כאן, אנו מציגים פרוטוקול העושה שימוש בצבעים ליד אינפרא-אדום בשילוב עם האימונוהיסטוכימיה וסריקה ברזולוציה גבוהה כדי לאשר את החלבונים באזורי המוח.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
שימוש בקרוב-אינפרא אדום פלואורסצנטית ברזולוציה גבוהה סריקה למדוד חלבון הביטוי במוח מכרסם
במאמר זה
סיכום
תקציר
מדעי המוח הוא חקר כיצד תאים במוח בתווך פונקציות שונות. מדידת חלבון הביטוי בנוירונים ו glia היא קריטית לחקר מדעי המוח כפונקציה תאית נקבעת על ידי הרכב ופעילות של חלבונים סלולריים. במאמר זה, אנו מתארים כיצד ניתן לשלב את היכולות האימונולוציטוכימיה עם סריקה ברזולוציה גבוהה-אינפרא-אדום כדי לספק מידה חצי כמותית של ביטוי חלבון באזורי מוח נפרדים. ניתן להשתמש בטכניקה זו לביטוי חלבון יחיד או כפול באותו אזור המוח. מדידת חלבונים בצורה זו יכולה לשמש כדי לקבל שינוי יחסי בביטוי חלבון עם מניפולציה ניסיוני, חתימה מולקולרית של למידה וזיכרון, פעילות במסלולים מולקולריים, ופעילות עצבית באזורי מוח מרובים. ניתן לקבוע באמצעות החלבונים והניתוחים הסטטיסטיים הנכונים, קישוריות פונקציונלית בין אזורי מוח. בהתחשב בקלות של יישום כימיה חיסונית במעבדה, שימוש באמצעות אימונולוציטוכימיה עם סריקה ברזולוציה גבוהה-אינפרא-אדום יכול להרחיב את יכולת הנוירומדען לבחון תהליכים נוירויולוגיים ברמת מערכות.
מבוא
המחקר של מדעי המוח חששות חקירה של איך תאים במוח מתווך פונקציות ספציפיות1. אלה יכולים להיות סלולריים בטבע כגון איך התאים גליה מעניקה חסינות במערכת העצבים המרכזית או יכול לכלול ניסויים שמטרתם להסביר כיצד הפעילות של נוירונים בהיפוקמפוס החלק המוביל לניווט מרחבי. במובן רחב, הפונקציה התאית נקבעת על ידי החלבונים המתבטאת בתא ואת הפעילות של חלבונים אלה2. כתוצאה מכך, מדידת הביטוי ו/או הפעילות של חלבונים בתאי המוח הם קריטיים לחקר מדעי המוח.
מספר טכניקות זמינות כדי למדוד ביטוי חלבון במוח. אלה כוללים בשיטות vivo כגון טופוגרפיה פליטת פוזיטרונים עבור צפיפויות הקולטן3 ו מיקרו-דיאליזה עבור פפטידים קטנים4. בדרך כלל, שיטות vivo ex משמשות כדי לבחון את תפקוד החלבון ואת הביטוי. אלה כוללים טכניקות ספקטרומטר המסה5, כתם מערבי ושיטת חיסוני מקושרת באמצעות אנזימים (אליסה)6, ואימונוציטוטוכימיה7. אימונוציטוכימיה נמצאת בשימוש נרחב בתחום המדעי המוח. טכניקה זו כוללת את השימוש בנוגדן העיקרי כדי לזהות חלבון (או אנטיגן) של עניין (g., c-Fos) ו נוגדן משני מצותת כדי לזהות את החלבון-העיקרי נוגדן קומפלקס (איור 1). כדי לאפשר זיהוי של החלבון-העיקרי נוגדן מורכב נוגדן, נוגדנים משניים יש סוכנים אוקסיגון כגון חזרת peroxidase (HRP) מעלה באוב להם. הדבר מאפשר היווצרות מאיצים בתאים שניתן לאתרם באמצעות מיקרוסקופ אור7. נוגדנים משניים יכולים להיות גם כימיקלים זרוח עלה באוב אותם (כלומר, fluorophores). כאשר מגורה אלה כימיקלים פולטים אור, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לזהות חלבון-ראשי נוגדן משני מכלולי נוגדנים7. לבסוף, לפעמים נוגדנים ראשוניים יש הפחתת סוכנים וכימיקלים פלואורסצנטית המצורפת אליהם ישירות לאשר את הצורך נוגדנים משניים7 (איור 1).
מעניין, הרבה שיטות אימונוציטוטוקכימיה לאפשר ויזואליזציה של חלבונים בתאי המוח, אבל לא את היכולת לכמת את כמות החלבון בתא מסוים או באזור המוח. שימוש במיקרוסקופיה קלה לאיתור מאיצים מתגובות הפחתת מאפשר ויזואליזציה של נוירונים ו גליה, אבל שיטה זו אינה יכולה לשמש לכמת ביטוי חלבון בתאים או באזור המוח מסוים. בתאוריה, מיקרוסקופ ניאון ניתן להשתמש בשביל זה, כי האור הנפלט הנוגדן משני פלורסנט הוא מדד של החלבון-העיקרי נוגדנים משני נוגדנים מורכבים. עם זאת, פלואורסצנטית אוטומטי ברקמת המוח יכול להקשות על השימוש מיקרוסקופ פלואורסצנטית כדי לכמת את הביטוי חלבון רקמת המוח8. כתוצאה מכך, אור הנפלט מתמונות פלורסנט של רקמת המוח משמש לעתים רחוקות כדי לכמת את הביטוי חלבון במוח.
רבים מהנושאים הללו ניתן לטפל באמצעות באמצעות אינפרא-אדום האימונוציטוכימיה בשילוב עם סריקה ברזולוציה גבוהה9,10. במאמר זה, אנו מתארים כיצד משולבים כימיה חיסונית עם fluorophores בספקטרום הפליטה הקרוב-אינפרא אדום ניתן לשלב עם סריקה ברזולוציה גבוהה (g., 10 – 21 μm) כדי לקבל תמונות חדות המאפשרות כימות החלבון בנפרד אזורי המוח.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הפרוטוקול הבא אושר על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של אוניברסיטת דלאוור. גברים בחולדות מג בני 55-75 ימים שימשו לפרוטוקול זה.
1. מיצוי המוח והכנת רקמות
- בחדר ההרדמה עד שחולדה כבר. לא מציגה תגובה לצביטה ברגל
- להקריב חולדות באמצעות עריפת ראש מהירה באמצעות גיליוטינה.
- חותכים את העור מאחורי הגולגולת לקדמי וברור מראש הגולגולת.
- השתמש rongeurs להסיר בזהירות את החלק האחורי של הגולגולת, ולאחר מכן באמצעות מספריים מחתך קטן לחתוך את קו האמצע של הגולגולת, דוחף כלפי מעלה על החלק העליון של הגולגולת בכל עת כדי למנוע פגיעה רקמת המוח.
- השתמש rongeurs לקלף מימין ומשמאל חצי גולגולת כדי לחשוף את המוח.
- השתמשו במרית קטנה לסקופ תחת המוח והעצבים, העלה בזהירות את המוח והקפא את המוח באיזופנטאן צוננים על קרח יבש (לפחות 20 ° c). אחרי זה, לאחסן את המוח במקפיא של 80 ° c עד לחיתוך.
- פורסים את המוח באזורי עניין ב-30-50 יקרומטר בקריוסטט שנשמר בין-9 ° c ו-12 ° c. הרכב באופן ישיר פרוסות על שקופיות זכוכית ולאחסן במקפיא של 80 ° c עד הזמן של שיטת כימיה חיסונית.
הערה: בפרוטוקול זה המוח אזורים של עניין היו ההיפוקמפוס ואת האמיגדלה.
2. התגובה האימונוהיסטוכימיה היחידה
הערה: עבור תגובה אימונוהיסטוכימיה כפולה, הפרוטוקול הוא זהה התגובה החיסונית היחידה למעט התגובה הזו יש שני נוגדנים העיקרי של מארחים שונים (למשל, ארנב ועכבר) ושני נוגדנים משניים עבור המתאים המקדימות צריכה להיות מפונדקאי יחיד (למשל, אנטישפן עז וantimouse עיזים). גם הנוגדנים המשניים צריכים להיות משני ספקטרום שונה הזמינים בסורקים ברזולוציה גבוהה. לדוגמה, נוגדן משני אחד עם השיא ספקטרום פליטה ב 680 ננומטר ומשני נוגדן 800CW (הספקטרום פליטה שיא ב 780 ננומטר).
- הסרת שקופיות זכוכית מן המקפיא ולאפשר שאיפה לטמפרטורת החדר עבור 30 דקות.
- מתחת למכסה המנוע, לתקן רקמת המוח ב 4% פאראמפורמלדהיד ב 0.1 מ פוספט מתכלה באגירה (PBS) עבור 1 על 2 על הטמפרטורה בחדר.
- לשטוף את השקופיות ב 0.1 מלוחים באגירה של M טריס (TBS) שלוש פעמים עבור 10 דקות כל אחד. ממברנות תאים מחלחלים על-ידי דגירה של שקופיות בתכשיר ניקוי קל (לדוגמה, 0.01% דטרגנטים) עבור 30-60 דקות.
- לשטוף שקופיות ב-TBS שלוש פעמים עבור 15 דקות כל אחד.
- לדלל את הנוגדן העיקרי עבור חלבון הריבית ב-PBS בריכוז הנכון. לדוגמה, כדי לזהות את הגן המיידי c-Fos מוקדם, להכין ארנב הראשי נגד c-Fos נוגדן בריכוז של 1:500.
- הנוגדן הראשוני הפתרון העיקרי ישירות על רקמת המוח (כ 200 μL לכל 3 אינץ ' x 1 שקופית אינטש).
- השתמש כיסוי כדי לדגירה את רקמת המוח על שקופיות זכוכית דילול הנוגדן העיקרי עבור או 1 על 2-h בטמפרטורת החדר או לילה (~ 17 h) ב 4 ° c.
- הסר שמיכות ולשטוף שקופיות ב-TBS כי יש כמות קטנה של חומרי ניקוי שנוספו לו (למשל, 0.01% סבון, "TBS-T") ארבע פעמים עבור 15 דקות כל אחד.
- השתמש כיסוי כדי דגירה סעיפים המוח בנוגדן משני בטמפרטורת החדר עבור 2 h.
הערה: הנוגדן המשני צריך להיות לדילול הנכון בדילול המכיל TBS, אבקת כביסה, ו 1.5% של סרום מארח. לדוגמה, נוגדן משני עז בדילול של 1:2000 יכיל 1.5% סרום עז ו 0.05% כביסה. - לשטוף שקופיות ב-TBS-T ארבע פעמים עבור 20 דקות כל אחד, ולאחר מכן ב-TBS ארבע פעמים עבור 20 דקות כל אחד.
- שקופיות יבשות בטמפרטורת החדר. בחשיכה, בן לילה כאשר השקופיות יבשות, הן מוכנות לדימות.
3. הדמיה
- מניחים שקופיות על ממשק הסריקה הכמעט-אינפרא-אדום כאשר הרקמה פונה כלפי מטה. התמונה מחליקה זכוכית אחת או שקופיות מרובות בכל פעם באמצעות כלי בחירה.
- שקופיות תמונה באמצעות הגדרת האיכות הגבוהה ביותר עם היסט של 0 ננומטר ורזולוציה של 21 μm. הסריקה בדרך כלל לוקח 13-19 h בהתאם לציוד הסריקה המשמש.
- יבא תמונות לתוך תוכנת ניתוח התמונה (לדוגמה, ImageStudio) כדי להציג ולסמן עבור ניתוח חלבון חצי כמותי.
4. ניתוח ביטוי חלבון
- פתח את תוכנת ניתוח התמונה ובחר באזור העבודה שאליו התמונה נסרקה.
- פתחו את התמונה הסרוקה בתוכנת ניתוח התמונה כדי להציג את הסריקה, וכוונן אילו אורכי גל יוצגו, כמו גם את הניגודיות, הבהירות וההגדלה המוצגים מבלי לשנות את התמונה הגולמית או את הפליטה הכוללת.
- זהה את אזורי המפתח עבור כימות ובחר את הכרטיסיה ניתוח לאורך החלק העליון של הדף ולאחר מכן בחר בצייר מלבן (או צייר אליפסה/צייר ביד חופשית) כדי לצייר מלבן מעל האזור שיוכמת.
- כדי להציג את גודל המלבן, בחר צורות לאורך החלק השמאלי התחתון של המסך ולאחר מכן בחר בעמודות לאורך החלק התחתון הימני. הוספת עמודות גובה ורוחב כדי לזהות את גודל הצורה.
הערה: חשוב לשלוט בגודל הצורה בהשוואת הקוונפיקציה. מומלץ להשתמש בצורות זהות ממוקמות בתוך מיקום הקוונפיקציה הרצוי, כדי לקבל דגימה מדויקת של פליטות עבור אזור זה. - לאחר מכן, ציין את שם הצורה וחזור על כך. לאחר שכל האזורים נדגמו, ניתן לצבור ולנתח את הנתונים הזמינים מהכרטיסיה עמודות .
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
לפני שימוש בסריקה ברזולוציה גבוהה עבור אימונוהיסטוכימיה, יש לוודא כי הפרוטוקול פועל. זה יכול להתבצע באמצעות בדיקת אימות שבו סעיפים המוח מאותו בעל חיים מודבטים עם נוגדנים הראשי והמשני, הנוגדן המשני בלבד, או לא העיקרי או נוגדן משני. תוצאות עבור שיטת אימות מסוג זה מוצגות באיור 2. בתגובה זו אנו מזהים את הגן המיידי c-Jun מוקדם בהיפוקמפוס והאמיגדלה. ביטוי C-Jun נצפה רק כאשר נוגדנים ראשוניים ומשניים הוחלו על רקמת המוח.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
התוצאות שהוצגו במאמר זה מראים כי קרוב-אינפרא-אדום אימונוציטוטוכימיה בשילוב עם סריקה ברזולוציה גבוהה ניתן להשתמש כדי לקבל אמצעים חצי כמותיים של ביטוי חלבון ברקמת המוח. זה יכול לשמש גם כדי לתייג שני חלבונים בו זמנית באותו אזור המוח. בעבר השתמשנו בשימוש קרוב-אינפרא אדום אימונוהיסטוכימיה כדי למדוד ביטוי גנטי מיידי מוקדם באזורים המוח מרובים9,10. גנים מוקדמים מיידיים יכולים לשמש כאמצעי לפעילות עצבית. כמו כן, אנו נתונים אלה מדדים חצי כמותיים של ביטוי חלבון לניתוחים סטטי...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
. למחברים אין מה לגלות
תודות
המחקר בדו ח זה מומן על ידי מענק היעד של הכושים (1P20GM103653) הוענק DK.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מיצוי | |||
| הרדמה תא אינדוקציה | קנט סיינטיפיק | VetFlo-0530SM | |
| קליין גיליוטינה | מכשיר הרווארד | 73-1920 | |
| פרידמן רונגור | פיין מדע כלים | 16000-14 | המשמשים להסרת החלק האחורי של הגולגולת |
| מספריים חיתוך עדינים | פישר סיינטיפיק | 08-951-5 | משמש לחיתוך כלפי מעלה לאורך קו האמצע של הגולגולת |
| מיקרו מרית | פישר סיינטיפיק | 21-401-5 | משמש להוצאת |
| מוח זכוכית מיקרוסקופ שקופיות | פישר סיינטיפיק | 12-549-6 | |
| תגובה | |||
| Triton X-100 | משמש כחומר ניקוי עדין לחדירת תאים לאחר קיבוע ב-Paraformaldehyde, משמש גם כחומר ניקוי עדין בשילוב עם סרום מארח ונוגדנים משניים | ||
| Tween-20 | משמש ככמות קטנה של חומר ניקוי שנוספה ל-TBS כדי להשיג TBS-T לאחר החלקת שקופיות עם הנוגדן העיקרי | ||
| סורק Licor Odyssey Licor | Biotechnology Inc. | ||
| סטודיו אימג' | ליקור ביוטכנולוגיה בע"מ |
מקורות
- Kandel, E. R. Principles of Neural Science. , McGraw Hill. New York. (2013).
- Byrne, J. H., Roberts, J. L. From Molecules to Networks: An Introduction to Cellular and Molecular Neuroscience. , Academic Press/Elsevier. (2009).
- Salami, A., et al. Dopamine D2/3 binding potential modulates neural signatures of working memory in a load-dependent fashion. Journal of Neuroscience. , (2018).
- Merali, Z., Khan, S., Michaud, D. S., Shippy, S. A., Anisman, H. Does amygdaloid corticotropin-releasing hormone (CRH) mediate anxiety-like behaviors? Dissociation of anxiogenic effects and CRH release. European Journal of Neuroscience. 20 (1), 229-239 (2004).
- English, J. A., et al. Dataset of mouse hippocampus profiled by LC-MS/MS for label-free quantitation. Data in Brief. 7, 341-343 (2016).
- David, M. A., Tayebi, M. Detection of protein aggregates in brain and cerebrospinal fluid derived from multiple sclerosis patients. Frontiers in Neurology. 5, 251(2014).
- Oliver, C., Jamur, M. C. Immunocytochemical methods and protocols. Methods in Molecular Biology. , (2010).
- Spitzer, N., Sammons, G. S., Price, E. M. Autofluorescent cells in rat brain can be convincing impostors in green fluorescent reporter studies. Journal of Neuroscience Methods. 197 (1), 48-55 (2011).
- Knox, D., et al. Using c-Jun to identify fear extinction learning-specific patterns of neural activity that are affected by single prolonged stress. Behavioural Brain Researach. 341, 189-197 (2018).
- Knox, D., et al. Neural circuits via which single prolonged stress exposure leads to fear extinction retention deficits. Learning & Memory. 23 (12), 689-698 (2016).
- Malinow, R., Malenka, R. C. AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity. Annual Review of Neuroscience. 25, 103-126 (2002).
- Nabavi, S., et al. Engineering a memory with LTD and LTP. Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).
- Kimmelmann-Shultz, B., Mohammadmirzaei, N., Della Valle, R., Knox, D. Using high resolution near infrared imaging to measure fear-learning induced changes in AMPA/NMDA ratios throughout the fear circuit. The Annual Delaware Neuroscience Research and Poster Symposium, Newark, DE, , (2018).
- Eagle, A. L., et al. Single prolonged stress enhances hippocampal glucocorticoid receptor and phosphorylated protein kinase B levels. Neuroscience Research. 75 (2), 130-137 (2013).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
