יישום של ביואולייר אינטרפרומטריה (בלי) ללימוד אינטראקציות חלבונים-חלבונים בתמלול

סיכום

אינטראקציות של גורמי שעתוק (TFs) עם RNA פולימראז הם בדרך כלל לומדים באמצעות הנפתח assays. אנו מיישמים טכנולוגיה של ביואולייר אינטרפרומטריה (בלי) כדי לאפיין את האינטראקציה של GrgA עם לא RNA פולימראז. בהשוואה למטה מוסר, בלי מזהה בזמן אמת שיוך ודיסוציאציה, מציע רגישות גבוהה יותר, והוא כמותי מאוד.

תקציר

שעתוק מקדם (TF) הוא חלבון המסדיר ביטוי גנים על ידי אינטראקציה עם RNA פולימראז, אחר TF, ו/או DNA תבנית. GrgA הוא שעתוק הרומן activator נמצא במיוחד ב כלמידיה הפתוגן בקטריאלי תאיים . חלבון מתגלה באמצעות חרוזי אהדה חשפו כי GrgA נקשר שני גורמים σ, כלומר σ⁶⁶ ו σ²⁸, אשר מזהים קבוצות שונות של היזמים עבור גנים שהמוצרים שלהם נדרשים בשלבים התפתחותיים. השתמשנו בלי לאשר ולאפיין עוד את האינטראקציות. בלי מראה מספר יתרונות על פני הנפתח: 1) הוא חושף שיוך בזמן אמת והדיסוציאציה בין שותפי איגוד, 2) הוא מייצר פרמטרים קינטי כמותיים, ו 3) זה יכול לזהות איגודי כי לעתים קרובות נכשל לזהות. מאפיינים אלה אפשרו לנו להסיק את התפקידים הפיזיולוגיים של GrgA ברגולציה ביטוי גנטי בכלמידיה, ומנגנוני אינטראקציה מפורטים אפשריים. אנו מסוגלים לדמיין כי הטכנולוגיה הזולה יחסית יכולה להועיל מאוד ללימוד תמלול ותהליכים ביולוגיים אחרים.

מבוא

תמלול, אשר מייצרת מולקולות RNA באמצעות דנ א כתבנית, הוא השלב הראשון של ביטוי הגנים. סינתזה rna חיידקי מתחיל בעקבות איגוד של rna פולימראז (rnap) הולואנזים מיזם היעד^1,2. ההאנזים RNAP (RNAPholo) מורכב הליבה קטליטי רב subunit (RNAPcore) וגורם σ, אשר נדרש לזיהוי רצף היזם. שעתוק מפעילים וrepressors, כינה באופן קולקטיבי TFs, לווסת את ביטוי הגנים באמצעות רכיבי הכריכה של RNAPcore, σ גורמים, ו/או DNA. בהתאם האורגניזם, חלק משמעותי של הגנום שלה עשוי להיות מוקדש TFs המסדירים תמלול בתגובה לצרכים פיסיולוגיים ורמזים סביבתיים³.

כלמידיה היא חיידק מחייב תאיים האחראי על מגוון מחלות בבני אדם ובעלי חיים^4,5,6,7,8. לדוגמה, כלמידיה trachomatis היא ללא ספק הפתוגן מספר אחד המועבר באופן מיני בבני אדם ברחבי העולם, והגורם המוביל של עיוורון במספר מדינות לא מפותחות^4,5. לכלמידיה יש מחזור התפתחותי ייחודי המאופיין בשני טפסים סלולאריים מתחלפים הנקראת הגוף היסודי (EB) והגוף הפורש (RB)⁹. בעוד, בס מסוגלים לשרוד בסביבה מתוך מסחטות, הם אינם מסוגלים לשגשוג. בס להזין תאים מארחים באמצעות האנדוציטוזה ולהבדיל ל-RBs גדול יותר בתוך ולבן בציטופלסמה המארח בתוך שעות שלאחר החיסון. כבר לא מדבקת, ה-RBs מתרבים באמצעות ביקוע בינארי. בסביבות 20 h, הם מתחילים להבדיל בחזרה ל-בס, אשר יוצאים מתאי המארח סביב 30-70 h.

ההתקדמות של המחזור ההתפתחותי לא מוסדר על ידי תמלול. ואילו מרבית הגנים הלא כמעט 1,000 מבוטאים במהלך מחזור האמצע שבמהלכו משכפלים את ה-RBs באופן פעיל, רק מספר קטן של גנים מועתק מיד לאחר כניסת בס לתאי המחשב המארח כדי ליזום את ההמרה של בס לתוך ה-RBs, ועוד קבוצה קטנה של גנים משועתק או יותר ויותר משועתק כדי לאפשר את הבידול של ה-RBs לתוך הבס^10,11.

הגנום לא מקודד שלושה גורמים σ, כלומר σ⁶⁶, σ²⁸ ו σ⁵⁴. σ⁶⁶, אשר שווה ערך למשק הבית σ⁷⁰ של E. coli וחיידקים אחרים, הוא אחראי לזיהוי היזמים של מוקדם באמצע מחזור גנים, כמו גם כמה גנים מאוחרים, בעוד σ²⁸ ו σ⁵⁴ נדרשים עבור שעתוק הגנים המאוחרים מסוימים. כמה גנים ידועים לשאת הן מקדם σ⁶⁶התלוי ומקדם σ²⁸התלוי.

למרות מחזור התפתחותי מסובך, רק מספר קטן של TFs נמצאו ב chlamydiae¹³. GrgA (בעבר מסומן כחלבון היפותטי CT504 ב c. trachomatis serovar D ו CTL0766 בתוך c. trachomatis L2 ) הוא TF כלמידיה ספציפי מזוהה בתחילה כactivator של σ⁶⁶-גנים תלויים¹⁴. אהדה הנפתח בחני הוכיחו כי grga מפעיל את תמלול שלהם על ידי קשירה הן σ⁶⁶ ו-DNA. מעניין, מאוחר יותר נמצא עם זה GrgA גם מדגיש עם σ²⁸, ומפעיל תמלול מ σ²⁸-היזמים תלויי מבחנה¹⁵. כדי לחקור אם GrgA יש האפידוקשרים דומים או שונים עבור σ⁶⁶ ו-σ²⁸, אנו נקטו להשתמש בלי. בלי לספר הראו כי GrgA אינטראקציה עם σ⁶⁶ בזיקה גבוה 30-קיפול יותר מאשר עם σ²⁸, הרומז כי grga עשוי לשחק תפקידים דיפרנציאליות σ⁶⁶-תלוי שעתוק ו σ²⁸-שעתוק תלוי . ^{חמש עשרה}

בלי מזהה את תבנית ההפרעה של אור לבן המשקף מתוך שכבה של כריכת שכבות חלבון על קצה של ביוסנסור ומשווה אותו לזה של שכבת התייחסות פנימית¹⁶. באמצעות ניתוח של שתי דפוסי הפרעה אלה, לא ניתן לספק מידע חשוב ובזמן אמת על כמות החלבון המאוגד לקצה הביוסנסור. החלבון שאינו מתואם לקצה הביו-חיישן מכונה הליגים, והוא בדרך כלל מקובל בעזרת נוגדן משותף או תג אפיפי (לדוגמה, פולי-או ביוטין-תג) שיש לו זיקה לחלקיק משויך (כגון נ. ת. ע או Streptavidin) על קצה הביוסנסור. הכריכה של חלבון משני, המכונה האנליטה, עם הליגובקצה הביוסנסור יוצרת שינויים באטימות הביוסנסור ולכן גורמת לשינויים בדפוסי ההפרעות. כאשר חוזר על ריכוזים שונים של האנליטה, בלי לספק מידע איכותי אך גם כמותי על הזיקה בין ליגל ואנליטה¹⁶.

למיטב ידיעתנו, אנחנו היינו הראשונים להעסיק בלי לאפיין את האינטראקציות חלבון חלבון בתמלול¹⁵. בפרסום זה, אנו מדגימים כי רסיס GrgA, אשר הוצגה בעבר כדי להיות נדרש עבור σ²⁸-כריכה, אכן מדיה הכריכה. כתב היד הזה מתמקד בצעדים של "בלי הוראות", וביצירת גרפים ופרמטרים של הקינטיקה המחייבים. שיטות הייצור (וטיהור) של ליגטים ומנתחי מוצרים אינם מכוסים כאן.

פרוטוקול

1. הכנת חלבונים

1. השתמש שקית דיאליזה (עם גודל לגזור מתאים) כדי dialyze כל חלבון לשמש ללא מוסר (כולל גם את שלו-מתויג ליגנד האנליטה) נגד 1,000 כרכים של מאגר בלי (25 מ"מ Tris-HCl, 150 mm הנאליט, 0.1 mm edta, 10 מ"מ mgcl₂ , 0.1 מ"מ DTT, pH 8.0, מקורר עד 4 ° צ') ב 4 ° צ' עבור 4 h.
   הערה: ללא מוסר דורשים את ליגייט להיות נוכח בריכוזים כי לרוויה אתרי הכריכה על ביוסנסור ואת האנליטה להיות מטוהר מאוד כך הריכוזים הטוחנת של האנליטה הגיבו עם ליגאט ידוע. מתודולוגיות לביטוי ולטיהור של החלבונים שלו-ו-דלקת מתויג אינם מכוסים כאן, אבל ניתן למצוא בפרסומים הקודמים^14,15. למרות שמערכת זו אינה מחייבת את הליגולהיות בצורה מאוד מטוהרים, זה חיוני dialyze אפילו לא מטוהרים לפני המאגר כדי למזער את המשמרות בדפוסי הפרעות אור לבן הנגרמים על ידי שינויי מאגר במהלך העיבוד.
2. החליפו את הדיאליזה למאגר טרי והמשיכו ב-4 שעות.

2. הגדרת לחות ושיטת ביוסנסור

1. כ 10 דקות לפני תחילת התשובה, פיפטה 200 μL של מאגר בלי להיכנס לתוך צינור PCR.
2. הסירו את החלק הרחב של הביוסנסור בעזרת יד כדורית בעזרת האריזה המקורית של Ni-נ-ת-ביוסנסור.
3. מניחים את הביו-חיישן מעל ה-PCR-tube כך שרק קצה הזכוכית של הביוסנסור מתחת למאגר הבלי.
4. שמור את הקצה הביוסנסור שקוע לפחות 10 דקות כדי להבטיח הידרציה מלאה.
   1. ודא כי קצה הזכוכית של Ni-נ. א. ו-biosensor אינו נוגע בשום דבר אחר מאשר מאגר בלי הפרעה בשלב הנ ל.
      הערה: פרוטוקול זה משתמש בחיישן Ni-נ-ע-biosensor בשילוב עם ליגו-מתויג שלו. במקרה הצורך, ניתן להשתמש ב-SA-Streptavidin-biosensor בשילוב עם ligtinylated ובמקום זאת אם: (i) הן הליגוהן והאנליטה נושאות את התגית שלו או (ii) אף לא אחת מהן.
5. . תדליק את מכונת הבליץ
6. ודא שהמחשב מחובר למחשב באמצעות יציאת פלט נתונים מסוג USB בחלק האחורי של המחשב.
7. במחשב, לפתוח את התוכנה המשויכת (למשל, בליץ Pro), ולחץ על קינטיקה מתקדמת בצד שמאל של המסך.
8. בתוכנה, הקלד את כל המידע המתאים אודות הניסוי (כולל שם הניסוי, תיאור, מזהה המדגם וריכוז החלבון) תחת כל כותרת בהתאמה.
9. לחץ על סוג biosensor ולבחור Ni-נ. ת. ע מהתפריט הנפתח.
   1. תחת הכותרת הפעל הגדרות , ודא ששייקר מוגדר להפעלה.
   2. תחת הכותרת רשימת סוג שלב , ודא שקיימים 5 פריטים: תוכנית בסיסית ראשונית, טעינה, בסיסית, שיוך ודיסוציאציה.
      הערה: ניתן לשנות את משך כל שלב מברירת המחדל לפי הצורך. לקבלת תוצאות מיטביות, השתמש במינימום של 30 עבור תוכנית בסיסית ראשונית ותוכנית בסיסית; ו-120 s עבור האגודה והדיסוציאציה. משך שלב הטעינה (החל מ-120 עד 240 s) יהיה תלוי בריכוז הליפיגים והאהדה של התגית האפיליפית על ה ליגאס ולני-נ-ע-ביוסנסור.
10. הסר את הנוזלים Ni-נ. ו-ביוסנסור מן הצינור ה-PCR ולצרף אותו להר ביוסנסור על המכונה על ידי הזזת החלק הרחב של ביוסנסור על ההר.
    הערה: אל תתנו לביוסנסור להתייבש במהלך הניסוי.
11. מניחים שפופרת מיקרוצנטריפוגה שחורה 0.5 mL לתוך מחזיק הצינור של המכונה ופיפטה 400 μL של מאגר בלי להיכנס לתוכו.
12. ודא שמחוון המחשב ממוקם כך שמחזיק הצינור נמצא מול החץ השחור במחשב.
13. סגור את המכסה של המכונה כך הטיפ ביוסנסור הופך שקוע במאגר בצינור המיקרוצנטריפוגה.
14. לחץ על הבא בתוכנה כדי להתחיל בהקלטת תוכנית הבסיס ההתחלתית.

3. העמסה של ליגאל על ביוסנסור

1. לאחר שהשלב ההתחלתי של התוכנית הבסיסית סיים להקליט, פתח את המכסה של המחשב.
2. הזז את המחוון ימינה כך שמחזיק הפתיח (במקום בעל הצינור) ממוקם לפני החץ השחור.
3. פיפטה 4 μl של דיאליזה שלו-מתויג ליגנד (משלב 1.1) אל מחזיק המסירה ולסגור את המכסה של המכונה.
   הערה: הריכוז האופטימלי של הליגונים לשימוש עשוי להשתנות לכל חלבון. ריכוז בין 1.0 ל 2.0 mg/mL הוא בדרך כלל מספיק כדי לרוויה של נ. ת. ע בקצה של ביוסנסור ב 240 s.
4. בתוכנה, לחץ על הבא כדי להתחיל בטעינה.

4. שטיפת הליטרים נוספים

1. לאחר ששלב הטעינה סיים את ההקלטה, פתח את המכסה של המחשב.
2. הזז את המחוון שמאלה כך שמחזיק הצינורית שוב ממוקם לפני החץ השחור.
3. סגור את המכסה של המכונה וודא שהקצה הביוסנסור מחולק למאגר של הצינורית בתוך מחזיק הצינורית.
4. לחץ על הבא שוב בתוכנה כדי להתחיל בהקלטת התוכנית הבסיסית.

5. איגוד האנליטה ללידון

1. לאחר שהשלב הבסיסי סיים להקליט, פתח את המכסה של המחשב.
2. להסיר את מחזיק השחרור ולנקות אותו על ידי ליטוף כל חלבון ושטיפה אותו עם מים כפולים מיותר (ddH₂O) במשך סך של 5 פעמים.
   1. השתמש בניגוב רקמות כדי לנקות את פני השטח של מחזיק השחרור לאחר השטיפה.
3. הברג חזרה את מחזיק הפתיח למחשב.
4. הזז את המחוון במחשב לימין, כך שמחזיק השחרור ממוקם שוב מול החץ השחור.
5. פיפטה 4 μl של אנליטה דיאליזה (משלב 1.1) אל מחזיק הפתיח וסגור את המכסה של המכונה.
6. בתוכנה, לחץ על הבא לתחילת השיוך.

6. דיסוציאציה של אנליטה מ-ליגנד

1. לאחר ששלב השיוך סיים את ההקלטה, פתח את המכסה של המחשב.
2. הזז את המחוון במחשב לימין, כך שמחזיק הצינורית שוב ממוקם מול החץ השחור.
3. בתוכנה, לחץ על הבא כדי להתחיל את הניתוק.
4. לאחר שהשלב של הדיסוציאציה סיים את ההקלטה, פתח את המכסה של המכונה.
5. הסר את מחזיק הפתיח ואת מחזיק הצינור.
6. לשטוף את שניהם עם ddH₂ביסודיות כדי לשטוף את כל החלבון.
7. הסר את הביו-חיישן והשמט אותו בבטחה.

7. אינטראקציות חוזרות עם ריכוזים שונים

1. חזור על שלבים 2-7 עבור אותו זוג ליגו-אנליטה באמצעות ריכוזי אנליטה שונים.
   הערה: הריכוז של האנליטה עשוי להיות צורך לכוונן על פני מספר רצפים לפני קבלת תוצאות אופטימליות. בניסיון שלנו, יחס של 1:5:10 של ריכוזי אנליט, החל עם 75 nM, הוא בדרך כלל מספיק.

8. ניתוח הנתונים באמצעות התוכנה

1. לאחר סיום כל הרצפים, לשמור את הנתונים על התוכנה על ידי לחיצה על קובץ ולאחר מכן לשמור את הניסוי כמו בצד שמאל של המסך.
2. תחת הכותרת הפעל נתונים, בחר תיקון שלב והתאמה (1:1) ולחץ על ' נתח ' כדי ליצור נתונים קינטית.
3. כדי לחלץ את הנתונים הכמותיים לתוך גליון עבודה וליצור גרפים, לחץ על ייצוא ל-CSV ושמור את הנתונים המוקלטת כקובץ csv. פתח את קובץ ה-. csv באמצעות תוכנת גיליון אלקטרוני.
   1. כדי להציג בצורה האפקטיבית ביותר את הקינטיקה ' התאגדות ' ו'דיסוציאציה ', הסר את כל נקודות ההתוויה לפני השלב ' בסיסי ', ונרמל את כל נקודות ההתוויה העוקבות מהערך הבסיסי הסופי.

תוצאות

באמצעות בלי לספר, הקמנו בעבר כי איגוד של GrgA ל σ²⁸ תלוי 28 האזור האמצעי של חומצת אמינו (שאריות 138-165) של grga¹⁵. לפיכך, לעומת N-סופני שלו-מתויג באורך מלא GrgA (NH-GrgA), מחיקה GrgA לבנות חסר אזור זה (NH-GrgAΔ 138-165) היה שיעור השיוך ירד ושיעור הדיסוציאציה מוגברת, המוביל אובדן 3,000,000 מתקפל של הכולל אהדה (טבלה 1). כאן, אנו להדגים כי האזור האמצעי הזה מאגד ישירות σ²⁸ בהעדר שאר חלבון grga. בניסויים אלה, האזור האמצעי המתויג עם N-סופני שלו-tag (NH-GrgA138-165...

דיון

אינטראקציות חלבונים בחלבון הן חיוניות להסדרת התמלול ולתהליכים ביולוגיים אחרים. הם למדו בדרך כלל באמצעות מוסר. למרות מוסר היורד קל יחסית לבצע, הם כמותיים גרוע ועלול להיכשל לזהות משמעות חלשה אך ביולוגית אינטראקציות. לעומת זאת, על ידי גילוי שיוך בזמן אמת והדיסוציאציה בין ליגט לבין האנליטה, מספק הקשר וקבועים של שיעור הדיסוציאציה, כמו גם הזיקה הכוללת.

, בהשוואה לדבר הטוב ביותר. בלי הספק רגישות גבוהה יותר לדוגמה, grga-σ²⁸ אינטראקציות מזוהים עם ריכוזי nM נמוכה יותר של האנליטים על-ידי בלי א...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מכונת BLItz	ForteBio	45-5000
צינורות דיאליזה קרום תאית	MilliporeSigma	D9652
מגש ביו-חיישן Ni-NTA לטבול ולקרוא	ForteBio	18-5101	חיישנים ביולוגיים Ni-NTA מוכנים לשימוש עבור חלבונים מתויגים poly-His
, מחזיק טיפה	ForteBio	45-5004
צינורות PCR (0.2 מ"ל)	תומאס סיינטיפיק
CLS6571 צינורות מיקרוצנטריפוגה (שחור)	Thermo Fisher Scientific	03-391-166
Kimwipes	Thermo Fisher Scientific	06-666A
DTT	Thermo Fisher Scientific	R0861
EDTA	MilliporeSigma	E6758
MgCl2	MilliporeSigma	M8266
NaCl	MilliporeSigma	S9888
Tris-HCl	GoldBio	T095100