מאמר שיטה

ביטוי וטיהור של Nuclease-מזבל החמצן חינם Protocatechuate 3, 4-דיחמצן

5.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59599

⸱

8 בנובמבר 2019

 ,  ,  , 
1Cancer Biology and Genetics, College of Medicine, The Ohio State University

במאמר זה

סיכום

Protocatechuate 3, 4-דיחמצן (PCD) ניתן להסיר בחינם חמצן diאטומית ממערכת מימית באמצעות המצע שלה protocatechuic חומצה (PCD). פרוטוקול זה מתאר את הביטוי, הטיהור וניתוח הפעילות של אנזים ניקוי החמצן.

תקציר

מיקרוסקופ אחד (SM) משמש במחקר של אינטראקציות מולקולריות דינמיות של fluorophore המסומנים בזמן אמת. עם זאת, fluorophores נוטים לאבד את האות דרך photobleaching לבנה על ידי חמצן מומס (O2). כדי למנוע הלבנת ולהאריך את תקופת החיים fluorophore מערכות ניקוי חמצן (OSS) מועסקים כדי להפחית O2. OSS זמין מסחרית יכול להיות מזוהם על ידי נוקלאוסים כי נזק או לבזות חומצות גרעין, פרשנות מייסדת של תוצאות ניסיוני. כאן אנו מפרטים פרוטוקול עבור הביטוי והטיהור של פסאודומונס מאוד פעיל protocatechuate-3, 4-diחמצון (pcd) ללא זיהום נוקלאז לזיהוי. PCD יכול באופן יעיל להסיר מינים מגיב O2 על ידי המרה של המצע protocatechuic חומצה (pcd) ל 3-קרבוxy-cis, cis-muconic חומצה. שיטה זו יכולה לשמש בכל מערכת ימית שבה O2 ממלאת תפקיד מזיק ברכישת נתונים. שיטה זו יעילה בהפקת פעיל מאוד, נוקלאז חינם pcd בהשוואה pcd זמין מסחרית.

מבוא

מולקולה יחידה (SM) ביופיזיקה היא שדה הצומח במהירות שינוי הדרך בה אנו מסתכלים על תופעות ביולוגיות. לשדה זה יש את היכולת הייחודית לקשר בין חוקי הפיסיקה והכימיה לביולוגיה. מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית היא אחת שיטה ביופיזית שיכולה להשיג רגישות SM. הקרינה הפלואורסצנטית משמש כדי לזהות biomolecules על ידי קישור אותם fluorophores אורגני קטן או נקודות הקוונטים1. מולקולות אלה יכול לפלוט פוטונים כאשר מתרגש על ידי לייזרים לפני הלבנת הלבנה2. הלבנה מתרחשת כאשר תוויות פלורסנט לעבור נזק כימי אשר הורס את היכולת שלהם להלהיב באורך הגל הרצוי2,3. הנוכחות של מינים חמצן תגובתי (ROS) במאגר מימית הם הגורם העיקרי של photobleaching לבנה2,4. בנוסף, רוס יכול לגרום נזק biomolecules ולהוביל תצפיות שגויות ב ניסויים SM5,6. כדי למנוע נזק חמצוני, מערכות ניקוי חמצן (OSS) ניתן להשתמש3,7,8. מערכת הגלוקוז אוקסידאז/קטלאז (GODCAT) יעילה בסילוק חמצן8, אך היא מייצרת הפרזות עשויות להזיק כintermediates. אלה עלולים להזיק לbiomolecules של עניין בלימודי SM.

לחילופין, protocatechuate 3, 4 diחמצון (pcd) ביעילות להסיר O2 מתוך פתרון מימית באמצעות המצע שלה protocatechuic חומצה (pcd)7,9. PCD הוא מטלואנזים המשתמשת בברזל nonheme כדי לתאם PCD ולזרז את תגובת הפתיחה catechol ring באמצעות מומס O210. זו תגובה צעד אחד מוצג להיות OSS הכולל טוב יותר לשיפור יציבות fluorophore ב ניסויים SM7. למרבה הצער, הרבה אנזימי OSS זמינים מסחרית, כולל PCD, מכילים נוקלאוסים מזהם11. מזהמים אלה יכולים לגרום לנזק של הגרעין מבוססי חומצות מצעים המשמשים בניסויים SM. עבודה זו להבהיר פרוטוקול טיהור מבוסס כרומטוגרפיה לשימוש PCD רקומביננטי במערכות SM. PCD ניתן להחיל באופן כללי על כל ניסוי שבו ROS הם מזיקים מצעים הדרושים עבור רכישת נתונים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. לגרום PCD ביטוי E. coli

  1. שילוב 1 μL pVP91A-pcaHG ביטוי PCD ביטויים באמצע (20 ng/μL, איור 1A) ו 20 μl של E. coli BL21 (20מסחריתהתאים זמין, > 2 x 106 cfu/μg פלבאמצע) בצינור. קפיצי את הצינור כדי לערבב. . שים את השפופרת על קרח 5 דקות
  2. מניחים שינוי ב 42 ° c עבור 30 s. . ואז קרח 2 דקות
  3. הוסף 80 μL SOC מדיה (ציר אופטימלי במיוחד עם דיכוי catabolite: 2.5 mM KCl, 10 מ"מ הנאל, 2% טריטונים, 0.5% שמרים תמצית, 10 מ"מ MgSO4, 10 מ"מ Mgso2, 20 מ"מ גלוקוז). ללחוץ על 225 מהפכות לדקה (rpm) 37 ° צ' עבור 1 h.
  4. צלחת תגובת שינוי ליברות Amp אגר (1L לוריא ציר אגר: 10 g הנרוג, 10 גרם באקול-טריטונים, 5 גרם שמרים לחלץ, 15 g אגר, 50 μg/mL אמפיצילין; 25 מ ל לכל 10 ס מ בקוטר צלחת פטרי).
  5. מודקת את הצלחת, מכסה כלפי מטה, ב 37 ° c עבור 16-18 h.
  6. איחסן 50 mL ליברות Amp (1L LB: 10 גרם bacto-טריטונים, 10 גרם הנרוג, 5 גרם שמרים לחלץ, 50 μg/mL אמפיצילין) ב 250 mL Erlenmeyer בקבוקון עם מושבה אחת. מודטה ב 37 ° c עבור 16-18 h רועד ב 225 rpm.
  7. העברת 20 מ ל התרבות ל 4 ל בקבוקון עם מגבר L ליברות 1. ללחוץ על 225 סל"ד ב 37 ° c.
  8. כל h למדוד את התרבות OD600 (צפיפות אופטית ב 600 ננומטר). כתרבות OD600 מתקרב 0.5, להגדיל את תדירות המדידות כל 15 דקות. הצפיפות הרצויה של התרבות היא 0.5 OD600.
  9. להעביר את בקבוקון 4L לסל של קרח. מערבולת את הבקבוקון באמבט הקרח. כדי להקטין את טמפרטורת התרבות
    הערה: הזמן על הקרח צריך להישמר למינימום, כך התאים יישארו metabolically פעיל. באופן אידיאלי התאים יהיו על הקרח פחות מ 10 דקות.
  10. אינדוקציה מוצלחת של PCD ניתן לצפות על ידי הdodecyl סודיום נתרן פוליאקרילמיד ג'ל אלקטרופורזה (SDS-PAGE) ניתוח. קציר של 1 מ ל של התרבות הבלתי מושרה בצינור. לסובב את המדגם 1 דקות ב 14,000 x g ב microfuge בטמפרטורת הסביבה. . בסדר.
    1. מסיסות התאים הפלטד ב 150 μL PBS (פוספט מאגור מלוחים).
    2. להוסיף נפח שווה של צבע הטעינה 2X (1.2% SDS, 30% גליצרול, 150 mM טריס-HCl, pH 6.8, 0.0018% ברומאופנול כחול, 15% β-mercaptoethanol). מערבולת המדגם לערבב ביסודיות.
    3. מרתיחים את המדגם עבור 3 דקות ולהעביר לקרח. ניתן לאחסן את המדגם במקפיא של 20 ° c לניתוח עתידי.
      הערה: PBS זמין מסחרית עם או בלי CaCl2 ו MgCl2. מעבדות רבות יהיה PBS ללא CaCl2 ו MgCl2 עבור שיטות תרבות התא. לא מצאנו שום הבדל עם PBS עם או בלי CaCl2 ו MgCl2.
  11. העבר את 4 ל בקבוקון לחממה ב -17 ° c עם 180 סל ד לרעוד. המשך לעקוב אחר OD600 כל 20 דקות.
  12. ב 0.7 OD600 להוסיף איזופרופיל-Beta-D-thioגלאוסייד (iptg) כדי 0.5 mM הריכוז הסופי (0.25 M פתרון מניות) ו 10 מ"ג/L אמוניום ברזל (II) סולפט הקסהמיים (Fe4)2(כך4), 10מ"ג/mL פתרון המניה). בנוסף, התוצאה הנובעת מהיזם T5 בתוספת iptg (איור 1א). ברזל גופרתי מאוגד על ידי PCD ונדרש לפעילות קטליטית באמצעות תיאום חמצן במהלך catechol פתיחה.
  13. לנער את התרבות ב 180 סל ד ב 17 ° c עבור 18 h.
  14. הניחו את הבקבוקון של התרבות בקרח כמו ב-1.2. קציר 1 mL של התאים המושרה עבור SDS-עמוד כמו ב 1.3.
  15. יוצקים את התרבות החיידקית לבקבוקים המתאימים לצנטריפוגה. תרבות 1 L יכול להיות centrifuged ב 4 250 mL בקבוקים התחתון חרוט. מצנלת את התרבות ב-4 ° צ' במשך 20 דקות ב 3000 x g.. הסופר-על היפטר פסולת נוזלית חיידקית כראוי.
  16. Pipet להשעות מחדש את כדורי ב 25 mL קר PBS (CaCl2 ו MgCl2 הם אופציונליים) לכל תרבות אחת.
  17. העבר את ההשעיה ל 50 מ ל צינורות (1 50 ml). כדור התאים בשעה 3000 x g עבור 20 דקות ב 4 ° c. הענק את הסופרנט. והשלך אותו כראוי
  18. להשעות את התאים ב 10 מ ל של מאגר הליזה (300 מ"מ, 50 mM טריס-HCl, pH 7.5, 20 מ"מ סרפידול, 10% גליצרול, 800 ng/mL Pepstatin, 1 μg/mL Leupeptin, ו-87.1 μg/mL פנילמתיל פלוליאיל פלואוריד (PMSF)) על ידי ליטוף הקפאת ההשעיה עם חנקן נוזלי בבקבוקון Dewar. אחסן את הצינורות לדוגמה במקפיא של 80 ° c. יש לנו לטהר את PCD מפני כדורי מאוחסן-80 ° c למשך שנה אחת ללא כל אובדן לכאורה של פעילות.
  19. השוואת התאים הבלתי המושרה והמושרה על ידי SDS-PAGE.
    הערה: לא היה לנו קושי עם אינדוקציה של PCD הטרודימר. עם זאת, אנו ממליצים לבדוק את האינדוקציה לפני שתמשיך בטיהור במקרה כל מגיב שתוקפו פג במפתיע.
    1. להרכיב צלחות עבור SDS-עמוד (מידות: 7.3 ס"מ x 8.3 ס"מ x 0.75 עובי מ"מ). ג'ל הערמה הוא 1.5 mL 6% פוליאקרילאמיד (6% אקרילאמיד, 125 mM טריס-HCl, pH 6.8, 0.1% SDS, 0.1% אמוניום פרסולפט, 0.001% TEMED). ג'ל הפתרון הוא 3.5 mL 12% פוליאקרילאמיד (12% אקרילאמיד, 375 mM טריס-HCl, pH 8.8, 0.1% SDS, 0.1% אמוניום פרסולפט, 0.001% TEMED). הכנס מסרק של 10 היטב לשכבת הערימה.
    2. טען 10 μL של דגימות בקטריאלי שאינן מושרה והמושרה. טען 4 μL של סמני משקל מולקולרי מקדים עבור חלבונים (איור 1B).
    3. הג הג ב 16.5 V/cm כ 1 h. כחול ברומרופנול צריך להגיע לתחתית הג.
    4. מניחים את ג'ל בכתם כחול Coomassie (10% חומצה אצטית, 40% מתנול, 0.1% הצבע הכחול כחול) באמבט פלסטיק. הכתם צריך לטבול את הג לחלוטין. כתם בטמפרטורת הסביבה עבור 20 דקות. סיבוב עדין בזמן הכתמים הוא אופציונלי.
    5. להחליף את הפתרון עם destain (10% חומצה אצטית, 40% מתנול). דגירה בטמפרטורת הסביבה עם סיבוב עדין אופציונלי עד להקות חלבונים גלויים בקלות.
    6. החליפו את הדכתם במים מפוהים. בין החלבונים חיידקי, המושרה PCD תת יחידות צריך להיות גלוי בתאים המושרה. הקסאחדידין מתויג pcd משנה למעלה pcd יש משקל מולקולרי של 28.3 kda ו-pcd יחידה יחידת הוא 22.4 kda. אם יחידות המשנה של PCD אינן ברורה, יש לבצע אינדוקציה חדשה שנגזר ממושבה הרומן.

2. כרומטוגרפיה של זיקה ניקל לטיהור של PCD

  1. הפשרת קרח 1 50 מ"ל שפופרת של תאים המושרה. זה יכול לקחת 2-3 h כדי להפשיר לחלוטין את המדגם.
  2. שמירה על הצינור על הקרח, sonicate את המדגם 30% משרעת עבור 1 דקות, רכיבה על אופניים 1 s וכיבוי. השתמש מיקרוטיפ מחודדות (קוטר 0.125 אינץ ') sonicator. הכוח המקסימלי הוא 400 W והתדר הוא 20 kHz ו-1 לאחד הגלולה התרבות.
  3. לאחר sonication, להוסיף ליזוזים 0.2 mg/ml הריכוז הסופי (10 מ"ג/ml פתרון מניות) ולשמור על קרח 30 דקות ב 4 ° c.
  4. יוצקים את החיידק החיידקי לתוך בקבוק פוליקרבונט טרום מקורר (מידות: 25 מ"מ x 89 מ"מ). הבקבוק צריך להיות תואם רוטור קבוע ultracentrifuge זווית. צינורות אחרים ו/או לבוש אחרים עשויים להיות מוחלף, אך כוח הכבידה הסופי צריך להישמר.
  5. צנטריפוגה עבור 60 דקות ב 120,000 x g ב 4 ° c. . שרידים סלולאריים יוצרים גלולה הסופרנטאנט עשוי להיראות צהוב.
    1. הגלולה ניתן לכלול בניתוח SDS הבאים כדי לקבוע את מסיסות של PCD (איור 1B). מסיסות הגלולה על ידי vortexing ב 10 מ ל PBS. העבר 150 μL לשפופרת 1.5 mL. הכן את הדוגמה עבור SDS-PAGE כמו ב-1.3.
  6. יוצקים את הסופרנטאנט לצינור הקרה של 50 מ"ל. שים לב לעוצמת הקול. זיהום של סופרנטאנט עם דנ א חיידקי עשוי להניב דגימה צמיגה. הדנ א של הגנומית החיידקי. יכול לחסום את זרימת העמודים השלב ה2.2 של הפעולה צריך לחזור על הגלולה לדנ א החיידקי. ייתכן שגלולה ממהדורה שניה זו לא תהיה גלויה או עשויה להיות שקופה.
  7. הפוך 500 mL Ni מאגר A (300 מ"מ הנאל, 50 mM טריס-HCl, pH 7.5, ו 10% גליצרול, 800 ng/mL Pepstatin, 1 μg/mL ליופטין, ו-87.1 μg/mL PMSF) ו 500 mL Ni מאגר B (300 mM הנאקל, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10% גליצרול, 800 ng/mL Pepstatin, 1 μg/mL ליופטין, ו-87.1 μg/mL PMSF, ב250 מילימטר, משנת pH 8.0). העבר שני מאגרי Ni באמצעות מסנני הנקבוביות 0.2 יקרומטר.
  8. הדוגמה, המאגרים ומערכת ה-FPLC (כרומטוגרפיה נוזלית מהירה בחלבון) נמצאים בחדר קירור ב-4 ° c. לשטוף משאבת A עם Ni מאגר A ו משאבה B עם Ni מאגר B. לשטוף את המערכת עם 20 מ"מ סרמדול (8% Ni מאגר B, 92% Ni מאגר A) עד UV ומוליכות ייצוב. אנו באופן קבוע להזרים מאגרים ב 5 מ ל/דקה עם מגבלת לחץ 1.0 MPa. את קצב הזרימה ואת מגבלת הלחץ צריך להיקבע על ידי המפרט של מכשיר FPLC בשימוש.
  9. הכן עמודה עם שרף מחויב ל-1.5 mL (מידות: 110 מ"מ אורך x 5 מ"מ). קיבולת הכריכה שרף הוא 50 mg/mL והוא יכול לסבול לחץ 1 MPa. ניתן לשפוך עמודה ולאחסנו ב-4 ° צ' לפני הטיהור.
    הערה: גודל העמודה עשוי להיות מוגבר באופן פרופורציונלי כדי להכיל יותר מ 1 50 מ"ל שפופרת של תאים המושרה אם יותר חלבון נדרש. אנו מעדיפים טור טרי עבור כל הכנה כדי להבטיח כי לא שרידי חלבונים לזהם החלבון הרצוי שלנו. עם זאת, שרפים ניקל עשוי להיות ממוחזרים על פי הוראות היצרן.
  10. חבר את העמודה של שרף טעונה ניקל ל-FPLC. הפעל 20 מ ל של 92% Ni מאגר A ו-8% Ni מאגר B (20 מ"מ הסרמידול) ב 0.5 mL/min עם מגבלת הלחץ של ממדי 0.5 באמצעות העמודה כדי להגביל. בזמן אמת FPLC צריך למדוד A280 (280 ננומטר לספיגת UV) כמו גם מוליכות. אם ערכים אלה לא התייצבו לאחר שעוצמת הקול של 20 mL עברה את העמודה, יש להזרים את המאגרים עד שיוצב.
  11. טען את המדגם לעמודה (~ 10 mL) ב 0.15 mL/min. הגדר את מגבלת הלחץ ל 0.5 MPa. לאסוף את הזרימה דרך.
  12. שטוף את העמודה עם 20 מ"ל Ni מאגר ב 20 מ"מ סרמדול (92% Ni מאגר A ו-8% Ni מאגר B). שמור את הכביסה בצינור 50 mL לניתוח. שטוף את העמודה עם 15 מ ל של 50% Ni מאגר A ו 50% Ni מאגר B (125 מ"מ הסרמאזול). לאסוף את הימנעות 19 שברים של 0.8 mL נפח. שטוף את העמודה עם 15 מ"ל 100% Ni מאגר B. לאסוף 75 שברים נוספים של 0.2 mL. חלק PCD הטרודימר יהיה elute בשנת 50% Ni מאגר B לשטוף, אבל רוב הטרודימר יהיה elute ב 100% Ni מאגר B לשטוף.
  13. ניתוח שברים שנאספו על 12% SDS-דף ג'לים כדי לאשר נוכחות של PCD. הוסף אמצעי אחסון שווים של צבע טעינה של 2X לזרימה דרך, שטוף והשיא280 שברים. מרתיחים עבור 3 דקות.. להעביר לקרח יוצקים 2 12% SDS-דף ג'לים (כמו בשלב 1.7). חזור על שיטת הג כפי שמתואר ב1.7.

3. שיטת הפעולה של nuclease

  1. בהתבסס על ניתוח ה-SDS-PAGE, זהה שברים של קירבת ניקל המכילים PCD כמעט טהור. שילוב 5 μL כרומטוגרפיה שבר ו 500 ng 3 kb המתפתל pXba בתוך מאגר התגובה (50 mM טריס-HCl, pH 7.5, 100 mM הנאקל, 5 מ"מ MgCl2, 0.1 MM dtt) עם נפח סופי של 50 μl.
    1. מודטה ב 37 ° c בשביל 1 h.
    2. כלול פקד שלילי (ללא חלבון מוסף) ופקד חיובי (PCD זמין מסחרית). להפסיק את התגובה עם 10 μL פתרון להפסיק (150 mM EDTA, pH 8.0, 0.6% SDS, 18% גליצרול, 0.15% כתום G).
    3. ניתן לשמור דוגמאות במקפיא של 20 ° c כדי לעבור ניתוח מאוחר יותר. ניתן להשתמש בכל הפלסטיות המתפתל בתוך שימוש בתנאי נוקלאז, כל עוד המוצרים המנופפים והרגועים של מעגלי העיגול עלולים להיפתר על ידי אלקטרופורזה בג ג'ל.
  2. יוצקים 120 mL 1% agarose ג'ל ב 1 x מאגר אתידיום טאי (40 mM Tris-אצטט, 1 מ"מ EDTA, 0.5 μg/mL אתידיום ברומיד) ב מיצוק ג'ל (מידות: 15 x 10 ס מ). השתמש מסרק 15 טוב (מידות טוב: 5mm x 1.5 מ"מ). כאשר הג מוגדר, לטבול אותו במאגר 1 x טאי אתידיום.
  3. לנתח 30 μL של תגובות על ידי ג ' התעורר ג'ל. החשמל בטמפרטורה של 10%/ס מ בטמפרטורת הסביבה כ-1 h. חזית הצבע של אורנג ' G צריכה להיות בסוף הג.
  4. השתמש בסורק הפלואורסצנטית כדי לדמות מיד את האות אתידיום ברומיד של ג'ל. אם שימש 3 ק ג פלמיד, הלהקה האיטית ביותר יהיה עיגולים רגועים ב ~ 3.5 kb, ה-DNA ליניארי יפעל ב 3 kb, ו מתפתל מפותל יהיה הניידות המהירה ביותר ~ 2 kb.
    1. חשב את נפח הפיקסלים הכולל של כל נתיב עם תוכנת ניתוח תמונה.
    2. לקבוע את עוצמת הפיקסל של מינים שונים DNA, כגון מתפתל, ליניארי, ופצע עיגולים. השתמש בערכים אלה כדי לקבוע את האחוז של כל מיני DNA. לדוגמה, נוכחות מוגברת של עיגולים בחתך המשויכים לשבר בהשוואה לפקד השלילי מציינת את הנוכחות של nuclease. נפח הפיקסלים של עיגולים שנגנב בנתיב מחולק בערך הפיקסל של דנ א מוחלט. קבע אחוזים על-ידי הכפלת מספר זה ב-100.
  5. לשלב שברים מפסגת המנוע השני המכילים כמעט טהורה pcd הטרודימר מבוסס על sds-העמוד ניתוח ויש להם מינימלי כדי לגילוי פעילות נוקלאז. נפח המאגר האופייני שלנו. הוא ~ 2 מ ל
  6. העמיסו את המדגם ליחידת מסנן צנטריפוגלי עם משקל מולקולרי 10 kDa. צנטריפוגה ב צנטריפוגה מנופף דלי ב 4000 x g עבור 40 דקות ב 4 ° c. לחלופין, ניתן להשתמש ב-35 מעלות זווית קבועה ב-7500 x g עבור 20 דקות ב-4 ° c.
    1. חזור על הצנטריפוגה עד לעוצמת הקול הסופית היא 100-200 μL.
    2. הפוך את יחידת הסינון ושחזר את הרטיאנאט על-ידי צנטריפוגה ב-1000 x g עבור 2 דקות ב-4 ° c.

4. החרגת גודל כרומטוגרפיה טיהור של PCD

  1. להפוך 250 mL גודל הדרה כרומטוגרפיה (שניות) פועל מאגר (100 mM הנרוג, 50 mM טריס-HCl, pH 7.5, 10% גליצרול, 0.1 mM EDTA, 800 ng/mL Pepstatin, 1 μg/mL ליופטין, ו-87.1 μg/mL PMSF). להעביר את המאגר באמצעות מסנן הנקבוביות 0.2 יקרומטר ולאחסן ב 4 ° c.
    הערה: בצע את כל השלבים בחדר קירור ב -4 ° c. טיהור SEC הוא אופציונלי, אך יש לאחסן את החלבון במאגר שפועל באמצעות SEC. אם משמיטים את הטיהור של SEC, הרטיט שנאסף ב3.6.2. צריך להיות דיאליזה נגד 1 L של מאגר SEC ב 10 kda mwco (משקל מולקולרי לחתוך) צינור דיאליזה ב 4 ° c הלילה.
  2. שיטה הכוללת עמודה מקושרת בין שניה (כרומטוגרפיה של אי-הכללה) (מידת כרומטוגרפית: 10 מ"מ x 300 מ"מ; 24 מיקרומטר במיטה; 25-500 μL לדוגמה אמצעי אחסון; 1.5 MPa מגבלת הלחץ; 2 x 106 דה מגבלת הכללה; 1 עד 300 הפרדת הדיסק) עם מאגר הפעלה 0.5 של sec בשעה
    הערה: אם ייתכן שנעשה שימוש בעמודות בגודל חלופי הרצוי.
  3. טען את השברים המרוכזים ללולאה של הזרקת אמצעי אחסון מ200 μL. טען את המדגם ב0.5 mL/min לעמודה. רזולוציית SEC גדלה עם נפח טעינה קטן יותר. Elute עם 23 מ"ל שניה פועל מאגר ולאסוף 94 שברים של 250 μL. כרומטוגרם SEC צריך לפתור יחיד A280 שיא כי הוא pcd הטרודימר. . מצאנו את הדיסק ה8.9 mL התזמון החומק ישתנה באמצעות עמודות חלופיות של SEC.

5. החמצון pca ופעילות נוקלאז

  1. התגובות לתוך היצע הן חמצון של pca ו נוקלאז הפעילות מתבצעים בלוח 96-ובכן שטוח למטה. להרכיב תגובות ב 96 צלחת באר על קרח בחדר 4 ° c הקרה כדי למנוע זרז מוקדמת. לשלב בכרך הסופי של 50 μL: 130 mM הנאליט, 50 mM טריס-HCl, pH 7.5, 5 מ"מ MgCl2, 0.1 MM dtt, 5 מ"מ pca, 10 Ng/mL סופר מתפתל pXba +, ו 10 μl של שברים בודדים PCA SEC.
    הערה: השברים PCD SEC יש להוסיף האחרון ומיד לפני ניתוח כמו חלבון יתחיל לזרז בזמן נוסף.
  2. החמצון PCD של PCD תוצאות ספיגה מופחתת של PCD ב 290 nm (A290). העבר את צלחת ה96 היטב למחזיק הצלחות של קורא צלחת להגדיר טמפרטורה פנימית של 37 ° c. למשוך את מחזיק הצלחת לתוך המכשיר ולמדוד A290 במרווחי זמן של 20 עבור 1 h. האם המכשיר לנער את צלחת 5 s לפני כל קריאה.
  3. אחרי 1 h, לסיים את התגובות על ידי הוספת 10 μL פתרון להפסיק (150 mM EDTA, pH 8.0, 0.6% SDS, 18% גליצרול, 0.15% כתום G).
  4. להכין, לטעון, ולהפעיל ג'ל שנוצר כמו בשלב 3.2.
  5. תמונה ולנתח את ג'ל agarose כמו בשלב 3.3.
  6. בחר שברים עם הפעילות החמצון ביותר pca ואין זיהום נוקלאז שנצפו לאחסון לטווח ארוך ב-80 ° c. . תמדוד אתה280
  7. חשב את הריכוז הכולל של PCD באמצעות A280 ומקדם ההשמדה (ε280) של 734,700 M-1ס מ-1.
  8. הצמד שברים בודדים הקפאה בחנקן נוזלי. חנות במקפיא. של 80 ° c לחלופין, לשלב פעיל, nuclease-שברים חינם, aliquot ו להקפיא באותו אופן. התשואה האופיינית שלנו היא 1-2 mg PCD לתרבות L. שימוש אופייני בניסוי SM הוא 3 μg PCD. השתמשנו ב-PCD המאוחסן ב-80 ° צ' עד 1 שנה ללא ירידה בפעילות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מסחרית זמין החמצן PCD הוא מזוהם לעתים קרובות עם nuclease DNA. פעילות מזהם נוקלאז עלולה להוביל לתוצאות מזויפות בלימודי פלורסנט, בעיקר מחקרים שניתוח dna או dna אינטראקציה חלבונים. מצאנו כי רקומביננטי PCD, הטרודימר של הקסאחדין מתויג למעלה ו-Pcd, ניתן להתבטא ב-E. coli (איור 1). הטרודימר מטוהר תחילה על ידי כרומטוגרפיה של זיקה ניקל (איור 2). PCD משתמט ב -2 שלבים של ריכוזי הפפירון. שברים בכרומטוגרפיה מנותח על ידי SDS-PAGE. שברים של PCD ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מערכות ניקוי חמצן כלולים בדרך כלל במיקרוסקופ יחיד מיקרוסקופ פלואורסצנטית כדי להפחית את הלבנה3,7,8. טכניקות אלה מיקרוסקופיה משמשות לעתים קרובות כדי להתבונן חומצות גרעין או אינטראקציות חלבונים עם חומצות גרעין1,13,14. זיהום של OSSs עם הנוקלאוסים עלול להוביל לתוצאות מזויפות.

Osss זמין מסחרית, כולל godcat ו-pcd, ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

עבודה זו נתמכת על ידי NIH GM121284 ו-AI126742 ל-KEY.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2-מרקפטואתנולסיגמא-אולדריץ'M3148ובטא; ME
30% תמיסת אקרילאמיד וביס-אקרילאמיד, 29:1Bio-Rad161-0156
חומצה אצטית, ACS Fisherl Chemical מוסמך קרחוניA38C-212
אגר, מגורעןBD BiosciencesDF0145-17-0
AKTA FPLC SystemGE Healthcare LifeSciences מטהר AKTA: Box-900, pH/C-900, UV-900, P-900 ו-Frac-920
Amicon Ultra-2 יחידת סינון צנטריפוגליEMD MilliporeUFC20102410 kDa MWCO
אמוניום ברזל (II) סולפט הקסהידראטSigmaF-2262
אמוניום פרסולפט (APS) טבליותAmrescoK833-100TABS
AmpicillinAmresco0339-25G
Bacto TryptoneBD BiosciencesDF0123173
תוסף מדיה תרבית מיובשת BD Bacto: תמצית שמרים בבקבוקVWR90004-092
BIS-TRIS פרופאן,>=99.0% (טיטרציה)Sigma-AldrichB6755-500G
ברומופנול כחולסיגמא-אולדריץ'B0126-25G
Coomassie בריליאנטבלו אמרסקו0472-50G
Costar 96– שטוח היטב; צלחת EIA תחתונהBio-Rad2240096EDU
DTTP212121SV-DTT
Dulbecco פוספט חוצץ מלח 500 מ"לסיגמא-אולדריץ'D8537-500 מ"לPBS
אתידיום ברומידתרמו פישר מדעיBP1302
גליצרולפישר מדעיG37-20
מגורען LB מרק מילרEMD Biosciences1.10285.0500
Hi-Res Standard AgaroseAGTC BioproductsAG500D1
ImidazoleSigma-AldrichI0250-250G
IPTGGoldbioI2481C25
LeupeptinRoche11017128001
Lysozyme מחלבון ביצת עוףSigma-AldrichL6876-1G
מגנזיום כלוריד הקסהידראטאמרסקו0288-1KG
ספקטרופוטומטר מיקרונפח, עם יכולת קובטתרמו פישרND-2000C
NaClP212121RP-S23020
Ni-NTA Superflow (100 מ"ל)Qiagen30430
Novagen BL21 תאים מוכשריםEMD Millipore69-449-3מדיה SOC כלולה
אורנג' Gפישר סיינטיפיק0-267
פפסטיןזהב ביוטכנולוגיהP-020-25
PMSFאמרסקו0754-25G
חומצה פרוטוקאטצ'ואיתפישר סיינטיפיקICN15642110PCA
נתרן דודציל סולפטP212121CI-00270-1KG
SpectraMax M2 Microplate קוראמכשירים מולקולריים
יחידות סינון חד פעמיות סטריליות עם קרום PES > 250 מ"לתרמו פישר סיינטיפיק09-741-04
יחידות סינון חד פעמיות סטריליות עם קרום PES > 500 מ"לתרמו פישר סיינטיפיק09-741-02
Superose 12 10/300 GLGE Healthcare Life Sciences17517301
TEMEDAmresco0761-25ML
Tris Ultra PureGojira Fine ChemicalsUTS1003
טייפון 9410 מצלמת פלואורסצנט במצב משתנהGE Healthcare Life Sciences
UltraPure EDTAInvitrogen/Gibco15575
ZnCl2Sigma-Aldrich208086

מקורות

  1. Shera, E. B., Seitzinger, N. K., Davis, L. M., Keller, R. A., Soper, S. A. Detection of single fluorescent molecules. Chemical Physics Letters. 174 (6), 553-557 (1990).
  2. Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores. Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).
  3. Ha, T., Tinnefeld, P. Photophysics of fluorescent probes for single-molecule biophysics and super-resolution imaging. Annual Review of Physical Chemistry. 63, 595-617 (2012).
  4. Dixit, R., Cyr, R. Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy. The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 36 (2), 280-290 (2003).
  5. Davies, M. J. Reactive species formed on proteins exposed to singlet oxygen. Photochemical & Photobiological Sciences. 3 (1), 17-25 (2004).
  6. Sies, H., Menck, C. F. Singlet oxygen induced DNA damage. Mutation Research. 275 (3-6), 367-375 (1992).
  7. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  8. Harada, Y., Sakurada, K., Aoki, T., Thomas, D. D., Yanagida, T. Mechanochemical coupling in actomyosin energy transduction studied by in vitro movement assay. Journal of Molecular Biology. 216 (1), 49-68 (1990).
  9. Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82 (14), 6132-6138 (2010).
  10. Brown, C. K., Vetting, M. W., Earhart, C. A., Ohlendorf, D. H. Biophysical analyses of designed and selected mutants of protocatechuate 3,4-dioxygenase1. Annual Review of Microbiology. 58, 555-585 (2004).
  11. Senavirathne, G., et al. Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems. Nature Methods. 12 (10), 901-902 (2015).
  12. Senavirathne, G., Lopez, M. A. Jr, Messer, R., Fishel, R., Yoder, K. E. Expression and purification of nuclease-free protocatechuate 3,4-dioxygenase for prolonged single-molecule fluorescence imaging. Analytical Biochemistry. 556, 78-84 (2018).
  13. Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nature Communications. 7, 11409(2016).
  14. Liu, J., et al. Cascading MutS and MutL sliding clamps control DNA diffusion to activate mismatch repair. Nature. 539 (7630), 583-587 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

PCD

מאמרים קשורים