מאמר שיטה

מבט כלפי חוץ: בידוד של Cyanobacterial שוחרר פולימרים פחמימות וחלבונים

DOI:

10.3791/59590

⸱

27 במאי 2019

 , 
1Bioengineering and Synthetic Microbiology Group, Instituto de Investigação e Inovação em Saude, Universidade do Porto, 2Instituto de Biologia Celular e Molecular, Universidade do Porto, 3Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar, 4Departamento de Biologia, Faculdade de Ciências, Universidade do Porto

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, פרוטוקולים עבור בידוד של cyanobacterial שוחרר פולימרים פחמימות ובידוד של exoproteomes שלהם מתוארים. שני ההליכים לגלם שלבים מרכזיים כדי להשיג פולימרים או חלבונים עם דרגות טוהר גבוהה, כי ניתן להשתמש לניתוח נוסף או יישומים. הם יכולים גם להיות מותאמים בקלות בהתאם לצרכים ספציפיים של המשתמש.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כחוליות יכול להפריש באופן פעיל מגוון רחב של biomolecules לתוך הסביבה החילוץ, כגון הפשפשים וחלבונים. ההזדהות והאפיון של biomolecules אלה יכולים לשפר את הידע על משעולים הפרשה שלהם ולעזור לתמרן אותם. יתרה מזאת, חלק מbiomolecules הללו מעניינים גם במונחים של יישומים ביו-טכנולוגיים. המתואר כאן הם שני פרוטוקולים עבור בידוד קל ומהיר של cyanobacterial שוחרר פולימרים פחמימות וחלבונים. השיטה לבידוד של פולימרים שפורסמו מבוססת על טכניקות משקעים קונבנציונליים של פוליסכרידים בפתרונות מימית באמצעות ממיסים אורגניים. שיטה זו משמרת את מאפייני הפולימר ובמקביל נמנעת מנוכחותם של מזהמים מפסולת התא וממדיום תרבותי. בסופו של התהליך, פולימר ליאופהיזה מוכן לשמש או מאופיין או יכול להיות נתון לסיבובים נוספים של טיהור, בהתאם לשימוש סופי מיועד. בנוגע לבידוד של cyanobacterial exoproteome, הטכניקה מבוססת על ריכוז של מדיום ללא תא לאחר הסרת המזהמים העיקריים על ידי צנטריפוגה וסינון. אסטרטגיה זו מאפשרת בידוד אמין של חלבונים המגיעים לתחומי החילוץ באמצעות מובילי הממברנה או שלפוחיות הקרום החיצוני. חלבונים אלה יכולים להיות מזוהים לאחר מכן באמצעות טכניקות המסה סטנדרטי ספקטרומטריה. הפרוטוקולים המוצגים כאן ניתן להחיל לא רק על מגוון רחב של כחוליות, אלא גם על זנים חיידקיים אחרים. יתר על כן, הליכים אלה יכולים להיות מותאמים בקלות על פי השימוש הסופי של המוצרים, תואר הטוהר הנדרש, והזן חיידקי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כחוליות מוכרות באופן נרחב כמקורות פורה של מוצרים טבעיים עם יישומים מבטיחים ביו-טכנולוגיים/ביו-רפואיים. לכן, הבנת מנגנוני הפרשה cyanobacterial ואופטימיזציה של שיטות החילוץ/שחזור חיוניים כדי ליישם cyanחיידקים יעילים מפעלים תאים מיקרוביאלית.

זנים cyanobacterial רבים מסוגלים לייצר חומרים פולימריים מסחטות (EPS), שנוצרו בעיקר על ידי הפשפשים, כי להישאר משויך משטח התא או משתחררים לתוך המדיום1. אלה פולימרים פחמימות שפורסמו יש תכונות נפרדות לעומת אלה של חיידקים אחרים, אשר להפוך אותם מתאימים עבור מגוון רחב של יישומים (למשל, נוגדנים2, מגירוי חיסוני3, נוגד חמצון4, מתכת-הכלפת5, אמולסיה6, וסוכני משלוח הסמים7,8). מתודולוגיה לבידוד של פולימרים אלה תורמת בעיקר לא רק כדי לשפר את התשואה אלא גם להגדיל את הטוהר ואת התכונות הפיזיות הספציפיות של הפולימר השיג9. רוב עצום של שיטות אלה לבידוד של פולימרים להסתמך על אסטרטגיות משקעים מתוך מדיום התרבות כי הם מושגת בקלות בשל הטבע האנייוני חזק של הפולימר9,10. בנוסף, הסרת ממיסים המשמשים בשלב המשקעים יכולה להיות מושגת במהירות על ידי אידוי ו/או ליזוליזציה. בהתאם ליישום מיוצג, שלבים שונים יכולים להיות ביחד או לאחר או לפני משקעים פולימריים על מנת להתאים את המוצר הסופי, הכוללים חומצת חומץ triכלור (TCA) טיפול, סינון, או כרומטוגרפיה הדרה (SEC) הטור טיהור10.

כחוליות מסוגלות גם להפריש מגוון רחב של חלבונים באמצעות מסלולים התלויים בטרנספורטי קרום (קלאסי)11 או בתיווך על ידי שלפוחיות (לא קלאסית)12. לכן, ניתוח של cyanexoproteome terial מהווה כלי חיוני, הן כדי להבין/לתמרן הפרשת חלבון cyanobacterial מנגנונים ולהבין את הפונקציה החילוץ ספציפיים של חלבונים אלה. הבידוד האמין והניתוח של הexoproteomes דורשים את הריכוז של הסביבה המועטה, שכן השפע של החלבונים מופרש נמוך יחסית. בנוסף, צעדים פיזיים או כימיים אחרים (למשל, צנטריפוגה, סינון או משקעים בחלבון) עשויים למטב את איכות הexoproteome המתקבלת, להעשיר את תוכן החלבון13, ולהימנע מנוכחות מזהמים (למשל, פיגמנטים, פחמימות, וכו') מיכל בן 14 , 15 או שליטה מראש של חלבונים תאיים בדגימות. עם זאת, חלק מהשלבים הללו עשויים גם להגביל את ערכת החלבונים שניתן לאתרם, המובילה לניתוח מוטה.

עבודה זו מתארת פרוטוקולים יעילים לבידוד של פולימרים משוחררים של פחמימות וexoproteomes מתוך מדיה של התרבות הקיאנקטריה. פרוטוקולים אלה ניתן להתאים בקלות את המטרות הספציפיות של המחקר ואת צורכי המשתמש, תוך שמירה על הצעדים הבסיסיים המוצגים כאן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. בידוד פולימר משוחרר פחמימות

  1. בידוד פולימרי והסרת מזהמים
    1. לטפח את המתח cyanobacterial תחת תנאים סטנדרטיים [למשל, 30 ° צ' תחת אור 12 h (50 μE m-2-1)/12 h משטר כהה, עם טלטול מסלולית ב 150 rpm]. למדוד צמיחה באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים [למשל, צפיפות אופטית ב 730 ננומטר (OD730nm), כלורופיל a, יבש משקל, וכו '], אז למדוד את הייצור של פוליסכדים שפורסמו על פי החומצה פנול-גופרתית שיטה16.
    2. להעביר את התרבות לקרומים דיאליזה (12-14 kDa של משקל מולקולרי לגזור) ו dialyze נגד מינימום של 10 כרכים של מים מוכי עבור 24 h עם ערבוב רציפה.
      הערה: בהתאם לנפח התרבות כדי dialyze והרכב בינוני, ייתכן שיהיה צורך לשנות את מי הדיאליזה.
    3. צנטריפוגה את התרבות ב 15,000 x g עבור 15 דקות ב 4 ° c. להעביר את סופרנטאנט למבחנה חדשה ולמחוק את הגלולה (תאים).
    4. צנטריפוגה שוב ב 20,000 x g עבור 15 דקות ב-4 ° צ' כדי להסיר מזהמים כגון הקירות הקיר או ליפופוליסכרידים (lps).
    5. להעביר את הסופרנטאנט לגביע זכוכית ולהשליך את הגלולה.
  2. משקעים של הפולימר
    1. הוסף 2 כרכים של 96% אתנול לסופרנטאנט.
    2. מודיית את ההשעיה ב 4 ° c, לפחות לילה.
    3. התאוששות מפולימר
      1. עבור כמויות קטנות או לא גלוי של שרז פולימר: צנטריפוגה את ההשעיה ב 13,000 x g עבור 25 דקות ב 4 ° c. השמט את הסופרנטאנט והשהה מחדש את הגלולה ב-1 מ ל או 2 מ ל של מים מפוקעים. להעביר את ההשעיה מימית לבקבוקון.
        התראה: יש לסלק את הסופרנטאנט בעדינות, מאחר שהוא יכול להיות מושהה בקלות.
      2. לעין/כמויות גדולות של שרז פולימר: לאסוף את פולימר הזירז עם מלקחיים מתכת סטרילית לבקבוקון. לסחוט את הפולימר ולהשליך את האתנול עודף.
    4. אופציונלי: בהתאם לדרגת הטיהור הפולימרי הנדרש, חזור על שלב המשקעים עם 96% אתנול לאחר השעיית הפולימרים במים מנולים.
  3. הליאופליזציה של הפולימר
    1. שמרו את הבקבוקונים עם פולימר הזירז ב-80 ° c, לפחות בן לילה.
    2. להקפיא יבש (ליזוליז) פולימר לפחות 48 h (לא נותנים ההשעיה להפשיר לפני להקפיא לייבוש).
    3. אחסן את הפולימר היבש בטמפרטורת החדר (RT) עד לשימוש נוסף.
      הערה: מומלץ לאחסן את הפולימר בdesiccator, שכן הוא יכול לספוג מים לאורך זמן.

2. בידוד exoproteome של cyanobacterial

  1. ריכוז בינוני
    1. לטפח כחוליות בתנאים סטנדרטיים [למשל, 30 ° צ' מתחת לאור 12 h (50 μE m-2-1)/12 h משטר כהה, עם טלטול מסלולית ב 150 rpm]. נטר את הצמיחה cyanobacterium באמצעות הליכים סטנדרטיים (למשל, OD730nm, כלורופיל a, יבש משקל, וכו ').
    2. צנטריפוגה את התרבויות ב 4,000 x g, עבור 10 דקות ב RT.
    3. להעביר את סופרנטאנט לבקבוקון ולמחוק את הגלולה התא.
    4. לסנן את המדיום יצקתי דרך מסנן 0.2 יקרומטר גודל הנקבוביות.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן למשך פרק זמן קצר, אם המדיום נשמר ב-4 ° c.
    5. רכזו את המדיום כ-500 x (בהתחשב בנפח הראשוני של המדיום המסונן), באמצעות ריכוז צנטריפוגלי עם משקל מולקולרי נומינלי שנחתך מ-3 kDa. יש להפעיל את צנטריפוגה ב-4,000 x g (מקסימום 1 h לכל צנטריפוגה עגול) ב-15 ° c.
      התראה: עבור רוב המותגים, התקן המסנן צריך להיות שוטפים על ידי צנטריפוגה עם מים באולטרטהורים לפני השימוש. ברגע שהמסנן רטוב, אל תתנו לו להתייבש. השאר מספיק נוזלים במאגר כאשר ההתקן אינו נמצא בשימוש.
      הערה: הפחתת הטמפרטורה הצנטריפוגה ל-4 ° צ' עשויה להיות שימושית אם המטרה היא לחקור את פעילות החלבונים, למרות שהיא תגדיל את הזמן הדרוש להתרכזות במדגם. ניתן להשהות את הפרוטוקול בין צנטריפוגה צעדים לפרקי זמן קצרים אם המדיום נשמר ב-4 ° c.
    6. שטפו את הקירות של מאגר לדוגמה של התקן המסנן בעזרת המדגם המרוכז והעבירו את התוכן לשפופרת מיקרוצנטריפוגה.
    7. בצע שטיפת כביסה נוספת של מאגר המכשיר לדוגמה מסנן עם בינוני התרבות אוטוקלע כדי להבטיח התאוששות exoproteome מקסימלית.
      הערה: כדי לכמת את אחוז ההחלמה, בצע את הוראות היצרן הספציפיות.
    8. אחסן את הדגימות הexoproteome ב-20 ° c עד לשימוש נוסף.
      הערה: הוספת מעכבי פרוטאז מומלצת לאחסון לטווח ארוך.
  2. ניתוח הexoproteome
    1. לכמת את תכולת החלבון על ידי שיטת החלבון BCA ב 96-הצלחת בהתאם להוראות היצרן.
    2. הפרד את החלבונים על ידי נתרן dodecyl סולפט-פוליאקרילמיד ג'ל אלקטרופורזה (SDS-PAGE), באמצעות פרוטוקולי כתמים סטנדרטיים (למשל, Coomassie כחול, כתמים כסף).
    3. חותכים את הלהקות/ג'ל אזורים של עניין ולאסוף אותם בצינורות מיקרוצנטריפוגה שונים המכילים כרכים המתאימים של מים אולטרה טהורים.
    4. המשך בזיהוי ובניתוח של החלבונים על-ידי ספקטרומטר מסה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ייצוג סכמטי של השיטה תיאר לחלץ פולימרים פחמימות שפורסמו מתוך התרבויות cyanobacterial מתוארת באיור 1. פולימרים של מפיקת ה-EPS המתונות cyanobacterium sy, מפיק מסוג היצרן. pcc 6803 ומפיק ה-eps היעיל המפיק השני של ccy 0110 מוצגים באיור 2. באיור 3, מוצגים פולימרים ליאופונים בעלי דרגות שונות של זיהום, המדגיש את חשיבות הצעדים הצנטריפוגה לטוהר המוצר הסופי. איור 4 מתאר את שיטת הבידוד עבור cyan...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי להבין טוב יותר מנגנוני הפרשה חיידקיים וללמוד את המוצרים שפורסמו, זה חשוב ביותר כדי להדגים את הבידוד יעיל וניתוח של הbiomolecules הנוכחי בסביבה חיידקי החילוץ (כגון שוחרר פולימרים של פחמימות וחלבונים).

מסחטות cyanobacterial פולימרים פחמימות מורכבים מאוד, בעיקר בשל מספר ופרופורציה של monosaccharides שונים המהווים הרכב שלהם1. השיטות הקונבנציונליות המשמשות לבידוד של חומרים פולימריים אלה מסתמכים על המושג הפשוט שחומרים אלה עשירים בסוכר מסיסים בפתרונות מימית ויכולים להיות ז...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו היתה ממומנת על ידי Fundo אירופu de Desenvolvimento האזורית (פדר) קרנות באמצעות 2020 להתחרות-תוכנית Operacional לתחרותיות ובאינטראלליזציה (POCI), פורטוגל 2020, ועל ידי כספים פורטוגזית דרך FCT-Funda, הסדרה האלקטרונית e Tecnoלוג/Ministério da Ciência, Tecnoלוגיה e Ensino מעולה במסגרת הפרויקט POCI-01-0145-פדר-028779 והענק SFRH/BD/99715/2014 (CF).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ממברנות דיאליזהמדיסל ממברנות בע"מDTV.12000.07צינורות Visking גודל 7, קוטר 23.8 מ"מ, רוחב 39-41 מ"מ גליל 30 מ' 
אתנול 96%AGA - ואקוטי; lcool e Gé neros Alimentares, S.A.4.000.02.02.00תסיסה אתילי אלכוהול 96% AGA
PES מסנן 0.2 μ mפישר סיינטיפיק, מסנן מזרק 15206869 Ldaפוליסטירן 33 מ"מ 0.2& מיקרו; M STR 
Amicon Ultra-15, Ultracel-3KMerck Millipore Ltd.UFC900324מסננים צנטריפוגליים עם חתך משקל מולקולרי נומינלי של 3 kDa
Thermo Scientific  בדיקת חלבון BCA PierceFisher Scientific, Lda10741395מגיב בדיקה ירוק לכחול, מדויק ותואם לחומרי ניקוי למדידת ריכוז החלבון הכולל
Brillant Blue G תרכיז קולואידי סיגמא אולדריץ' Quí נציץ SLB2025-1EACoomassie כחול 

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pereira, S., et al. Complexity of cyanobacterial exopolysaccharides: composition, structures, inducing factors and putative genes involved in their biosynthesis and assembly. FEMS Microbiology Reviews. 33 (5), 917-941 (2009).
  2. Kanekiyo, K., et al. Isolation of an Antiviral Polysaccharide, Nostoflan, from a Terrestrial Cyanobacterium, Nostoc flagelliforme. Journal of Natural Products. 68 (7), 1037-1041 (2005).
  3. Løbner, M., Walsted, A., Larsen, R., Bendtzen, K., Nielsen, C. H. Enhancement of human adaptive immune responses by administration of a high-molecular-weight polysaccharide extract from the cyanobacterium Arthrospira platensis. Journal of Medicinal Food. 11 (2), 313-322 (2008).
  4. Wang, H. B., Wu, S. J., Liu, D. Preparation of polysaccharides from cyanobacteria Nostoc commune and their antioxidant activities. Carbohydrate Polymers. 99, 553-555 (2014).
  5. Ozturk, S., Aslim, B., Suludere, Z., Tan, S. Metal removal of cyanobacterial exopolysaccharides by uronic acid content and monosaccharide composition. Carbohydrate Polymers. 101, 265-271 (2014).
  6. Han, P. P., et al. Emulsifying, flocculating, and physicochemical properties of exopolysaccharide produced by cyanobacterium Nostoc flagelliforme. Applied Biochemistry and Biotechnology. 172 (1), 36-49 (2014).
  7. Leite, J. P., et al. Cyanobacterium‐Derived Extracellular Carbohydrate Polymer for the Controlled Delivery of Functional Proteins. Macromolecular Bioscience. 17 (2), 1600206(2017).
  8. Estevinho, B. N., et al. Application of a cyanobacterial extracellular polymeric substance in the microencapsulation of vitamin B12. Powder Technology. 343, 644-651 (2019).
  9. Klock, J. H., Wieland, A., Seifert, R., Michaelis, W. Extracellular polymeric substances (EPS) from cyanobacterial mats: characterisation and isolation method optimisation. Marine Biology. 152 (5), 1077-1085 (2007).
  10. Delattre, C., Pierre, G., Laroche, C., Michaud, P. Production, extraction and characterization of microalgal and cyanobacterial exopolysaccharides. Biotechnology Advances. 34 (7), 1159-1179 (2016).
  11. Costa, T. R., et al. Secretion systems in gram-negative bacteria: structural and mechanistic insights. Nature Reviews Microbiology. 13 (6), 343-359 (2015).
  12. Roier, S., Zingl, F. G., Cakar, F., Schild, S. Bacterial outer membrane vesicle biogenesis: a new mechanism and its implications. Microbial Cell. 3 (6), 257-259 (2016).
  13. Sergeyenko, T. V., Los, D. A. Identification of secreted proteins of the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803. FEMS Microbiology Letters. 193 (2), 213-216 (2000).
  14. Oliveira, P., et al. The versatile TolC-like Slr1270 in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Environmental Microbiology. 18 (2), 486-502 (2016).
  15. Flores, C., et al. The alternative sigma factor SigF is a key player in the control of secretion mechanisms in Synechocystis sp. PCC 6803. Environmental Microbiology. 21 (1), 343-359 (2018).
  16. Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Analytical Chemistry. 28 (3), 350-356 (1956).
  17. Parikh, A., Madamwar, D. Partial characterization of extracellular polysaccharides from cyanobacteria. Bioresource Technology. 97 (15), 1822-1827 (2006).
  18. Rühmann, B., Schmid, J., Sieber, V. Methods to identify the unexplored diversity of microbial exopolysaccharides. Frontiers in Microbiology. 6, 565(2015).
  19. Pathak, J., Rajneesh, R., Sonker, A. S., Kannaujiya, V. K., Sinha, R. P. Cyanobacterial extracellular polysaccharide sheath pigment, scytonemin: A novel multipurpose pharmacophore. Marine Glycobiology. , CRC Press. 343-358 (2016).
  20. Nguyen, A. T. B., et al. Performances of different protocols for exocellular polysaccharides extraction from milk acid gels: Application to yogurt. Food Chemistry. 239, 742-750 (2018).
  21. Jamshidian, H., Shojaosadati, S. A., Mousavi, S. M., Soudi, M. R., Vilaplana, F. Implications of recovery procedures on structural and rheological properties of schizophyllan produced from date syrup. International Journal of Biological Macromolecules. 105, 36-44 (2017).
  22. Couto, N., Schooling, S. R., Dutcher, J. R., Barber, J. Proteome profiles of outer membrane vesicles and extracellular matrix of Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Proteome Research. 14 (10), 4207-4222 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Cyanobacteria

מאמרים קשורים