כאן, אנו מציגים פרוטוקול העושה שימוש בצבעים ליד אינפרא-אדום בשילוב עם האימונוהיסטוכימיה וסריקה ברזולוציה גבוהה כדי לאשר את החלבונים באזורי המוח.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
שימוש בקרוב-אינפרא אדום פלואורסצנטית ברזולוציה גבוהה סריקה למדוד חלבון הביטוי במוח מכרסם
במאמר זה
סיכום
תקציר
מדעי המוח הוא חקר כיצד תאים במוח בתווך פונקציות שונות. מדידת חלבון הביטוי בנוירונים ו glia היא קריטית לחקר מדעי המוח כפונקציה תאית נקבעת על ידי הרכב ופעילות של חלבונים סלולריים. במאמר זה, אנו מתארים כיצד ניתן לשלב את היכולות האימונולוציטוכימיה עם סריקה ברזולוציה גבוהה-אינפרא-אדום כדי לספק מידה חצי כמותית של ביטוי חלבון באזורי מוח נפרדים. ניתן להשתמש בטכניקה זו לביטוי חלבון יחיד או כפול באותו אזור המוח. מדידת חלבונים בצורה זו יכולה לשמש כדי לקבל שינוי יחסי בביטוי חלבון עם מניפולציה ניסיוני, חתימה מולקולרית של למידה וזיכרון, פעילות במסלולים מולקולריים, ופעילות עצבית באזורי מוח מרובים. ניתן לקבוע באמצעות החלבונים והניתוחים הסטטיסטיים הנכונים, קישוריות פונקציונלית בין אזורי מוח. בהתחשב בקלות של יישום כימיה חיסונית במעבדה, שימוש באמצעות אימונולוציטוכימיה עם סריקה ברזולוציה גבוהה-אינפרא-אדום יכול להרחיב את יכולת הנוירומדען לבחון תהליכים נוירויולוגיים ברמת מערכות.
מבוא
המחקר של מדעי המוח חששות חקירה של איך תאים במוח מתווך פונקציות ספציפיות1. אלה יכולים להיות סלולריים בטבע כגון איך התאים גליה מעניקה חסינות במערכת העצבים המרכזית או יכול לכלול ניסויים שמטרתם להסביר כיצד הפעילות של נוירונים בהיפוקמפוס החלק המוביל לניווט מרחבי. במובן רחב, הפונקציה התאית נקבעת על ידי החלבונים המתבטאת בתא ואת הפעילות של חלבונים אלה2. כתוצאה מכך, מדידת הביטוי ו/או הפעילות של חלבונים בתאי המוח הם קריטיים לחקר מדעי המוח.
מספר טכניקות זמינות כדי למדוד ביטוי חלבון במוח. אלה כוללים בשיטות vivo כגון טופוגרפיה פליטת פוזיטרונים עבור צפיפויות הקולטן3 ו מיקרו-דיאליזה ע....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הפרוטוקול הבא אושר על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של אוניברסיטת דלאוור. גברים בחולדות מג בני 55-75 ימים שימשו לפרוטוקול זה.
1. מיצוי המוח והכנת רקמות
- בחדר ההרדמה עד שחולדה כבר. לא מציגה תגובה לצביטה ברגל
- להקריב חולדות באמצעות עריפת ראש מהירה באמצעות גיליוטינה.
- חותכים את העור מאחורי הגולגולת לקדמי וברור מראש הגולגולת.
- השתמש rongeurs להסיר בזהירות את החלק האחורי של הגולגולת, ולאחר מכן באמצעות מספריים מחתך קטן לחתוך את קו האמצע של הגולגולת, דוחף כלפי מעלה על החלק העליון של הגולגולת בכל עת כדי למנוע פגיעה רקמת המוח.
- השתמש rongeurs לקלף מימין ומשמאל חצי גולגולת כדי לחשוף את המוח.....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
לפני שימוש בסריקה ברזולוציה גבוהה עבור אימונוהיסטוכימיה, יש לוודא כי הפרוטוקול פועל. זה יכול להתבצע באמצעות בדיקת אימות שבו סעיפים המוח מאותו בעל חיים מודבטים עם נוגדנים הראשי והמשני, הנוגדן המשני בלבד, או לא העיקרי או נוגדן משני. תוצאות עבור שיטת אימות מסוג זה מוצגות באיור 2. בתגובה זו אנו מזהים את הגן המיידי c-Jun מוקדם בהיפוקמפוס והאמיגדלה. ביטוי C-Jun נצפה רק כאשר נוגדנים ראשוניים ומשניים הוחלו על רקמת המוח.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
התוצאות שהוצגו במאמר זה מראים כי קרוב-אינפרא-אדום אימונוציטוטוכימיה בשילוב עם סריקה ברזולוציה גבוהה ניתן להשתמש כדי לקבל אמצעים חצי כמותיים של ביטוי חלבון ברקמת המוח. זה יכול לשמש גם כדי לתייג שני חלבונים בו זמנית באותו אזור המוח. בעבר השתמשנו בשימוש קרוב-אינפרא אדום אימונוהיסטוכימיה כדי למדוד ביטוי גנטי מיידי מוקדם באזורים המוח מרובים9,10. גנים מוקדמים מיידיים יכולים לשמש כאמצעי לפעילות עצבית. כמו כן, אנו נתונים אלה מדדים חצי כמותיים של ביטוי חלבון לניתוחים סטטי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
. למחברים אין מה לגלות
תודות
המחקר בדו ח זה מומן על ידי מענק היעד של הכושים (1P20GM103653) הוענק DK.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מיצוי | |||
| הרדמה תא אינדוקציה | קנט סיינטיפיק | VetFlo-0530SM | |
| קליין גיליוטינה | מכשיר הרווארד | 73-1920 | |
| פרידמן רונגור | פיין מדע כלים | 16000-14 | המשמשים להסרת החלק האחורי של הגולגולת |
| מספריים חיתוך עדינים | פישר סיינטיפיק | 08-951-5 | משמש לחיתוך כלפי מעלה לאורך קו האמצע של הגולגולת |
| מיקרו מרית | פישר סיינטיפיק | 21-401-5 | משמש להוצאת |
| מוח זכוכית מיקרוסקופ שקופיות | פישר סיינטיפיק | 12-549-6 | |
| תגובה | |||
| Triton X-100 | משמש כחומר ניקוי עדין לחדירת תאים לאחר קיבוע ב-Paraformaldehyde, משמש גם כחומר ניקוי עדין בשילוב עם סרום מארח ונוגדנים משניים | ||
| Tween-20 | משמש ככמות קטנה של חומר ניקוי שנוספה ל-TBS כדי להשיג TBS-T לאחר החלקת שקופיות עם הנוגדן העיקרי | ||
| סורק Licor Odyssey Licor | Biotechnology Inc. | ||
| סטודיו אימג' | ליקור ביוטכנולוגיה בע"מ |
מקורות
- Kandel, E. R. Principles of Neural Science. , McGraw Hill. New York. (2013).
- Byrne, J. H., Roberts, J. L. From Molecules to Networks: An Introduction to Cellular and Molecular Neuroscience. , Academic Press/Elsevier. (2009).
- Salami, A., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
