Method Article

בידוד וקוונפיקציה של וירוס Zika ממספר איברים בעכבר

DOI:

10.3791/59632

⸱

August 15th, 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Microbiology and Immunology, Saint Louis University, 2School of Veterinary Medicine University of California Davis

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המטרה של הפרוטוקול היא להדגים את הטכניקות המשמשות לחקירת מחלה נגיפית על ידי בידוד וכימות וירוס Zika, מאיברים מרובים בעכבר לאחר ההדבקה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיטות המוצגות להפגין נוהלי מעבדה לבידוד איברים מבעלי חיים נגועים בנגיף Zika והקוונפיקציה של עומס ויראלי. מטרת ההליך היא לכמת מגדל נגיפי באזורים היקפיים ו-cn של העכבר בנקודות זמן שונות לכתוב זיהום או בתנאים ניסיוניים שונים כדי לזהות virologic גורמים אימונולוגיים המסדירים זיהום וירוס zika. הליכי בידוד האיברים הפגינו לאפשר שני מיקוד היווצרות הקוונפיקציה והערכת ה-PCR הכמותי של titers ויראלי. טכניקות בידוד איברים מהירה נועדו לשימור titer וירוס. כימות ויראלי על ידי מיקוד היווצרות היכולת מאפשר הערכה תפוקה מהירה של וירוס Zika. היתרון של ההתמקדות ביצירת מיקוד הוא הערכה של וירוס זיהומיות, המגבלה של היכולת הזאת היא הפוטנציאל רעילות איברים לצמצם את מגבלת הזיהוי. הערכת סיכוייו ויראלי משולב עם PCR כמותי, באמצעות רקומביננטי RNA העתק שליטה הגנום ויראלי מספר בתוך האיבר מוערך עם מגבלה נמוכה של זיהוי. באופן כללי טכניקות אלה מספקים שיטת תפוקה מדויקת במהירות גבוהה לניתוח של מגדל ויראלי בפריפריה ו-cn של בעלי חיים נגועים בווירוס zika והוא יכול להיות מיושם על הערכה של מגדל נגיפי באיברים של בעלי חיים נגועים ביותר פתוגנים, כולל נגיף דנגה.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

וירוס zika (zika) הוא מועבר השייכת המשפחה הפלחיות, אשר כולל פתוגנים אנושיים האנושית חשוב כגון powassan וירוס (powv), וירוס המוח היפני (jev), ומערב הנילוס וירוס (wnv)1. בעקבות בידוד וזיהוי, היו דיווחים תקופתיים על זיהומים zikv האדם באפריקה ואסיה2,3,4,5, ו מגיפות בתוך מרכז ודרום אמריקה (נבדקו ב הפניה6). עם זאת, לא היה עד לאחרונה כי ZIKV נחשב לגרום למחלה חמורה7. עכשיו יש אלפי מקרים של מחלות נוירולוגיות ופגמים בלידה מקושרים עם זיהומים ZIKV. הופעתה המהירה של ZIKV הונחה שאלות רבות הנוגעות: מדוע יש עלייה בחומרת המחלה, מהי התגובה החיסונית לזיהום ZIKV והם שם נגיפי ו/או הפתווגיות החיסונית מקושרים לעלייה נוירולוגית ביטויים ופגמים בלידה. עכשיו יש למהר להבין את מערכת העצבים המרכזית (cn) מחלה קשורה הקשורים ל-zikv, כמו גם את הצורך לבדוק במהירות את היעילות של נוגדנים וחיסונים נגד zikv. זה נגד הרקע הזה שפיתחנו שיטות לניתוח מהיר של zikv מגדל בפריפריה ו-cn באמצעות המוקד הספציפי zikv ליצור באמצעות בחני (ffa).

מודלים בעלי חיים קטנים חשובים להבנת התקדמות המחלה ולהערכה מוקדמת של חיסונים, therapeutics ואנטי ויראליים. הקמנו מודלים בעלי חיים קטנים לחקר מחלות מועבר באמצעות זנים שונים של העכבר כדי לדגמן זיהום האדם הגנה מפני פתוגנים נגיפי8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. באמצעות הניסיון הקודם הזה, התחלנו לשנות טכניקות המשמשות להערכת של wnv ו דנגה וירוס, flavivirus הקשורים להערכת zikv סיכוייו בשני איברים היקפיים, כמו גם את ה-cn21,23, 24. היתרונות של שיטות אלה בעלי האמצעים האחרים הם: 1) שהם משלבים את היכולת לקצור הן את אברי הפריפריה והן את איברי ה-cn לניתוח; 2) השיטות הן להתאמה עבור cy, להזרים לזרום, עבור מדידות של תגובות החיסונית מולדים מסתגלת, יחד עם מגדל נגיפי על אותה חיה באותו איבר; 3) טכניקת הקציר ניתנת להתאמה לניתוח היסטולוגית; 4) zikv ffa היא שיטת תפוקה גבוהה מהירה עבור ניתוח סיכוייו ויראלי; ו-5) שיטות אלה ניתן להחיל על הערכה של מגדל נגיפי באברי בעלי חיים נגועים ברוב פתוגנים25.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים של המחקר הנוכחי הם בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת סנט לואיס. מחש הוא מוכר לחלוטין על ידי האגודה להערכת והסמכה של טיפול בבעלי חיים המעבדה הבינלאומי (AAALAC).

1. בידוד איברים

הערה: הווירוס אינו יציב בטמפרטורת החדר (RT) כך מספר בעלי החיים שנקטפו בזמן אחד חייב להיות מתוכנן בקפידה כדי לשמר את titers ויראלי.

  1. להדביק עכברים באמצעות המינון הנבחר ומסלול, מבוסס על פנוטיפ נדרש. עבור פרוטוקול זה, להדביק 8-10 שבוע בן זכר ונקבה סוג אני אינטרפרון קולטן לקוי (Ifnar1-/-) C57BL/6 עכברים.
    1. לIfnar1-/- עכברים עם קוקטייל של קטמין (90 מ"ג/ק"ג) ו-Xylazine (10 מ"ג/ק"ג). בדיקת הרפלקס של הדוושה על ידי. הבוהן בחוזקה כדי לאשר הרדמה מנהל 1 x 105 מיקוד ויוצרים יחידות (ffu) של zikv ב 50 μl תת-עורי (SC) באמצעות footpad.
  2. הכינו את כל החומרים הדרושים לקציר ביום שלפני: 2 מספריים, מלקחיים ו-20 מ ל של 70% אתנול (אטוח) ב-50 מ ל חרוטי לחיטוי של כלים.
    1. הכנת מזרקים ומחטים: מזרק 20 מ ל עבור perfusion, 23 מחטים G (כ 1 לכל כלוב) ו 1 מזרק mL עם המחט 25 G (1 לכל 3-5 עכבר). לפני צינורות שקילה, להוסיף חרוזי פלדה (בכיפה) כדי 1.5 mL O-ring בורג צינורות כובע (אחד עבור כל איבר). הצינורות צריכים להיות מתאימים. לצורך הומוגון
  3. להכין את היום של הקציר את החומרים הדרושים הפרזיה והאיבר קופא.
    1. ממלאים דלי קרח עם קרח יבש ו70% אטוח לעשות אמבטיית קרח. להכין מלוחים סטרילית מאגור פוספט (pbs) בהנחה כי 25-30 mL לכל עכבר של PBS עבור כל זלוף נדרש 5-10 mL עבור חוט השדרה). להשיג הרדמה, קוקטייל של קטמין ו Xylazine, ולהניח 300 μL לכל עכבר. מניחים את כל החומרים וכל הצינורות הנוספים הדרושים להזרמת cy, וכו ', במיכל משני כדי להעביר למתקן החי.
  4. בצע את כל ההליכים הדרושים עבור כניסה כולל עוטה וציוד הגנה אישית במהלך הכניסה והיציאה לתוך מתקן בעלי חיים.
    זהירות: כל ההליכים הם להתבצע בקבינט אבטחה טיחות מוסמך בתוך מתקן אבטחה טיחות ברמה 2 (bsl-2) מעבדה.
  5. מנהל הרדמה, 200-500 μL, intraperitoneally בהתאם לגודל ולמשקל של בעל החיים. אם עובדים לבד, לנהל הרדמה לחיה אחת בכל פעם כדי למנוע הריגת בעלי חיים לפני הקציר איברים.
    1. לאשר מינון הרדמה על ידי הבוהן צובט עם מלקחיים כדי להעריך את רפלקס הדוושה. אל תמשיך מבלי להגיב לחלוטין. השתמש פינים כדי לאבטח את העכבר על לוח שעווה. בשלב זה, לאש את העכבר ב 70% אתנול כדי למנוע זיהום שיער בהליך הקציר האיברים
  6. דימום סופני. ע י ניקוב לב
    1. באמצעות מספריים ומלקחיים, לפתוח את החיה דרך חלל החזה כדי לחשוף את הלב. לאסוף דם באמצעות ניקוב לב (~ 800 μl), זה יכול לשמש עבור מספר בחני כולל כימיה קלינית, המטולוגיה, הזרימה cy, לנסות לזהות תגובות אנטיגן ספציפיים, ו-pcr בזמן אמת כמותי (רביעיית pcr) עבור ניתוח של מספר עותק ויראלי.
    2. עבור ניתוח רנ א נגיפי על ידי רביעיית ה-PCR, לאסוף דם בצינור EDTA אם מחלץ דם שלם או בצינור מיקרוצנטריפוגה אם מחלץ מן הנסיוב. (עבור סרום, שפופרת ספין במהירות מקסימלית בצנטריפוגה, טמפרטורת החדר, עבור 20 דקות ולהסיר סרום לצינור נפרד). הוסף פוליאקרילמיד ליניארי כנשא לדגימת הסרום לאחר הגימור. RNA לאחר מכן ניתן לנתח או לאחסן ב-80 ° צ' לתהליך נוסף במועד מאוחר יותר.
  7. מלא את מזרק 20 מ ל עם PBS, בטמפרטורת החדר (או 37 ° c), ועכברים מבשם החדרת מחט פרפר לתוך החדר השמאלי. נקב באטריום הימני כדי לאפשר לדם ו-PBS לצאת. בזמן שהוא בודק את צבע הכבד. כדי לוודא שהחיה מלאה הכבד צריך להשתנות מאדום עמוק לתוך צבע סלמון ורוד.
    1. אם הכנת את האיברים עבור היסטולוגיה, להשאיר מחט פרפר במקום ולאחר מכן עם 20 מ ל של קרח קר 4% פאראפורמלדהיד. אם כן, זה נוח לקבל את המזרק מחובר הפסקות 3-כיוון עם שני מזרקים מחובר אליו, הפעלת השסתום על וכיבוי כחלופות אחת בין PBS ו-למעלה.
  8. לקצור איברים לתוך מתויג, צינורות שקלו. עבור איברים היקפיים, בצע הזמנה הוקמה עבור הקציר: כבד, טחול, כליה וריאות.
    1. קח רק אונה אחת מן הכבד; זה לא משנה איזה אחד, אבל עבור כל הניסויים תמיד לנסות לקחת את אותה האונה עם החלק בגודל זהה. באופן דומה, עבור כליות וריאות, לקחת את אותה כליה וריאה. אם הזרימה cy, try הוא גם להסתיים, כל איבר ניתן לגזור לחצי. לאחסן את החצי כדי לשמש cy, try במרכז הזיכרון של רוזוול פארק בינוני (RPMI) בטמפרטורת החדר עד הקציר הושלמה.
    2. מיד לאחר הקציר, לשים כל איבר בצינור שכותרתו ומקום באמבט קרח יבש. סיכוייו וירוס מפחית לאורך זמן בטמפרטורת החדר, כך את כמות הזמן שלוקח היבול איברים חשוב מאוד. יש להיות עקביות בין עכברים, כך שלאחר הבטיחות, העדיפות הבאה היא מהירות.
      הערה: אם קצירת איברים עבור הטיטרים ויראליים, זה מאוד מועיל יש לקצור את האדם השני המוח בשלב זה, כדי לשמר את הטיטרים ויראליים.
  9. הסירו את האיברים הנותרים מחלל הגוף של העכבר כדי לקבל גישה לעמוד השדרה ולגולגולת.
    1. להסיר את העכבר מהלוח ולהסיר את הפרווה, ואחריו הסרת הזרועות והרגליים.
      להסיר את ראשו של העכבר עם עריפת ראש, מספריים בוטה או כירורגי כדי לקצור את המוח על ידי חיתוך הגולגולת עם מספריים לגראנז ' משונן דרך מגנום foramen. ואז, לקלף את הגולגולת עם מלקחיים ולהוציא את המוח עם מרית.
    2. באמצעות מספריים חזקים, בעלי מספרים, להסיר את הצלעות ועצמות אחרות סביב עמוד השדרה. ואז, חותכים את עצם האגן, חושפים. את החוליות ברמה המותני הקצה הקטן של חוט השדרה צריך להיות גלוי בשלב זה.
    3. השתמש במזרק 10 מ ל ממולא ב-PBS ובמחט של 18 גרם כדי לגרש את חוט השדרה על-ידי "שטיפה" חוט מהמותניים לעמוד השדרה הצווארי על צלחת פטרי.
    4. בזהירות, במקום קצה משופע של המחט בתוך החוליה החוליות, הימנעות לחץ מוגזם כדי למנוע את המחט כדי להסיג את הגוף החוליות. החזיקו חזק כדי להפעיל לחץ על הגוף החוליות ועל המחט ולחץ על המזרק כדי לגרש את החוט. העבר מיד את חוט השדרה בצינור שכותרתו ומקום באמבט קרח יבש.
  10. חזור על הנוהל עם כל החיות עד שהקציר יושלם. מניחים את כלי הקציר ב-70% אתנול בין בעלי חיים. . תתמקד בעקביות ובמהירות משך הזמן בין הקציר כל איבר צריך להישאר עקבי כדי לא הטיה תוצאות סיכוייו ויראלי.
  11. כשתסיים, חטא את הקבינט הביובטיליטי ואת כל החומר לפני הסרתם ממתקן החי.
  12. להסיר כל צינור מאמבט קרח ושוקל צינורות כדי לקבוע משקל איברים. כדי לקבוע את משקל האיברים, הפחת את משקל הצינורית הריקה ממשקלו של האיבר המכיל צינורית.
    הערה: בשלב זה האיברים יכולים להיות קפואים ב-80 ° צ' לתהליך נוסף במועד מאוחר יותר או איברים יכולים להיות הומוגניים מיד לפני הקפאת בעלי הערך הבודדים. הקפאת דגימות מספר פעמים מקטין titer נגיפי. לכן, חשוב לעשות את אותו תהליך עבור כל הניסויים בתוך פרוייקט אחד.

2. איבר הומוזציה

  1. להכין 3 תווית, 1.5 mL snap-הכתיר צינורות עבור כל איבר להיות הומוגניים.
  2. אם הדגימות אינן הומוגניים מיד לאחר הקטיף, הסירו את הצינורות מ-80 ° c. הדגימות אינן צריכות להיות מופשרים לצורך הומוגון.
  3. לשים את הדגימות על קרח כדי לשמור אותם קר כדי למזער את ההפסד סיכוייו נגיפי. לאחר מכן, להוסיף 1 מ ל של DMEM קר המכיל 5% FBS לכל איבר המכיל צינור.
  4. מיד להכות צינורות במקצף חרוזים על פי הוראות היצרן. הומוגון כל האברים בעלי חרוזי פלדה בכלי הומוגניזציה. ודא שכל איבר הינו הומוגניים לחלוטין.
  5. ספין למטה האיברים בmicrofuge ב 12,000 x g עבור 5 דקות microfuge כי כבר מקורר ל 8 ° c. ואז להחזיר את הצינורות. לדלי הקרח בארון הביובטיל, הדגימה. לצינורות בשביל הצורך ואז להחזיר את הצינורות. לדלי הקרח
  6. עבור שיטת המיקוד היווצרות, סדרת מחלקים 500 μl לתוך צינור שכותרתו. ואז למקם צינורות במתלה על דלי קרח. Aliquot 50 μL לתוך צינור עבור RNA עבור fluorogenic כמותית-PCR (רביעיית ה-PCR) כדי למדוד מספר להעתיק הגנום ויראלי.
  7. בודד RNA סה כ מאברי החיות הנגועות באמצעות ערכת בידוד RNA מסחרית. לקבוע flavivirus ויראלי RNA באמצעות בדיקה פריימר מגדיר ספציפי עבור ZIKV, אשר מזהה רצפים ייחודיים כל הגנום flavivirus. לקבוע מספר העתק נגיפי באמצעות בקרת העתק המכיל משתמש חיובי שהוגדר ליחיד רנ א שנוצר בתוך חוץ גופית באמצעות T7 פולימראז המכיל את רצפי היעד ZIKV.
  8. מקטע את המדגם הנותר, שהוא כ 300 μL, לתוך השפופרת השלישית ולאחסן ב-80 ° צ' במידת הצורך.
    הערה: אם הדגימות לא קפאו קודם לכן, הקפא ב-80 ° c. אם הדגימות היו קפואות קודם לכן, המשיכו למקד את המיקוד ו/או בידוד ה-RNA לפני העצירה.

3. שיטת וירוס zika ויוצרים מיקוד26

הערה: חשוב לכלול לא בקרת וירוסים ושליטה חיובית. השליטה החיובית היא סדרת דילול של מלאי וירוס עם ריכוז ידוע. לא כל הפקדים צריכים להיות על אותה צלחת, אבל ככל שהקביעה הופכת לגדולה מ-5 צלחות, יש להוסיף פקדים נוספים, ולהתפשט בין צלחות. לדאוג לא לשרוט את המונאולייר עם עצות pipet או על ידי כביסה נמרצת. ניתן לסדר איברים מרובים באותו יום או בימים שונים. אבל איבר בודד לא צריך להיות שעבר מספר ימים, כי תנאי שונות שונים יכולים להשפיע titered נגיפי. מומלץ מאוד להריץ איבר בודד ביום אחד.

  1. לפני יום התעליה, הכינו את התאים והחומרים הדרושים להתמקדות בצורה היוצרת.
    1. הכינו מדיית צמיחה המכילה 500 מ ל של DMEM עם 5 מ ל של HEPES ו -25 מ ל של FBS. יש את התאים הצומחים בתאי הבריאות (מי) הגדלים במדיית הגדילה ב-37 ° c, 5% CO2 לפני תחילת השיטת האחסון. התאים של ברו לא אמורים להיות מעבר גבוה או שגדלו אי פעם במשך 100% שליטה לפני תחילת השיטת הפתיחה.
    2. הכינו 500 mL של 2% מתילתאית פתרון על ידי אוטוקלינג a 1 בקבוק מדיה זכוכית עם 10 גרם של מתילצלולוזה בר מהומה גדול ובקבוק נפרד בקבוקי זכוכית ל-1 עם 500 mL של H2O. אם המים האוטומטיים התקררו מחדש במיקרוגל עד שהבקבוק חם למגע, אבל לא רותח.
    3. בעדינות יוצקים מים חמים/חמים לתוך בקבוק של מתילצלולוזה בעוד במכסה התרבות של הרקמה. בקבוק כובע חלקית ומערבבים על פלטת הפלטה עד מתילצלולוזה בתמיסה (1-4 h). מחלקים את 2% מתילצלולוזה פתרון לצינור 50 mL סטרילי. 2% מתילתאית ניתן לאחסן ב -4 ° צ' עד הצורך.
    4. הכינו 5% הפתרון פאראפורמלדהיד ב-PBS לתיקון צלחות והוא מאוחסן ב -4 ° צ' עד הצורך. להכין מוקד 1x ויוצרים מאגר שטיפת שוטף על ידי הוספת 0.05% טריטון X-100 ל PBS ומאוחסן ב RT. הכינו מאגר כתמים של 1x ffa על-ידי הוספת 1 מ"ג/mL סאפונין ל-PBS ומאוחסן ב -4 ° צ' עד הצורך. ניתן להכין אותם בשבועיים מראש.
  2. חשב את מספר הלוחות השטוחים 96 לוחות היטב הדרושים לצורך שיטת החישוב, כך שכל איבר מצופה בטרילקאט. כלול מספיק בארות נוספות עבור פקדים חיוביים ושליליים.
    1. גדל מספיק תאים של ברו במדיית הצמיחה כדי להשלים את השיטת העיצוב. טריזיסיזציה של התאים ברו ולספור אותם מחדש אותם ב 1.5 x 105 תאים לכל mL במדיית הצמיחה. לוחית ברו תאים ב 96 היטב שטוח לוחות התחתית ב 3.0 x 104 ברו-מי תאים/גם במדיית הצמיחה על ידי הוספת 200 μl לכל טוב.
    2. הצלחות דגירה ב 37 ° c ב 5% CO2 לילה, לוודא את הלוחות הם ברמה בחממה כך התאים מופצים באופן שווה בתוך הבאר.
      הערה: כל מעבדה מגדילה את תאי ברו באופן קצת שונה; המטרה היא 90-95% שוטפת מונאולייר בכל טוב ביום של השיטת וירוס Zika.
  3. מדלל את הנגיף ביום ההוא. אם דגימות האיברים היו הומוגניים בעבר, להסיר דגימות מ-80 ° c מקפיא ולאפשר להם להפשיר לפני הצבת דגימות על קרח עבור הצורך.
    1. על הקרח, להכין בתחתית עגולה 96 צלחת הבאר על ידי הוספת 180 μL של מדיית צמיחה קרה לשורות B דרך H עוזב שורה ריק. הוסף 150 μL של כל דגימת איבר הומוגניים לשורה A של לוחית התחתונה העגולה.
    2. הכינו דילול של 10 מקפלים הסידוריים של כל דוגמה, באמצעות הצינורות מרובת ערוצים. לדלל דגימות בתחתית עגול 96 צלחת הבאר על ידי הוספת 20 μL של מדגם לתוך 180 μL של מדיית הצמיחה, שינוי עצות הצינורות בין דילול כל.
  4. להכין את המיקוד להרכיב צלחת על ידי הסרת התקשורת מן השטוח התחתון 96 צלחת היטב המכסה תאים ורו. עשה זאת מיד לפני הוספת דגימות וירוס כדי למנוע את המונאולייר מייבוש.
    1. הוסף 100 μL של הווירוס דילול כל טוב בצלחת ברו. הוסף דגימה באמצעות אותה ערכת עצות על-ידי הליכה מן הנמוך ביותר לריכוז הגבוה ביותר. צלחות סלע זה לצד 2-4 פעמים להיות זהירים לא למערבולת.
    2. דגירה ב 37 ° c, 5% CO2 עבור 1-2 h. ודא שלוחות הם ברמה בתוך החממה. במהלך הדגירה לחמם 2% מתילתאית ל RT.
    3. לדלל 2% מתילתאית פתרון במדיית הצמיחה. הדילול צריך להיות ביחס של כ 2:1 של 2% מתילתאית למדיית הצמיחה. שמור על טמפרטורת החדר עד שיגיע הזמן להשתמש בו. להוסיף 1-2 טיפות/גם (להגדיר את pipet כדי 125 μL) של מתילתאית: מדיית הצמיחה לכל טוב של הצלחת 96 הבאר.
    4. דגירה 32-40 h ב 37 ° צ', 5% CO2. כמו התאים של כולם לצמוח מעט שונה וגורמים כולל השטף התא והזן של וירוס Zika יכול לשנות את זמן הדגירה.
  5. לתקן את התאים ברו באמצעות הכין 5% הפתרון פאראמפורמלדהיד.
    1. הוסף 50 μL של 5% פאראפורמלדהיד לכל טוב מעל החלק העליון של שכבת מתילתאית בארון בטיחות. דגירה עבור 60 דקות ב RT. התיקון יכול ללכת ללון ב -4 ° c אבל לכסות את הצלחת עם parafilm להפחית את האידוי.
    2. כיסוי והמדיה של התאים לתוך מיכל הסילוק בתוך הקבינט אבטחה טיחות. רחץ בעדינות עם PBS, 150 μL/ובכן. להסיר PBS מן הצלחות ולהסיר את הצלחת מ BSL-2.
    3. חזור על שטיפת PBS 2x הוספת 150 μL/ובכן. . אז תסיר את הערוץ הPBS הוסף 150 μL/טוב 1x FFA לשטוף את המאגר ולתת לשבת 5-10 דקות ב-RT כדי לחלחל את התאים הקבועים.
  6. לזהות זיהום באמצעות נוגדן Zika העיקרי. הכן את הנוגדן העיקרי 4G2 (D1-4G2-4-15) בריכוז של 1 מ"ג/mL במאגר מכתים FFA. הכינו נוגדן מספיק. לכל העניין
    הערה: התרחקו מחיתולי מעבדה או חומר סופג גבוה אחרים כמו סיבים יהיה שלילי להשפיע על הדמיה של foci.
    1. הסרת מאגר שטיפת FFA מהלוחות. הוסף 50 μL/באר של הנוגדן העיקרי במאגר הצביעת FFA. לאטום את הצלחות עם parafilm ו הדגירה לילה ב 4 ° c על פלטפורמת נדנדה. ניתן לבצע את העבודה באמצעות דגירה עבור 2 h ב RT.
  7. להמחיש את הזיהום על ידי תוספת של משני HRP נוגדן מצועם. הכן את הנוגדן המשני אנטי עכבר התווית HRP בריכוז של 1:5000 ב FFA מכתים מאגר. הכינו נוגדן מספיק. לכל העניין
    1. לשטוף את התאים 3x עם מאגר לשטוף FFA, הסרת מאגר לשטוף ידי מצליף לתוך הכיור בכל פעם. כתם את התאים עם הנוגדן המשני במאגר מכתים FFA ב 50 μL/ובכן. מודב 1-2 h בשעה RT.
    2. לשטוף את התאים 3x עם מאגר לשטוף FFA, הסרת מאגר לשטוף ידי מצליף לתוך הכיור בכל פעם. להוסיף 50 μL/טוב של המצע Trueblue.
    3. צפה הצלחות בזהירות, מחכה 2-15 דקות עד הנקודות מוגדרות במלואו ורקע מינימלי. לאחר שהנקודות גלויות, רוחצים בעדינות את המים בעזרת יד כדי להגן על המונאולייר מכוח המים הזורמים. ברז יבש על מגבות נייר (לא חיתולים) ותמונה בהקדם האפשרי.
    4. ניתן לספור כתמים באופן ידני או באמצעות מונה ספוט אוטומטי. אם נספר באופן ידני, ניתן להשתמש בטווח מבתר כדי לסייע בהדמיה.
    5. עבור כל דוגמה, בחר דילול עם וקדי בקלות מכובד (למשל, 20 כדי 200 לכל טוב) ולחשב סיכוייו ב-מיקוד היחידות ל-mL (ffu/ml), באמצעות הממוצע של בארות כפולות: ffu/ml = (ממוצע וקדי/טוב) × (לדילול) ÷ (ml).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי להעריך את zikv מגדל באמצעות הפרוטוקול המתואר לעיל Ifnar1-/- עכברים נדבקו zikv (PRVABC59) באמצעות תת עורית (SC) הזרקה כדי footpad. כאן, המינהל של 1 x 105 ffu של zikv כדי 8-12 בן שבוע Ifnar1-/- עכברים SC הוא לא קטלני, אבל הווירוס יכול לשכפל הן בפריפריה והן ב-cn. מינון זה ותוואי משמשים לחקר הפתוגן מארחים תגובות החיסון הפתוגניות. ניהול של 1 x 105 ffu של zikv ל 8-12 הישן בשבוע Ifnar1 -/- עכבר הזרקת (IV) ההז...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זיהום zikv יכול לגרום למחלה נוירולוגית ולכן מודלים בעלי חיים הנוכחי כדי ללמוד פתוגנזה, תגובות החיסון ויעילות הגנה של חיסונים נוגדנים צריך להתמקד בשליטה ויראלי בתוך ה-cn. אחד האתגרים בהתמקדות במחלת ה-CN הוא כי לעתים קרובות מגיע על חשבון לימוד זיהום היקפי. שיטות בידוד האיברים המוצעים כאן מתמקד בצורך להעריך במהירות את הזיהום ZIKV בפריפריה וגם את ה-CN כדי להעריך את מחלת ה-CN בתיווך ZIKV הקשורים ולהקים מודל עבור בדיקות טרום קליני של antivirals, טיפולית חיסונים. יתרון נוסף של טכניקה זו הוא שהוא גם מאפשר מידה גבוהה של גמישות, כ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ד ר פינטו ממומנת על ידי מענק זרע מאוניברסיטת סנט לואיס הספר לרפואה וכספים אתחול מאוניברסיטת סנט לואיס הספר לרפואה. ד ר Brien ממומן על ידי פרס החוקר המוקדם K22AI104794 מ-NIH NIAID כמו גם מענק זרע מבית הספר סנט לואיס אוניברסיטת. לכל האנשים הממומנים לא היה כל תפקיד בעיצוב הלמידה, איסוף נתונים וניתוח, החלטה לפרסם או הכנת כתב היד.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1-bromo-3-chloropropane (BCP)גן MRCBP151
מזרק 10 סמ"קThermo Fisher ScientificBD 309642
18 גרם מחטThermo Fisher Scientific22-557-145
מזרק 1 סמ"ק TB ThermoFisher Scientific14-823-16H
מזרק 20 סמ"קThermo Fisher Scientific05-561-66
24 חרוזי צינורThermo Fisher Scientific15 340 163
3.2 מ"מ חרוזי נירוסטהThermo Fisher ScientificNC9084634
37 ° חממת תרבית רקמותC Nuair5800
4G2 נוגדןבבית
96 צלחות תחתונות שטוחות היטבMidsciTP92696
96 צלחות תחתונות עגולות היטבMidsciTP92697
Basix 1.5 מ"ל צינורות אפנדורףThermo Fisher Scientific02-682-002
אקונומיקה קוטלי חיידקים מרוכזים30966CT
CTL S6 מנתחCTL CTL S6 מנתח
מספריים חיתוך מעוקליםכלי מדע עדינים14061-11
Dulbecco' s Modified Eagle' s בינוני - גלוקוז גבוה עם 4,500 מ"ג/ליטר גלוקוזMilliporeSigmaD5671
אתנול (בדרגה ביולוגיה מולקולרית)MilliporeSigmae7023
סרום בקר עובריMilliporeSigmaF0926-500ML
מלקחייםFine Science Tools11036-20
חומצה אצטית קרחוניתMilliporeSigma537020
עז נוגדן נגד עכבר בעל תווית HRPMilliporeSigma8924
HEPES 1 MMilliporeSigmaH3537-100ML
איזופרופנול (בדרגה ביולוגיה מולקולרית)MilliporeSigmaI9516
קוקטייל קטמין/קסילזיןרפואה
L-גלוטמיןMilliporeSigmag7513
Magmax RNA ערכת טיהורThermo Fisher ScientificAM1830
MethylcelluloseMilliporeSigmaM0512
מיקרוצנטריפוגהEpendorf5424R
MiniCollect 0.5 מ"ל צינורות EDTABio-one450480
צינורות טבעת ThermoFisher Scientific21-403-195
צעד אחד Q RT-PCR mixThermo Fisher Scientific4392938
ParaformaldehydeThermo Fisher ScientificEMS- 15713-S
פוספט חוצץ מלחMilliporeSigmad8537-500 מ"ל
פרולין פיפטות רב ערוציותSartorius72230/72240
פרולין פיפטות חד ערוציותSartorius728230
RNAse מיםללא תרמו פישר סיינטיפיק10-977-023
RNAzol BDMRC גןRB192
פלטפורמת נדנדהתרמו פישר סיינטיפיק11-676-333
RPMI 1640פישרMT10040CV
ספוניןמיליפורסיגמהs7900
כף/מריתכלי מדע עדינים10090-17
ישר מספריים חיתוךFine Science Tools14060-11
Triton X-100MilliporeSigmat8787
מצע כחול אמיתיVWR95059-168
TrypsinMilliporeSigmaT3924-100ML
סיכותאוניברסליהשוואתית

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lazear, H. M., Diamond, M. S. Zika Virus: New Clinical Syndromes and Its Emergence in the Western Hemisphere. Journal of Virology. 90 (10), 4864-4875 (2016).
  2. Simpson, D. I. Zika Virus Infection in Man. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 58, 335-338 (1964).
  3. Fagbami, A. Epidemiological investigations on arbovirus infections at Igbo-Ora, Nigeria. Tropical and Geographical Medicine. 29 (2), 187-191 (1977).
  4. McCrae, A. W., Kirya, B. G. Yellow fever and Zika virus epizootics and enzootics in Uganda. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 76 (4), 552-562 (1982).
  5. Rodhain, F., et al. Arbovirus infections and viral haemorrhagic fevers in Uganda: a serological survey in Karamoja district, 1984. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 83 (6), 851-854 (1984).
  6. Wikan, N., Smith, D. R. Zika virus: history of a newly emerging arbovirus. Lancet Infect Dis. 16 (7), e119-e126 (2016).
  7. Zika virus outbreaks in the Americas. The Weekly Epidemiological Record. 90 (45), 609-610 (2015).
  8. Brien, J. D. Immunological basis of age-related vulnerability to viral infection. , Oregon Health & Science University. (2007).
  9. Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Nikolich-Zugich, J. West Nile virus-specific CD4 T cells exhibit direct antiviral cytokine secretion and cytotoxicity and are sufficient for antiviral protection. Journal of Immunology. 181 (12), 8568-8575 (2008).
  10. Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Hirsch, A., Wiley, C. A., Nikolich-Zugich, J. Key role of T cell defects in age-related vulnerability to West Nile virus. Journal of Experimental Medicine. 206 (12), 2735-2745 (2009).
  11. Brien, J. D., et al. Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3. Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).
  12. Shrestha, B., et al. The development of therapeutic antibodies that neutralize homologous and heterologous genotypes of dengue virus type 1. PLoS Pathogens. 6 (4), e1000823(2010).
  13. Brien, J. D., et al. Interferon regulatory factor-1 (IRF-1) shapes both innate and CD8(+) T cell immune responses against West Nile virus infection. PLoS Pathogens. 7 (9), e1002230(2011).
  14. Pinto, A. K., et al. A temporal role of type I interferon signaling in CD8+ T cell maturation during acute West Nile virus infection. PLoS Pathogens. 7 (12), e1002407(2011).
  15. Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Current Protocols in Microbiology. 31, 11-15 (2013).
  16. Brien, J. D., et al. Protection by immunoglobulin dual-affinity retargeting antibodies against dengue virus. Journal of Virology. 87 (13), 7747-7753 (2013).
  17. Messaoudi, I., et al. Chikungunya virus infection results in higher and persistent viral replication in aged rhesus macaques due to defects in anti-viral immunity. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (7), e2343(2013).
  18. Pinto, A. K., et al. A hydrogen peroxide-inactivated virus vaccine elicits humoral and cellular immunity and protects against lethal West Nile virus infection in aged mice. Journal of Virology. 87 (4), 1926-1936 (2013).
  19. Sukupolvi-Petty, S., et al. Functional analysis of antibodies against dengue virus type 4 reveals strain-dependent epitope exposure that impacts neutralization and protection. Journal of Virology. 87 (16), 8826-8842 (2013).
  20. Pinto, A. K., et al. Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis. PLoS Pathogens. 10 (4), e1004086(2014).
  21. Pinto, A. K., et al. Defining New Therapeutics Using a More Immunocompetent Mouse Model of Antibody-Enhanced Dengue Virus Infection. MBio. 6 (5), (2015).
  22. Pinto, A. K., et al. Human and Murine IFIT1 Proteins Do Not Restrict Infection of Negative-Sense RNA Viruses of the Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, and Filoviridae Families. Journal of Virology. 89 (18), 9465-9476 (2015).
  23. Hassert, M., et al. CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection. PLoS Pathog. 14 (9), e1007237(2018).
  24. Pinto, A. K., et al. Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis. PLoS Pathog. 10 (4), e1004086(2014).
  25. Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Curr Protoc Microbiol. 31, (2013).
  26. Hassert, M., et al. CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection. PLoS Pathogens. 14 (9), e1007237(2018).
  27. Fuchs, A., Pinto, A. K., Schwaeble, W. J., Diamond, M. S. The lectin pathway of complement activation contributes to protection from West Nile virus infection. Virology. 412 (1), 101-109 (2011).
  28. Lazear, H. M., Pinto, A. K., Vogt, M. R., Gale, M., Diamond, M. S. Beta interferon controls West Nile virus infection and pathogenesis in mice. Journal of Virology. 85 (14), 7186-7194 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Zika Virus IsolationViral Titer QuantificationFocus Forming AssayQuantitative PCROrgan HarvestingSpinal Cord ExtractionViral Load AnalysisMouse Infection ModelFlavivirus DetectionViral Pathogenesis

Related Articles