מאמר שיטה

שימוש במיקרוסקופיה של כוח אטומי למדידת תכונות מכניות ולחץ טורגור של תאים צמחיים ורקמות צמחים

11.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59674

⸱

15 ביולי 2019

 ,  , 
1SFR Biosciences, Université de Lyon, 2Laboratoire de Reproduction et Développement des Plantes, Université de Lyon, ENS de Lyon, UCBL, INRA, CNRS

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM), מופעל ככלי ננו ומיקרו לכניסה על תאים ורקמות. המכשיר מאפשר רכישת סימולטני של טופוגרפיה של פני השטח 3D של המדגם ואת התכונות המכאניות שלה, כולל קיר התא מודולוס של יאנג, כמו גם לחץ טורגור.

תקציר

אנו מציגים כאן את השימוש במיקרוסקופ כוח אטומי לכניסה רקמות הצמח ולשחזר את תכונותיו המכאניות. באמצעות שני מיקרוסקופים שונים במצב כניסה, אנו מראים כיצד למדוד מודול אלסטי ולהשתמש בו כדי להעריך תכונות מכניות של קיר התא. בנוסף, אנו גם מסבירים כיצד להעריך לחץ טורגור. היתרונות העיקריים של מיקרוסקופ הכוח האטומי הם שהוא לא פולשני, מהיר יחסית (5 ~ 20 דקות), וכי כמעט כל סוג של רקמת צמחים חיים שטוח באופן שטחי ניתן לנתח ללא צורך בטיפול. הרזולוציה יכולה להיות טובה מאוד, בהתאם לגודל הקצה ולמספר המידות לכל אזור יחידה. מגבלה אחת של שיטה זו היא שהיא מעניקה רק גישה ישירה לשכבת התא השטחית.

מבוא

מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) שייך מיקרוסקופ בדיקה סריקה (SPM) משפחה, שם טיפ עם רדיוס של בדרך כלל ננומטרים כמה סורקת את פני השטח של מדגם. גילוי משטח אינו מושג בשיטות אופטיות או באמצעות אלקטרון, אלא דרך כוחות האינטראקציה בין הקצה לבין משטח המדגם. לפיכך, טכניקה זו אינה מוגבלת לאפיון טופוגרפי של משטח לדוגמה (רזולוציה תלת-ממדית שיכולה לרדת לכמה ננומטר), אלא גם מאפשרת את המדידה של כל סוג של כוחות אינטרקציה כגון אלקטרוסטטית, ואן דר וואלס או כוחות מגע. יתר על כן, ניתן להשתמש בעצה כדי להחיל כוחות על פני השטח של דגימה ביולוגית ולמדוד את דפורמציה כתוצאה מכך, את מה שמכונה "כניסות", כדי לקבוע את תכונותיו המכאניות (למשל, מודולוס של יאנג, מאפיינים אלסטיים).

תכונות מכניות של קירות תא הצמח חיוניים להילקח בחשבון כאשר מנסים להבין מנגנונים בבסיס תהליכים התפתחותיים1,2,3. ואכן, מאפיינים אלה נשלטים באופן הדוק במהלך הפיתוח, במיוחד מאחר שריכוך הקירות התאי נדרש כדי לאפשר לתאים לצמוח. AFM יכול לשמש כדי למדוד מאפיינים אלה וללמוד את האופן שבו הם משתנים בין איברים, רקמות או שלבים התפתחותיים.

במאמר זה, אנו מתארים כיצד אנו משתמשים AFM למדוד את שני הקירות התא תכונות מכניות ולחץ טורגור. שני יישומים אלה מומחש בשני מיקרוסקופים AFM שונים ומפורטים כאן לאחר מכן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. מידה של מאפיינים מכניים של קיר התא

הערה: מוצג דוגמה של החלה התפתחות החלה ההתפתחות הבין-מידלית של Arabidopsis .

  1. הכנת דגימות ביולוגיות
    1. לאסוף ניצן פרח סגור בשלב 9 עד 10 (כ 0.5 מ"מ זמן) לפי קביעת שלבים שפורסמו עבור Arabidopsis4. תחת המשקפת, באמצעות פינצטה עדין, בזהירות לפתוח את ניצן כדי לבדוק את השלב של הפיתוח ולאסוף את השיטה הממוקמת במרכז הפרח.
    2. שימו את השחלה על קלטת צדדית כפולה הממוקמת במרכז העטיפה של צלחת פטרי קטנה (קוטר של 5 ס מ).
      הערה: כחלופה, ניתן להשתמש בדבק תואם ביולוגי גם לצורך השתק יעיל יותר של המדגם בעת הכניסה.
    3. להוסיף במהירות מים עד המדגם מכוסה לחלוטין. זה מונע התייבשות ומפחית את הדבקה של הקצה למדגם. לחילופין, יש לטבול את המדגם במדיום הנוזלי, כגון תרבות הפיסגה האראידופזיס בינונית5.
  2. כיול AFM
    1. הגדר את האביב הרציף k מספיק גבוה כדי לאפשר דפורמציה של משטח המדגם עד הכניסה הרצויה, אבל לא גבוה מדי כדי למנוע אובדן רגישות.
      הערה: ככלל מחוספס של אגודל, אם מודול המדגם של יאנג מוכר, סדר הגודל של קבוע האביב יכול להיבחר כ- k≈E * δ, כאשר δ הוא הכניסה הרצויה.
    2. השתמש R = 400 nm-הסתיים כדורי קצה עם 15 יקרומטר קצה-זיז מרחק.
      הערה: רדיוס התשר קשור ישירות לרזולוציה הצדדית. בדרך כלל, לכניסה על חומרים ביולוגיים, לבחור עצות מעוגלות (R גדול מ 10-20 ננומטר) או בדיקה קולאידית. בדיקה קולאידית קטנה עשויה להיות מסובכת לשימוש בשל המרחק הקטן בין קצה הקצה והזיז שיכול לגעת במשטח המדגם.
    3. להפעיל את התוכנה ולמקם את הראש אופקית לפחות 2-3 h לפני הניסוי: זה יאפשר את הראש כדי thermalize להימנע המושרה לייזר תנועה יחסית מהלכים. אם המיקרוסקופ מצויד מודול cellhesion (הארכת טווח הזמינות של Z ל100 יקרומטר במקום 15 יקרומטר), החלף את הבקר שלה תחילה ולאחר מכן בחר במצב cellhesion בעת הפעלת התוכנה.
    4. הר את הזיז על בלוק הזכוכית הר את הבלוק על הראש. מניחים droplet של כמה מיקרוליטרים של מים באולטרסאונד על הקצה כדי למנוע היווצרות של בועות אוויר כאשר הקצה טבול לתוך המים.
    5. מניחים דגימה קשה (ניקוי שקופית זכוכית או ספיר) ולהוסיף 30-50 μL של מים באולטרטהורים.
      הערה: נוהל הכיול המתואר כאן הוא כיול הקשר שנקרא לעתים. ראשית, עקומת כוח מורכב על משטח נוקשה ושטוח ואז הספקטרום תנודות של הזיז הנרגש תרמית מתועד על מנת לחשב את קבוע האביב. פרוטוקולי כיול אחרים קיימים והוא יתואר בקצרה בפסקת הדיון.
    6. מניחים את הראש על הבמה (היזהרו להרים את מנועי Z גבוה מספיק). השתמש בתמונה האופטית כדי בערך למקם את הלייזר על הזיז.
      1. הזיזו את הלייזר לאורך הציר הראשי של הזיז ועקבו אחר האות בפוטודיודה.
        הערה: כאשר משמשים התלויה סטנדרטיים, סכום גדול מ 0.5 V יש לקבל.
      2. להעביר את הלייזר לכיוון השני ולמקסם את האות סכום כדי למקם את הלייזר באמצע הזיז. זה יהיה למזער את הדיבור בין הטיה לרוחב ואנכי.
    7. מדידה של רגישות הטיה
      הערה: הפוטודיודה קוראת הזחה בלייזר ומספקת אות בולטים. כדי להיות מסוגל למדוד הטיה ביחידה מטרית, יש למדוד רגישות הטיה.
      1. הגדר את המכשיר במגע → כוח ספקטרוסקופיית. הגדרת setpoint יחסית ל-2 V, אורך Z עד 0.5 Μm, והרחבת מהירות ל-2 μm/s (קצב דגימה ל-10000 Hz) ובחר בלולאה מסוג Z סגור.
      2. פתח את מנהל הכיול ובחר את חלק איש הקשר של עקומת הכוח (שאמור להיות ליניארי) כדי לבצע התאמה ליניארית: ההופכי של השיפוע מעניק את רגישות הסטיה. קריאת הפוטודיודה מכוילים כעת ביחידה מטרית.
    8. קביעת קבוע האביב. במנהל הכיול, בחר קבוע אביב כדי להריץ רכישת ספקטרום תרמי. כדי לממוצע את האות לזמן ארוך יותר, בחר בסימן ∞. ספקטרום הכוח של הזיז הנרגש עשוי להראות מספר פסגות; צייר בחירה סביב האחד שמוקם בתדר הנמוך ביותר כדי להתאימה.
      הערה: אם המנגינה התרמית מבוצעת בנוזל, פסגת התהודה תהיה רחבה יותר והתדר שלה הופחת לעומת הנומינלי.
  3. כפיית הערכה של ניסוי ספקטרוסקופיית ורכישה
    1. מניחים את המדגם על הבמה AFM ומניחים את הראש על המדגם.
      הערה: ודא שהראש הגיע מספיק כדי למנוע מגע קשה בין הקצה לבין משטח הדגימה.
    2. . תן לזיז לעבור כמה דקות
    3. במצב QI , גישה עם כוח setpoint של 50 nN.
    4. הגדר אורך Z של 4 יקרומטר ואזור סריקה כדי 80 x 80 יקרומטר2 עם מספר פיקסלים של 40 x 40. בחלונית ' הגדרות דימות מתקדמות ', הגדר את המצב למהירות קבועה. הגדרת מהירות הרחבה והסגת ל-200 μm/s והתעריפים לדוגמה ל-25 kHz.
    5. התחל לסרוק והשתמש בסריקת כוח נמוכה מהירה זו לבדיקה אם המדגם זז. ודא שהאזור שנסרק נקי מפסולת או מתאים שעברו הקצאה ומאתר אזור מעניין ככל האפשר כדי לבצע את המידות.
      הערה: כדי להעריך את ההטיה לדוגמה האמיתית, יש להגדיר את השורה לפני כיבוי או לקבוע. זווית הטיה מוגזמת בין ציר הכניסות לבין המשטח תהיה השפעה על מודול5של יאנג הנמדד.
    6. לאחר אזור של עניין כבר ממוקם, בחר אזור של 40 x 40 כדי 60 x 60 יקרומטר2 סביבו ולהגדיל את מספר הפיקסל כדי להגיע 2 פיקסלים/יקרומטר. הגדל את setpoint כדי 500 nm כדי לקבל הכניסה 100-200 nm. התאם ערך זה, במקרה הצורך, בתחילת הניסוי. הפחת את אורך Z ל-2 μm. הקטנת הרחבה והסגת מהירות ל-100 μm/s והגדילו את קצב המדגם ל 50 kHz.
    7. התחל לסרוק ולשמור את הפלט (המורכב בדרך כלל על-ידי תמונה וקובץ נתונים).
    8. בסוף יום המדידה, להסיר את מחזיק התשר ולשטוף אותו בעדינות עם מים באולטרטהור ו 70% אטוח.
    9. . יבש והוצא את הזיז לקבלת ניסויים נוספים עם אותו הטיפ, לשקול לנקות אותו עם פרוטוקול ניקוי רטוב, אם אפשרי, טיפול פלזמה O2 מעקב. אל תתנו מים להתייבש על הזיז ו/או מחזיק התשר כדי למנוע התגבשות מלח.
  4. ניתוח נתונים (עבור גירסת תוכנה לעיבוד נתונים של 6. x)
    1. פתח את תוכנת עיבוד נתונים וטען את קובץ הנתונים.
    2. לחץ על השתמש במפה זו עבור לחצן עיבוד אצווה כדי להשתמש באותם פרמטרים ניתוח על כל עקומות של המפה.
    3. בטעינה של תהליך מוגדר מראש, בחר התאמה להרץ.
    4. השתמש בכרטיסיה הראשונה כדי לאמת או לשנות את פרמטרי הכיול.
    5. בכרטיסיה השניה, הסר היסט (או היסט בתוספת הטיה) מקו הבסיס כדי להגדיר את הערך הממוצע שלה כ-0.
    6. בכרטיסיה השלישית, העריכו את מיקום נקודת המגע (POC) בהתחשב בכך כנקודה הראשונה החוצה את הכוח 0 כאשר יורדים מערך ה-setpoint לאורך עקומת ההרחבה.
    7. מיקום הקצה האנכי של הכרטיסיה מחשב תנועת עצה על-ידי הפחתת הסטיה של הזיז מגובה נמדד. בשלב זה, השתמש בגובה לא מוחלקים (נתונים גולמיים) עבור ההתאמה הבאה, על-ידי בדיקת תיבת הסימון המתאימה.
    8. בכרטיסיה התאמה לאלסטיות , בחר את מודל ההתאמה המתאים. אם הדבקה לא מוגדרת או חלשה מוצגת בעת הסגת עקומות (המתאימות לפחות מ-10% מכוח ה-setpoint או לכוח הממוצע המירבי בעומק הכניסות שנבחר), יש להגדיר את סוג הדגם כ-הרץ/סנון ולהרחיב את העקומה. במקרה של הדבקה חזקה יותר, DMT מודל, אשר מייצג את המודל Derjaguin-מולר-Toporov, צריך להיות מועדף ומתאים צריך להתבצע על החזר עקומות (עיין במדריך לפרטים על מודלים ליצירת קשר זמין ו הקשורים).
      1. הגדר פרמטרים גיאומטריים של עצה בהתבסס על צורת עצה נומינלית. כאן, עצה צורה היא הספרה והטיפ רדיוס הוא 400 ננומטר.
      2. הגדר את יחס הפואסון ל-0.5 מכיוון שהוא מקובל עבור חומר ביולוגי (המתאים לחומר לא מתאים).
    9. יתאים להזחה מסוימת. כברירת מחדל, ההתאמה מבוצעת על פני העקומה כולה. אם יש לבצע את ההתאמה עד לכניסה מסוימת, בדוק תחילה את תיבת הסימון הסטת עיקול ; פעולה זו תגרום לשינוי מקור העקומה בהתבסס על ערכי בסיס חדשים שנקבעו וPOC.
      1. הוסף שגרת אלסטיות שניה על-ידי לחיצה על הסמל בחלון הראשי.
      2. הגדר שוב את כל הפרמטרים המתאימים וציין ב- X דקות את הכניסה הרצויה. הוסף שלבים רבים ככל הנדרש (2 עד 3 שלבים צריכים להספיק) כדי למקד את קביעת המיקום POC ולאחר מכן את עומק הכניסות המחושב. התהליך ניתן לשמירה בשלב זה.
    10. לחץ על לשמור ולהחיל על כל כדי לחזר את השלבים הקודמים על כל עקומות של המפה.
    11. . שמור את התוצאות תמונה וקבצי. tsv יקבלו.

2. מידה של לחץ טורגור

הערה: מוצג כאן דוגמה של מריאת התפרחת הבין-אוריזלאני של Arabidopsis.

  1. הכנת דגימה ביולוגית
    1. לאסוף את מריטותזיס תפרחת האיחוד (IM) מטופלים עם המיקרו-כדורית התרופה oryzalin מצמח מתורבת גדל על בינוני המכיל את כלי העזר הקוטבי מעכבי התחבורה 1-N-נפתלי לפתלמי (NPA) בעקבות שיטה שפורסמה . שישה מטרים
    2. דגימת IM הרכבה לאחר אחת משתי האפשרויות
      1. לניטור לטווח ארוך: יש לטעון את המדגם בצלחת פטרי המכילה את מדיום תרבות הפיסגה של arabidopsis (ACM)7,8 ו-0.1% שימור הצמח בתערובת (PPM), כדי למנוע זיהום. השהה את קצה הודעות הim מעל פני השטח של ACM ותמוך בבסיס IM עם טיפה של 2% הצמח.
      2. למדידה עם שינויי פתרון מהירים: טעינת המדגם בצלוחית פטרי האוחזת בחתיכה קטנה של דבק מסטיק, ובמהירות חותם את הפער בין המסטיק לבין הבסיס לדוגמה עם דבק תואם ביו. המתן להדבקה לחזק (פחות מ -2 דקות) ולאחר מכן הפחת את המדגם ב-ACM נוזלי המכיל 0.1% PPM.
        הערה: ודא שמשטח הדגימה אינו מצופה בצמח או דבק בעת תיקון הבסיס לדוגמה. מדידת AFM של לחץ טורגור דורש את המדגם להיות רכוב באופן סביר, ואת שיטות ההרכבה הקודמת לספק יציבות סבירה. בהתאם לדוגמה, ניתן להשתמש בשיטות הרכבה אחרות, כגון קלטת דו-צדדית, פולי ליזין וכדומה.
  2. כיול AFM
    1. הפעל את תוכנת הרכישה של AFM ובחר במצב המדידה של Peakforce QNM (משרעת גדולה) .
    2. בצע כיול בעקבות אותו עיקרון שמתואר בשלבים 2.1 עד 2.6.
    3. בחלון הפרמטרים של הבדיקה, הגדר את גודל הסריקה כ-0. בחלון השיפוע , הגדר את גודל השיפוע בין 200 ננומטר לבין 500 Nm, מפתן טריגונומטריה בין 2 v ל-5 ומספר דוגמאות ל2048 ומעלה.
    4. יישר את קצה הזיז עם דגימת הכיול ולחץ על הלחצן ' גישה'.
    5. בעת יצירת קשר, עבור אל חלון השיפוע ולחץ על השיפוע הרציף של הלחצן. על המשטר הליניארי של העקומה, קבע את השיפוע על-ידי לחיצה על לחצן עדכן רגישות . חזור על המדידה של רגישות הטיה מספר פעמים ועדכן ידנית את הכיול באמצעות ממוצע המדידה על -ידי פתיחת גלאי הטאבים מכיול התפריט.
    6. משכי את ראש ה-AFM ומסירים את דגימת הכיול.
      הערה: הוא הציע לבטל לחלוטין את הראש AFM על ידי בחירת הכרטיסיה שלב ← לאתחל כדי למנוע מגע קשה בשוגג על שינוי לדוגמה.
  3. כפיית הערכה של ניסוי ספקטרוסקופיית ורכישה
    1. אם המדגם אינו שקוע עדיין, יש להטביע אותו עם ACM נוזלי המכיל PPM.
    2. בתוכנת הרכישה, ציין את פרמטרי המדידה באופן הבא:
      1. בחלון הפרמטר Check , קבע קבוע האביב לקבוע האביב מיוצר של הזיז או לקבוע האביב הנחוש כמו בשלב 2.8. בדוגמה זו, היא מוגדרת ב 42 N/m.
      2. הגדר את רדיוס קצה ל400 ננומטר בדוגמה זו.
      3. הגדר לדוגמה את יחס הפואסון ל-0.5, שכן המים תורמים בעיקר ללחץ הטורגור.
      4. הגדר דוגמה/קו ל-128 כדי להבטיח רכישה מהירה.
      5. הגדר את קצב הסריקה ל-0.2 Hz.
      6. הגדר גודל סריקה ל-1 μm.
        הערה: הגדרת קצב סריקה וגודל סריקה קטנים עשויים למנוע נזק לדוגמה של AFM המופעל באמצעות סריקה. מומלץ לצמצם שני פרמטרים אלה על כל שינוי לדוגמה.
      7. בחלון השיפוע, קבע את גודל השיפוע ל-5 μm.
        הערה: עדיף להגדיר גודל השיפוע גדול יותר מאשר עומק כניסה עבור רכישה בסיסית טובה יותר.
      8. הגדר סף טריגונומטריה למקסימום.
      9. הגדר את מספר הדגימות ל-4608.
      10. באופן אופציונלי, במיקרוסקופ ← כרטיסיית פרמטרים להתקשרות , הפחת את הפרמטרים הבאים כדי למנוע נזק חזק למדגם. הגדר שיא כוח הפעל Setpoint כדי 0.3 v (ברירת המחדל 0.5 v). הגדר הפעל int. להרוויח כדי 0.5 (ברירת המחדל 0.75). הגדרת spm לעסוק בצעד 4 יקרומטר (ברירת מחדל 15 יקרומטר).
    3. הציבו ויישרו את המדגם מתחת לראש AFM, והתקרבו עד שהזיז מתחת לפני המים, אך לא במגע עם משטח המדגם.
      הערה: תוך כדי התקרבות, נשוף קלות על פני השטח של ACM נוזלי עד שנוצר גשר נוזלי בין הזיז לבין המשטח הנוזלי. זה בדרך כלל מונע מגע קשה.
    4. בזהירות, גישה ידנית לכיוון המדגם. כאשר החללית הוא קרוב יחסית למשטח דגימה, לחץ על הגישה.
    5. בעת יצירת קשר, הגדל בהדרגה את גודל הסריקה ו/או הסריקה rate עד לאיזון רצוי מבלי לפגוע במדגם ו/או בזיז.
      הערה: גודל הסריקה מוגבל על-ידי עקמומיות המשטח והחספוס של המדגם. במקרה של oryzalin מטופלים IM, 50 x 50 יקרומטר2 אזור הסריקה ניתן להשיג עם קצב הסריקה של 0.3 Hz.
    6. במהלך הסריקה, קבע אם אזור המדידה רצוי. מקם מיקום במידת הצורך. כאשר מרוצה, לחץ על נקודת לחצן ולירות כדי ליזום את הצבע ולירות חלון.
    7. לפני הקלטת הסריקה, בחר ערוץ תמונה מתאים שעשוי להקל על זיהוי ברור של מתארי תאים. לעתים קרובות, שגיאת כוח שיא, DMT מודולוס, LogDMT מודולוס או הפיזור מתאים. ציין שם קובץ וספריית שמירה. לאחר מכן לחץ על השיפוע בסריקה הבאה כדי ליזום הקלטה.
      הערה: שורה של נקודה ושלושה מספרים יתווספו באופן אוטומטי לאחר שם הקובץ המיועד (כמו. 000). מספר זה מגדיל באופן אוטומטי ב-1 על כל החזרות של סריקה שנשמרה.
    8. כאשר הסריקה תושלם, ממשק התוכנה תנותב מחדש באופן אוטומטי אל חלון השיפוע. לחצו על התמונה הסרוקה כדי לציין את המיקומים לכניסה.
      הערה: לפני הקלטת כניסות, עדיף לבחור מספר ציוני דרך כדי לבצע כניסות בדיקה על ידי לחיצה על השיפוע בלבד, במקרה שינוי פרמטרים נדרש (עבור גודל הרמפה, מיקום piezo, וכו '). עומק הכניסה צריך להיות גדול יותר מעובי דופן התא (נקבע באופן אידיאלי בנפרד על ידי שידור אלקטרון מיקרוסקופ).
    9. בחר לפחות שלושה אתרי כניסה לכל תא בסמוך למרכז הרישוריאלי, וחזור על כניסה שלוש פעמים באתר. זה יכול להניב לפחות תשעה כוחות כוח לכל תא לניתוח נוסף. כאשר הוא מרוצה ממיקום הכניסה לאתר, לחץ על כבש ולכוד. עקומות כניסות הכוח נשמרות באופן אוטומטי בספריה המיועדת.
    10. כאשר הרמפות מושלמות, מקמו מחדש למיקום אחר למדידת מידות, או משכי את הסריקה ראש ושינוי דגימה.
    11. כשתסיים, נקה את הזיז כמו בשלבים 1.3.8 ו-1.3.9.
  4. ניתוח מידע
    1. בתוכנת הניתוח, פתח את הקובץ *. mca. פעולה זו מציגה את המיקום של כל עקומת כוח בתמונה הסרוקה. במקרה הצורך, בחרו מראש את עקומות הכוח לצורך ניתוח.
    2. פתח עקומת כוח אחת כדי להיות מנותח, בדרך כלל בתבנית של x0000y. 00z, כאשר x הוא שם הקובץ שצוין בספריה save בזמן ש-y ו-z הם מספרים רשומים אוטומטית המציין רצף כניסות ומספר סריקה.
    3. לחץ על לחצן תיקון בסיסי וגרור את שורות המקף הכחול בעקומת הכוח עד להרחבת ההפעלה הבסיסית של המקור והרחב את הפסקת הבסיס של המקור הם ב-0% ו-80%, בהתאמה. לחץ על ביצוע.
      הערה: לחלופין, ניתן להרחיב את האפשרות ' עצירת בסיס מקור ' בערכים שונים, כל עוד היא עדיין בתוך התוכנית הבסיסית ולא מעבר לנקודת המגע.
    4. לחץ על הלחצן מסנן בקרון ולחץ על ביצוע כדי להחליק את עקומת הכוח.
    5. לחץ על לחצן ההזחה.
      1. בחלון הקלט , הגדר את העקומה הפעילה להרחבה.
      2. הגדר את שיטת ההתאמה כדי להתאים את המודל וכלול את כוח הדבקה ככן.
      3. הגדר את גבול התאמת הכוח המירבי ל-99% ולגבול התאמה של כוח מזערי ל-75%.
      4. הגדר מודל התאמה נוקשות (ליניארי).
        הערה: הכיוונון הזה יהיה לחשב את הנוקשות לכאורה לניכוי לחץ טורגור. בדוגמה זו, גבולות ההתאמה משקפים התאמה קשיות של סביב 1.5 יקרומטר כניסות עומק.
    6. כוח עקומות ניתן לנתח באצווה. לחץ על לחצן ' העבר היסטוריה ', ציין את ספריית הדוחות והוסף את כל עקומות הכוח האחרות הדורשות טיפול זהה. כאשר הוא מרוצה, לחץ על הפעל. כברירת מחדל, ההתאמה תאוחסן כקובץ *. txt.
    7. כאשר k הוא אצווה מצויד, לחץ על היסטוריה → 5 כניסות כדי לחזור לחלון הכניסה.
      1. שינוי גבול ' התאם כוח מירבי ' ל-10% ו- Min Force התאם גבול ל-0%.
      2. הגדר מודל התאמה להרפה ( כדורי ).
        הערה: זה יהיה לחשב את קיר התא מודול הצעיר של הילד לניכוי לחץ טורגור. בדוגמה זו, הגבולות המתאימים משקפים התאמה הרציבית (באמצעות בדיקה כדורית) של סביב 0.4 יקרומטר כניסות עומק.
    8. חזור על שלב 2.4.6 עבור התאמה לאצווה E.
    9. פתח את הקובץ *. 00z (z הוא מספר הסריקה הרשום באופן אוטומטי) כדי להציג את ערוצי הסריקה השונים. בחלון ערוץ גובה , לחץ על לחצן מקטע. זה יאפשר את המדידה של עקמומיות פני השטח של המדגם הנדרש עבור הפחתה בלחץ טורגור.
      1. ציירו קו לאורך הציר הארוך של תא אחד, הזיזו את גבולות קו המקף לקצות התאים והקליטו את ערך ה- r1של הרדיוס . חזור על הפעולה עבור הציר הקצר כדי לאחזר את הרדיוס r2. חישוב פני השטח של תא ממוצע עקמומיות κM ו-גאוס עקמומיות κG באמצעות שתי מדידה רדיוס פנייה של כדלקמן:
        figure-protocol-1וfigure-protocol-2 
    10. להסיק לחצים לחץ P באמצעות מודל דק מעטפת שפורסם9 כדלקמן:
      figure-protocol-3 
      עם
      figure-protocol-4
      כאשר t הוא עובי קיר התא נקבע על ידי למשל אלקטרון מיקרוסקופ.
      הערה: הפחתה של לחץ טורגור הוא תהליך הולם, שבו האיטראציות נדרשים. ארבע איטראציות הם בדרך כלל מסוגלים לשכפל מוצר יציב, עם זאת איטראציות יותר ניתן לעשות (למשל 100 פעמים).
    11. חישוב ממוצע E, k ו- P לכל תא. כמו כן, לרשום את ההבדלים תאיים (למשל, סטיית תקן) עבור תיעוד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

איור 1A ואיור 1a מציגים מסך צילום הממחיש את תוצאת השלבים ה1.3.4 ל1.3.6 של הפרוטוקול, המשמש לאיתור אזור מעניין היכן לרכוש את מפת ה-QI. ראוי לציין שאזור העניין נבחר כדי לא להיות על משטח מוטה (כלומר שטוח ככל האפשר). למעשה, כפי שהבחינו על ידי Routier ואח '5, אם ציר הכניסות אינו ניצב על פני השטח, מודול הצעירים נמדד להמעיט. אפקט זה גלוי בפינה הימנית העליונה של לוחות C או D של איור 1...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הופעתה של צורות בצמחים נקבעת בעיקר על ידי הקצב המתואם וכיוון הצמיחה בזמן ובמרחב. תאי הצמחים מארוזים בקיר תא קשיח העשוי ממטריצה פוליסכדידיום, אשר מדביק אותם יחד. כתוצאה מכך, הרחבת התא נשלטת על ידי שיווי משקל בין לחץ טורגור מושך את קיר התא, ואת הנוקשות של קיר התא התנגדות ללחץ זה. כדי להבין את המנגנון הבסיסי הפיתוח, חשוב להיות מסוגל למדוד את שני הקירות התא תכונות מכניות, כמו גם לחץ טורגור ברקמות שונות או תאים של איבר נתון. כפי שמתואר במאמר זה, AFM הוא שיטת הבחירה בהקשר זה.

קיימים מספר שלבים קריטי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

אנחנו רוצים להודות לצוות הפלטים על התמיכה הטכנית שלהם, כמו גם ארצקי בודאוד וחברי צוות הביוסיק במעבדת RDP לדיונים מועילים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>צמיחה בינונית
1,000x תמיסתהמשמשת לייצור ACM, הרכב ראה Stanislas et al., 2017. יש להוסיף ל-ACM לאחר חיטוי, לפני המזיגה.
1-N-חומצה נפתילפתלמית (NPA)Sigma-Aldrich/Merck132-66-1להוסיף למדיום Arabidopsis, 10 μM. להוסיף לאחר חיטוי, לפני המזיגה.
Agar-agarSigma-Aldrich/Merck9002-18-0הוסף ל-Arabidopsis בינוני, 1% w/v.
AgaroseMerck Millipore9012-36-6משמש לייצור ACM מוצק, 0.8% w/v.
Arabidopsis בינוניDuchefa BiochimieDU0742.0025לתרבית ארבידופסיס במבחנה, 11.82 גרם/ליטר.
סידן חנקתי טטרהידראטסיגמא-אולדריץ'/מרק13477-34-4מוסיפים למדיום ארבידופסיס, 2 מ"מ.
מוראשיג & SKOOG MEDIUMDuchefa BiochimieM0221.0025תערובת מלח בסיסית, המשמשת להכנת ACM, 2.2 גרם/ליטר.
N6-benzyladenine (BAP)Sigma-Aldrich/Merck1214-39-7משמש לייצור ACM, 555 ננומטר. יש להוסיף ל-ACM לאחר חיטוי, לפני המזיגה.
OryzalinSigma-Aldrich/Merck19044-88-3לטיפול ב-oryzalin, 10 μ גרם/מ"ל.
תערובת לשימור צמחים (PPM)תאים צמחייםהמשמשת לייצור ACM, 0.1% v/v. הוסף ל-ACM לאחר חיטוי, לפני המזיגה.
אשלגן הידרוקסידDuchefa Biochimie1310-58-3משמש לייצור Arabidopsis בינוני ו-ACM, שניהם pH 5.8.
סוכרוזDuchefa Biochimie57-50-1משמש לייצור ACM, 1% w/v.
<חזק>כלים עבור AFM
BioScope Catalyst BioAFMBrukerה-AFM המשמש למדידת לחץ טורגור בפרוטוקול זה.
Nanowizard III + CellHesionJPK (Bruker)ה-AFM המשמש למדידת תכונות מכניות.
PatafixUHUD1620
התייחסות מבנה אלזיטיNanoIdea2Z00026
Reprorubber-Thin PourFlexbar16135דבק תואם ביולוגי.
טיפים כדורייםAFM NanoandmoreSD-SPHERE-NCH-S-10טיפים המשמשים למדידת תכונות מכניות.
מלאי וימטין טכנולוגיית

מקורות

  1. Du, F., Guan, C., Jiao, Y. Molecular mechanisms of leaf morphogenesis. Molecular Plant. 11, 1117-1134 (2018).
  2. Cosgrove, D. J. Growth of the plant cell wall. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 850-861 (2005).
  3. Dumais, J. Can mechanics control pattern formation in plants? Current Opinion in Plant Biology. 10, 58-62 (2007).
  4. Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. Early flower development in Arabidopsis. The Plant Cell. 2, 755-767 (1990).
  5. Routier-Kierzkowska, A. L., et al. Cellular force microscopy for in vivo measurements of plant tissue mechanics. Plant Physiology. 158 (4), 1514-1522 (2012).
  6. Corson, F., et al. Turning a plant tissue into a living cell froth through isotropic growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 8453-8458 (2009).
  7. Hervieux, N., et al. A mechanical feedback restricts sepal growth and shape in Arabidopsis. Current Biology. 26, 1019-1028 (2016).
  8. Stanislas, T., Hamant, O., Traas, J. Chapter 11 - In-vivo analysis of morphogenesis in plants. Methods in Cell. Lecuit, T. 139, Academic Press. 203-223 (2017).
  9. Beauzamy, L., Derr, J., Boudaoud, A. Quantifying hydrostatic pressure in plant cells using indentation with an atomic force microscope. Biophysical Journal. 108 (10), 2448-2456 (2015).
  10. Costa, K. D., Sim, A. J., Yin, F. C. P. Non-Hertzian Approach to Analyzing Mechanical Properties of Endothelial Cells Probed by Atomic Force Microscopy. Journal of Biomechanical Engineering. 128 (2), 176-184 (2006).
  11. Beauzamy, L., Louveaux, M., Hamant, O., Boudaoud, A. Mechanically, the shoot apical meristem of Arabidopsis behaves like a shell inflated by a pressure of about 1MPa. Frontiers in Plant science. 6 (1038), 1-10 (2015).
  12. Majda, M., et al. Mechanochemical polarization of contiguous cell walls shapes plant pavement cells. Developmental Cell. 43 (3), 290-304 (2017).
  13. Torode, T. A., et al. Branched pectic galactan in phloem-sieve-element cell walls: implications for cell mechanics. Plant Physiology. 176, 1547-1558 (2018).
  14. Farahi, R. H., et al. Plasticity, elasticity, and adhesion energy of plant cell walls: nanometrology of lignin loss using atomic force microscopy. Scientific Reports. 7, 152(2017).
  15. Peaucelle, A., et al. Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis. Current Biology. 21, 1720-1726 (2011).
  16. Cosgrove, D. J. Diffuse growth of plant cell walls. Plant Physiology. 176, 16-27 (2018).
  17. Sader, J. E., Larson, I., Mulvaney, P., White, L. R. Method for the calibration of atomic force microscope cantilevers. Review of Scientific Instruments. 66 (7), 3789-3798 (1995).
  18. Sader, J. E., Chon, J. W. M., Mulvaney, P. Calibration of rectangular atomic force microscope cantilevers. Review of Scientific Instruments. 70 (10), 3967-3969 (1999).
  19. Sikora, A. Quantitative Normal Force Measurements by Means of Atomic Force Microscopy Towards the Accurate and Easy Spring Constant Determination. Nanoscience and Nanometrology. 2 (1), 8-29 (2016).
  20. Schillers, H., et al. Standardized Nanomechanical Atomic Force Microscopy Procedure (SNAP) for Measuring Soft and Biological Samples. Scientific Reports. 7 (1), (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Indentation ModeHertzian Model

מאמרים קשורים