
MacrosetteSimportM512
Paraplast X-TRAMcCormick Scientific39503002עובש רקמות פראפין
פישר סיינטיפיק62528-32
מיקרוטוםמיקרוםHM 325
סופרפרוסט פלוס מיקרוסקופ שקופיותפישר סיינטיפיק12-550-15
קסילןפישר סיינטיפיקC8H10
מעבדות וקטור אחזור אנטיגן מבוססות טריסH-3301
לחץ סירמיידי סירלוקס מיני
מיני פאפעט Life Technologies8877
פוליאוקסיאתילן 20 סורביטן מונולאורט (Tween-20)J.T. BakerX251-07
אוקטיל פנול אתוקסילט (Triton-X-100)J.T. BakerX198-07
סרום עיזים רגילJackson Immunoresearch005-000-121
anti-CK8מחקרים התפתחותיים בנק היברידומהמזהה רישום נוגדניםTROMA-I
anti-CK19מחקרים התפתחותיים בנק היברידומהמזהה רישום נוגדניםTROMA-III
אנטי-&אלפא;SMASigma AldrichA2547, Clone 1A4
anti-rat-Alexa488ThermoFisherA21208
anti-mouse-Cy5Jackson Immunoresearch715-175-151
DAPIVector LaboratoriesH-1000
22 x 50 מ"מ2 מיקרו כיסוי זכוכיתVWR Life Sciences48393 059
מיקרוסקופ פלואורסצנטיLeicaDMI6000 B
KimwipesKimtech Science05511
VECTASHIELDVector LaboratoriesH-1000מדיום הרכבה נגד דהייה
AB531826 AB2133570

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zong, Y., et al. Notch signaling controls liver development by regulating biliary differentiation. Development. 136 (10), 1727-1739 (2009).
  2. Clotman, F., et al. Control of liver cell fate decision b....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Alpha SMA

מאמרים קשורים