פרוטוקול זה משתמש ב-החללית מבוסס בזמן אמת בתגובת שרשרת פולימראז (PCR), שיטת sulforhodamine B (SRB), 3 ' אזורים לא מתורגמים (3 ' UTR) שיבוט, ושיטת לוציפראז לאמת את הגנים היעד של miRNA עניין ולהבין את הפונקציות של Mirna.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
פרוטוקול מחוץ לגופית להערכת רמות מיקרוארנה, פונקציות, וגנים היעד הקשורים בתאי הגידול
במאמר זה
סיכום
תקציר
MicroRNAs (miRNAs) הם RNAs הרגולציה קטנים אשר מזוהים לווסת מסלולים מסוימים של איתות תאיים במספר מחלות כולל סרטן. אלה RNAs הרגולציה קטנים בעיקר אינטראקציה עם 3 ' אזורים לא מתורגם (3 ' UTR) של שליח היעד שלהם RNAs (mRNAs) בסופו של דבר וכתוצאה מכך עיכוב תהליכי פענוח של mRNAs ואת הגדלת Mrnas היעד degradations. בהתבסס על רמות הביטוי ופונקציות תאיים, miRNAs מסוגלים לשמש גורמי רגולציה של mRNAs ומדכאים הגידול המדכא. זיהוי של גנים היעד בתום המטרה של miRNA בין מאות או אפילו אלפי מטרות חזוי מבחינה חישובית הוא צעד מכריע כדי להבחין את התפקידים ומנגנונים מולקולאריים בסיסיים של מירנה של עניין. תוכניות מסוימות לחיזוי היעד miRNA זמינים כדי לחפש אינטראקציות miRNA-mRNA אפשרי. עם זאת, השאלה המאתגרים ביותר היא כיצד לאמת גנים מטרה ישירה של miRNA עניין. פרוטוקול זה מתאר אסטרטגיה הניתן לפונקציה של שיטות מפתח כיצד לזהות יעדי miRNA הקשורים לפונקציה miRNA. פרוטוקול זה מציג מדריך מעשי על הליכים צעד אחר צעד כדי לחשוף רמות miRNA, פונקציות, ו-mRNAs הקשורות היעד באמצעות הבדיקה מבוסס בזמן אמת התגובה שרשרת פולימראז (PCR), sulforhodamine B (SRB) שיטת בעקבות מחקה מחקים העברה , מינון התגובה עקומת הדור, ושיטת לוציפראז יחד עם שיבוט של 3 ' UTR של גן, אשר הכרחי להבנה נכונה של התפקידים של miRNAs בודדים.
מבוא
MicroRNAs (miRNAs) הם RNAs הרגולציה קטן כי בעיקר לווסת את תהליך התרגום והשפלה של RNAs שליח (mRNAs) על ידי התגובה ל 3 ' אזורים לא מתורגם (3 ' UTR) בתום היעד לאחד גנים1. ביטוי של miRNAs יכול להיות מוסדר על ידי מנגנונים שלאחר ההמרה. חוסר האיזון של מנגנונים כגון מביא בלתי מבוקרת וייחודית רמות הביטוי miRNAs במחלות רבות כולל סרטן2. ל-miRNA אחת יכול להיות מספר אינטראקציות עם mRNAs מגוונות. בהתאמה, mRNA הפרט יכול להיות נשלט על ידי miRNAs שונים. לכן, רשתות איתות תאיים מושפע באופן מסובכת על ידי ביטוי באופן מתבטא על ידי הפרעות פיסיולוגיים ומחלות ניתן ליזום והידרדר2,3,<....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. ניתוח ביטוי מיקרו-מיקרוארנה (מירנא)
-
בוגרת DNA משלימה (cDNA) סינתזה
- להוסיף 254 ng בסך הכל RNA ו 4.5 μl של deoxyribonuclease אני (dnase i) תערובות, ולאחר מכן להוסיף מים אלקטרופורזה ל-PCR רצועת צינורות לפצות עד 18 μl (איור 2a). הכן את התגובה עבור כל מדגם RNA הכולל מטוהרים ממספר קווי תאים באמצעות כמות מספקת של תערובות DNase I מבוסס על מספר כולל של תגובות.
הערה: תערובות dnase אני מורכב dnase i (1.8 μl), מעכב ריבונוקלאז (0.3 μl), ו -25 מ"מ mgcl2 (2.4 μl). כדי להבטיח להשיג RNA מוחלט, שיטת החילוץ המבוססת על עמודה הapplicated במקום להשתמש בשיטת החילוץ המבוססת על פנול-כלורופורם....
- להוסיף 254 ng בסך הכל RNA ו 4.5 μl של deoxyribonuclease אני (dnase i) תערובות, ולאחר מכן להוסיף מים אלקטרופורזה ל-PCR רצועת צינורות לפצות עד 18 μl (איור 2a). הכן את התגובה עבור כל מדגם RNA הכולל מטוהרים ממספר קווי תאים באמצעות כמות מספקת של תערובות DNase I מבוסס על מספר כולל של תגובות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
אישור מוצלח ומדויק של רמות miRNA חשוב לפרשנות של הנתונים שבהם הסיווג של Mirna אפשרי מבוסס על התפקידים הצפויים של Mirna בפיתוח והתקדמות של מחלה. רמות של miRNA-107 ו miRNA-301 נמדדו שלושה קווי התא הלבלב באמצעות ה-PCR כמותי המבוסס על בדיקה. סינתזה של cDNAs הן של miRNA ספציפית ו גן התייחסות באותה תגובה יכולה להגביר את האפשרות של נתונים. Panc-1 ו capan-1 הם בני אדם הלבלב אדנוקרצינומה תאים שורות, בעוד hpne הוא קו הלבלב מונצח צינור התא התמרה הדרגתית עם וקטור ביטוי retroviral יעיל מחסה האדם טלומראז הפוכה הטרנססקריפט (htert) גן. .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
אסטרטגיות לקביעת מטרות miRNA בתום ובלבד עם פונקציות של מירנה של עניין הם חיוניים להבנת תפקידים מרובים של Mirna. זיהוי של גנים היעד miRNA יכול להיות מנחה לפענוח התא איתות אירועים מאופנן על ידי Mirna בתא. החשיפה של גנים מטרה חשובה מבחינה פונקציונלית של miRNAs יכול לספק את הידע הבסיסי לפתח טיפול מבוססי Mirnas בסרטן.
מספר שיטות כגון microarrays ערכים, מיקרו ברצף הספרייה RNA קטן, רצף עמוק, היפוך הטרנססקריפט ב-PCR באתרו, ואת הגושים הצפוניים ניתן להחיל כדי לחקור את רמות הביטוי miRNA באמצעות RNA סך מב.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
. למחברים אין מה לגלות
תודות
מחקר זה נתמך על ידי תוכנית בסיסית מחקר המדע באמצעות קרן המחקר הלאומי של קוריאה (NRF) ממומן על ידי משרד החינוך (2017R1D1A3B03035662); הקרן לחקר האוניברסיטה, 2017 (HRF-201703-003).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| צינור חרוטי 15 מ"ל | SPL Life Sciences | 50015 | |
| צלחת 24 בארות | Thermo Scientific | 142475 | |
| 50 מ"ל צינור חרוטי | SPL Life Sciences | 50050 | |
| צלחת 6 בארות | Falcon | 353046 | |
| 6x צבע טעינת DNA | Real Biotech Corporation | RD006 | 1 מ"ל |
| רצועת 8 כובעים | מיושם ביוסיסטמס | N8010535 לסינתזת cDNA | |
| רצועת 8 צינורות | יישומי ביוסיסטמס | N8010580 | לסינתזת cDNA |
| צלחת 96 בארות | פלקון | 353072 | |
| חומצה אצטית | סיגמא | A6283-1L | 1 ליטר |
| אגרוז A | ביו בייסיק | D0012 | 500 גרם |
| פוספטאז אלקליין | ניו אינגלנד ביולאבס | M0290S | 10,000 U/mL |
| Ampicillin | Bio basic Canada Inc | AB0028 | 25 גרם |
| AriaMx 96 רצועות צינור | Agilent Technologies | 401493 | למערכת PCR בזמן אמת |
| AriaMx PCR בזמן אמת | Agilent Technologies | G8830A | qPCR הגברה, זיהוי וניתוח נתונים |
| AsiSI | New England Biolabs | R0630 | 10,000 יחידות/מ"ל |
| תאי CAPAN-1 | ATCC | HTB-79 | |
| קולט אדים לתרבית תאים | Labtech | דגם: LCB-1203B-A2 | |
| תאי ספירה עם V-slash | פול מרינפלד | 650010 | מונה תאים |
| מאגר CutSmart | ניו אינגלנד Biolabs | B7204S | 10X ריכוז |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | 500 מ"ל |
| Bionics | DN30200 | 200 | |
| הכנה סולם DNA | NIPPON Genetics EUROPE | MWD1 | 1 Kb סולם |
| DNase I | Invitrogen | 18068015 | 100 יחידות |
| בדיקת מדווח כפול לוציפראז | Promega | E1910 | 100 בדיקות |
| סרום בקר עוברי | Gibco | 26140-079 | 500 מ"ל |
| HIT תאים מוכשרים | Real Biotech Corporation (RBC) | RH617 | תאים מוכשרים |
| תאי HPNE | ATCC | CRL-4023 | |
| LB מרק אגר | ביו בייסיק | SD7003 | 250 גרם |
| ליפופקטמין 2000 | Invitrogen | 11668-027 | 0.75 מ"ל |
| ליפופקטמין RNAiMax | Invitrogen | 13778-075 | 0.75 מ"ל |
| לומינומטר | פרומגה | דגם: E5311 | |
| צינור מיקרוצנטריפוגה | Eppendorf | 22431021 | |
| קורא מיקרופלייט | TECAN | אינסופי F50 | |
| miRNA בקרת חיקוי | אמביון | 4464058 | 5 nmole |
| miRNA-107 חיקוי | אמביון | 4464066 | 5 nmole |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 50 prep | |
| Mupid-2plus (מערכת אלקטרופורזה) | TaKaRa | דגם: AD110 | |
| NotI | ניו אינגלנד Biolabs | R3189 | 20,000 יחידות/מ"ל |
| תוכנית סייר Oligo | GeneLink | לעיצוב פריימר | |
| מכסי רצועות צינור אופטי (רצועה 8x) | Agilent Technologies | 401425 | לזמן אמת PCR |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | 500 מ"ל |
| תאי PANC-1 | ATCC | CRL-1469 | |
| פניצילין/סטרפטומיצין | Gibco | 15140-122 | 100 מ"ל |
| מאגר פוספט מלח | Gibco | 14040117 | 1000 מ"ל |
| פלסמיד DNA miniprep S& V kit | Bionics | DN10200 | 200 prep |
| PrimeSTAR GXL DNA פולימראז | TaKaRa | R050A | 250 יחידות |
| שייקר | TECAN | טלטול פלטפורמת | |
| טלטול חממה | Labtech | דגם: LSI-3016A | |
| Sigmaplot 14 תוכנה | Systat תוכנה בע"מ | עבור מינון-תגובה עקומת דור | |
| Sulforhodamine B אבקה | Sigma | S1402-5G | 5 גרם |
| SYBR תערובת מאסטר ירוקה | Smobio | TQ12001805401-3 | צבע פלואורסצנטי מחייב עבור dsDNA |
| T4 DNA ligase | TaKaRa | 2011A | 25,000 U |
| TaqMan master mix | Applied Biosystems | 4324018 | 200 תגובות, ללא AmpErase |
| UNG TaqMan בדיקת microRNA (has-miR-107) | Applied Biosystems | 4427975 | מזהה בדיקה: 000443 (50RT, 150 PCR rxns) |
| בדיקת TaqMan microRNA (has-miR-301) | Applied Biosystems | 4427975 | מזהה בדיקה: 000528 (50RT, 150 PCR rxns) |
| ערכת TaqMan miR RT | Applied Biosystems | 4366597 | 1,000 תגובות |
| חממת Thermo CO2 (BB15) | ThermoFisher Scientific | 37 ° C ו-5% CO2 דגירה | |
| חומצה טריכלורואצטית | סיגמא | 91228-100G | 100 גרם |
| בסיס Trizma | Sigma | T4661-100G | 100 גרם |
| מים טהורים | במיוחד Invitrogen | 10977-015 | 500 מ"ל |
| Veriti 96 באר תרמית מחזור יישומי | ביו-מערכות | להגברה של DNA (או cDNA) | |
| XhoI | New England Biolabs | R0146 | 20,000 יחידות/מ"ל |
מקורות
- He, L., Hannon, G. J. MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation. Nature Reviews Genetics. 5 (7), 522-531 (2004).
- Park, J. K., Doseff, A. I., Schmittgen, T. D. MicroRNAs Targeting Caspase-3 and -7 in PANC-1 Cells. International Journal of Mole....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
