Method Article

בניית פלסמידים CRISPR וזיהוי יעילות נוקאאוט בתאים יונקים באמצעות מערכת כתב לוציפראז כפול

DOI:

10.3791/59639

⸱

December 5th, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Qingdao Agricultural University, Qingdao, China, 2University of Cantabria, Santander y Torrelavega, Spain

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המתאר שיטה יעילה עבור הדור היעיל של פלסמידים המבטאים הן את אנזים CRISPR והן את RNA מדריך יחיד (sgRNAs). שיתוף פעולה של תאים יונקים עם וקטור sgRNA / CRISPR זה וקטור כתב לוציפראז כפול הבוחן תיקון הפסקה דו-גדילי מאפשר הערכה של יעילות נוקאאוט.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למרות יעיל מאוד, שינוי של אתר גנומי על ידי אנזים CRISPR דורש הדור של sgRNA ייחודי לאתרי היעד מראש. עבודה זו מתארת את הצעדים המרכזיים המובילים לבניית וקטורים SGRNA יעילים באמצעות אסטרטגיה המאפשרת זיהוי יעיל של המושבות החיוביות על ידי PCR לפני רצף DNA. מאחר שעריכת גנום יעילה באמצעות מערכת CRISPR דורשת SGRNA יעילה ביותר, יש צורך בבחירה מוקדמת של יעדי SGRNA של מועמדים כדי לחסוך זמן ומאמץ. מערכת כתב לוציפראז כפולה פותחה כדי להעריך יעילות נוקאאוט על ידי בדיקת תיקון לשבור גדיל כפול באמצעות חיתוק גדיל יחיד. כאן, אנו משתמשים במערכת הכתבים הזו כדי לאסוף את היעד המועדף של xCas9/sgRNA מקטורי SGRNA מועמדים לעריכת גנים ספציפיים. הפרוטוקול המתואר יספק וקטור אנזים sgRNA/CRISPR מועדף בתוך 10 ימים (החל מאוליגונוקלאוטידים מעוצבים כראוי).

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SGRNAs CRISPR מהווים רצף של 20 נוקלאוטידים (הפרוטו-ספייסר), המשלים את רצף היעד הגנומי1,2. למרות יעילות רבה, היכולת של מערכת CRISPR/Cas לשנות אתר גנומי נתון דורשת יצירת וקטור הנושא sgRNA יעיל ייחודי לאתרי היעד2. מאמר זה מתאר את השלבים המרכזיים בדור של וקטור sgRNA זה.

לעריכת גנום מוצלחת באמצעות מערכת CRISPR/Cas, השימוש sgRNAs יעיל מאוד הוא תנאימוקדםחיוני 3,4,5. מאז גרעין מהונדס המשמש בעריכת הגנום להפגין יעילות מגוונת ב lociממוקד שונים 1, בחירה מ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. עיצוב sgRNA אוליגונוקלאוטיד

  1. עיצוב sgRNAs באמצעות כלים מקוונים כגון הכלי המקוון Cas-Designer (http://www.rgenome.net/cas-designer/). רצף PAM חשוב בהתבסס על Cas9 בשימוש. עבור xCas9, רצפי PAM הרלוונטיים הם NG והתוחלת הכלי המקוון Cas-Designer לשעבר יכול ליצור xCas9 sgRNAs רלוונטי.
    1. השתמש בכלי עיצוב sgRNA המקיפים אלגוריתמים לחיזוי יעד (http://www.broadinstitute.org/rnai/public/analysis-tools/sgrna-design)11. ציון של 0.2 או יותר הוא מועדף.
  2. בחר עד 3 מטרות לעריכת גנים עבור הקרנה אופטימלית (לדוגמה, T1, T2 ו- T3 תוכננו עבור כבשים DKK2 exon 1 פילוח גנים [טבלה 1]).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיטות המתוארות בפרוטוקול זה הן לבניית וקטורים ביטוי sgRNA ו xCas9 ולאחר מכן עבור הקרנת אופטימיזציה של sgRNA אוליגוס עם יעילות מיקוד גנים גבוהה יחסית. כאן אנו מציגים דוגמה מייצגת של 3 מטרות sgRNA לכבשים DKK2 exon 1. SgRNA ו xCas9 לבטא וקטורים ניתן לבנות על ידי נטיעת עמוד השדרה וקטור (איור 2) ואחריו רצועה אותו בסדרה של שברי DNA קצר גדיל כפול באמצעות זוגות אוליגו annealing. המושבות החיוביות ניתן לזהות באמצעות זוגות פריימר ספציפיים מונחה PCR(איור 3). שבר D.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הליכי השיבוט הווקטור sgRNA שתיארנו כאן מקל על ייצור יעיל של sgRNAs, עם רוב העלויות הנגזרות הזמנת oligonucleotide ושורק וקטור. בעוד השיטה המתוארת נועדה לאפשר למשתמשים ליצור sgRNAs לשימוש עם CRISPR/Cas9, הפרוטוקול יכול בקלות להיות מותאם לשימוש עם Cas9 orthologues או אנדונוקלאות מונחה RNA אחרות כגון Cpf1, הצגת שינויים קלים עמוד השדרה הווקטורית רצפי תליית מוליגוניקלאוטיד.

הפרוטוקול המתואר לעיל יספק יעד sgRNA מועדף בתוך 10 ימים כאשר מתחיל עם oligonucleotides מעוצב כראוי. זה כולל את העיצוב sgRNA (1 .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרויקט זה מומן על ידי המחלקה הראשונה גראסלאנד מדע משמעת תוכנית של מחוז שאנדונג (סין), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (31301936, 31572383), הקרן המיוחדת למחקר אגרו-מדעי באינטרס הציבורי (201403071), הערכת סיכונים לאומית לפרויקט מיוחד של איכות ובטיחות של מוצרי חלב (GJFP201800804) ופרויקטים של מדע וטכנולוגיה של פרנסה של אנשי צ'ינגדאאו (19-6-1-68-nsh, 14-2-3-45-nsh, 13-1-3-88-nsh).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
דור חדש של מכשיר PCR שיפוע מסך מגע מלאLongGeneA200הגברת גן יעד
אנזימי הגבלת AscIניו אינגלנד BiolabsR0558Vחיתוך וקטורי מטרה
אנזים הגבלה BbsI ניואינגלנד BiolabsR0539Sחיתוך וקטורי מטרה
שולחן עבודה נקיAIRTECHSW-CJ-2FD/VS-1300L-Uמכשיר טיהור חלקי בצורת זרימה למינרית אנכית, היוצרת סביבת אוויר נקי מקומית גבוהה
DH5 ואלפא; תאים מוכשריםTaKaRaK613טרנספורמציה וקטורית פלסמיד
Dual-Luciferas Reporter Assay SystemPromegaE1910Dual-luciferas מדווח מבחן
אמבט מים תרמוסטטי חשמליSanfa Scientific InstrumentsDK-S24מגיב חימום על ידי טמפרטורה קבועה באמבט מים
אלקטרופורזהבייג'ינג Liuyi ביוטכנולוגיה ושות', בע"מDYY-6Cבקרת מתח, זרם וכו'.
Eppendorf Reference 2Eppendorf China Ltd.התייחסות 2צייר והעביר במדויק עקבות של
מנתח הדמיית ג'לBeijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.WD-9413Bלניתוח תמונות ג'ל אלקטרופורזה
GloMax 20/20 LuminometerPromegaE5311זיהוי פעילות לוציפראז כפולה במהירות
גבוההBMHsigma 3K15מיצוי וטיהור חומצות גרעין
חממה ביוכימית אינטליגנטיתSanfa Scientific InstrumentsSHP-160לספק סביבת טמפרטורה מתאימה לניסוי עיכול האנזים
LB Broth AgarSangon BiotechA507003-0250לגידול E.coli
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent KitThermo FisherL3000015DNA Transfection
SalI אנזימי הגבלה ניואינגלנד BiolabsR3138Vחיתוך וקטורי יעד
SanPrep עמודה DNA ג'ל ערכת מיצויSangon BiotechB518131-0050מיחזור שברי DNA
ערכת SanPrep Column Plasmid Mini-PrepsSangon BiotechB518191-0100מיצוי DNA פלסמיד
T4 DNA Ligaseניו אינגלנד BiolabsM0202Vקישור שבר DNA
TaKaRa MiniBEST ערכת טיהור שברי DNA Ver.4.0TaKaRa9761טיהור DNA
אנכי מעקר קיטור בלחץJIBIMEDLS-50LDטמפרטורה גבוהה וחיטוי להרוג חיידקים, פטריות ומיקרואורגניזמים אחרים בציוד מעבדה
תרמוסטט אמבט מיםChangzhou Guoyu Instrument Manufacturing Co., Ltd.SHZ-82תן לחיידקים להמשיך לרעוד, וזה טוב למגע עם אוויר.
נוזלי

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, H., et al. A surrogate reporter system for multiplexable evaluation of CRISPR/Cas9 in targeted mutagenesis. Scientific Reports. 8 (1), 1042(2018).
  2. Nageshwaran, S., et al. CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems.....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

CRISPR PlasmidssgRNA ConstructionDual Luciferase ReporterKnockout EfficiencyMammalian CellsxCas9 VectorBbs1 DigestionColony PCR ScreeningLuciferase AssayT7EI Assay

Related Articles