Method Article

באמצעות הזחלים Zebrafish ללמוד את ההשלכות הפתולוגיים של שבץ מדמם

DOI:

10.3791/59716

⸱

June 5th, 2019

 ,  ,  ,  , 
1Division of Neuroscience and Experimental Psychology, School of Biological Sciences, Manchester Academic Health Science Centre, University of Manchester, 2Division of Cardiovascular Sciences, School of Medical Sciences, Faculty of Biology, Medicine and Health, Manchester Academic Health Science Centre, University of Manchester, 3Lydia Becker Institute of Immunology and Inflammation, University of Manchester

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מציגים פרוטוקול לכמת פגיעה במוח, locomotor, ודלקות נוירודלקתיות בעקבות דימום במוח בזחלים דג זברה, בהקשר של דימום גרם האדם (השייך).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למרות שהוא תת-הסוג החמור ביותר של שבץ עם התמותה הגלובלית הגבוהה, אין טיפול ספציפי לחולים עם דימום גרם (העליונה). דוגמנות הקדם קלינית הוכיחה קשה, ומודלים מכרסם הנוכחי לכידה לקוי את האופי הספונטני של האדם העצמי. לפיכך, קיימת דרישה דחופה למתודולוגיות מקדם-קליניות חלופיות לחקר מנגנוני המחלות של הארגון ולגילוי סמים פוטנציאליים.

השימוש בדגי הדגים מייצג גישה פופולרית יותר ויותר לחקר הטרנסלטיסטית, בעיקר בשל מספר יתרונות בעלי מודלים של מחלות, כולל שיעורי רבייה פורה ושקיפות זחל המאפשר לחיות דמיה. קבוצות אחרות הקימו כי הזחלים דג זברה יכול להפגין הראש הספונטנית לאחר שיבוש גנטי או כימי של פיתוח מוחי. מטרת מתודולוגיה זו היא להשתמש במודלים כאלה כדי ללמוד את ההשלכות הפתולוגיים של דימום מוחי, בהקשר של מחקר מקדם קליני. על-ידי שימוש בהדמיה חיה ובתנועתיות מוסר, נזק מוחי, דלקות נוירודלקתיות ותפקוד locomotor בעקבות השימוש באמצעות היישום, ניתן להעריך ולכמת.

מחקר זה מראה כי ההשלכות הפתולוגית מפתח של דימום המוח בבני אדם נשמרים בזחלים דג זברה הדגשת האורגניזם מודל כמו ערך במערכת vivo לחקירה טרום קלינית של ה-it. מטרת מתודולוגיה זו היא לאפשר לקהילת החתירה הקדם-קלינית להעסיק את המודל הזחל של הדג כמערכת מודל אלטרנטיבית משלימה למכרסמים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גרם דימום (ה) הוא תת סוג חמור ביותר של שבץ הקשורים לקרע המוח הספונטנית של המוח ודימום לתוך מוביל הגורם לנזק מוחי, נכות פיזית ולעתים קרובות מוות1. למרות התמותה הגבוהה ושיעור התמותה הקשורים ל2, הבנה של האטיולוגיה התחתון והפתולוגיה שלאחר הדימום עדיין חסר. ככזה, אין טיפולים ספציפיים כדי למנוע את זה או לשפר את תוצאות המטופל. רוב ההבנה שלנו של ביולוגיה של המחלה הגיע מדגמי מכרסמים פרה-קליניים של כייך3, עם זאת מחקרים עד כה במודלים אלה לא הצליחו לתרגם כל טיפול מוצלח למרפאה4,5. כישלון זה עשוי לנבוע בחלקו, על מספר מגבלות של מודלים פרה-קליניים אלה, כולל חוסר יכולת ללכוד בקלות את האופי הספונטני של המחלה האנושית ואת הדרישה לניתוח פולשני כדי לייצר את המודלים של יונקים6. בנוסף, מכרסמים להוות בעיות מעשיות לגבי התבוננות התפרצות מהירה של תגובות הסלולר בתוך הרקמה השלמה. בהתחשב בחוסר התרגום מדגמי מכרסמים, פיתוח מודלים חלופיים של היחידה הספונטנית הוא הכרחי אם אנחנו להתגבר על הבעיות המעשיות האלה ולעזור לזהות מטרות התרופה הרומן.

המנגנונים המולקולריים של פיתוח כלי הדם נשמרים בקרב בעלי חוליות כולל בעלי-ממון (danio rerio)7. ככזה, אימוץ האורגניזם מודל זה הופך להיות אסטרטגיה מכניסטית יותר מועילה יותר עבור לימוד מחלת השדרתי8. מספר מודלים דג זברה שנוצרו אשר לכידה פנוטיפים הקשורים בתנאים הקשורים לשבץ9,10,11,12. השימוש של הזחלים דג זברה לחקור פתוגנזה מחלה מציע הן יתרונות מעשיים והן מדעיים על פני דגמי היונקים8. זה כולל שיעורי רבייה גבוהה, התפתחות מהירה ושקיפות זחל המאפשר הדמיה היפוטל ללא אילוצים פולשנית הקשורים מכרסמים. מצמד יתרונות אלה עם מגוון רחב של קווי הכתב הטרנסגניים הזמינים בתוך הקהילה המחקר דג זברה כמויות חזקות בגישה vivo לחקר ביולוגיה של המחלה, עדיין לא מנוצל לחקר פתולוגי השלכות של א. ל.

תגובת הפציעה לדם במוח היא biphasic13; העלבון העיקרי גורם מוות עצבי ונמק תא, אשר לאחר מכן יוזם גל משני של נזק הנגרמת על ידי הפעלה חיסונית מולדת. השלב השני של פגיעה במוח, במיוחד במרכיב הנוירודלקתי, נחשב יעד ריאליסטי לטיפול תרופתי בעתיד13. שטפי דם ספונטניים ומוחין מסוימים תוארו ב הזחלים דג זברה בעבר14,15,16,17,18,19. שני מודלים כאלה הם השימוש atorvastatin (טרקטורונים) ב 24 h לאחר הפריה (hpf) כדי לעכב את מסלול HMGCR וביוסינתזה כולסטרול14, ואת המוטציות (bbh) המוטציה אשר לבטא מוטציה hypomמורפית ב arhgef7 gene, βpix, ולאחר מכן מעכב אקטין שיפוץ עבור הצמתים הדוקה אנדוכלי דם18. מודלים אלה מציגים המוח הספונטנית מוחית ספציפי הקרע בדם בתחילת זרימת הדם (~ 33 hpf). לאחרונה, יש לנו לאפיין את המודלים האלה עוד כדי לגלות כי היבטים מרכזיים של התגובה לפגיעה במוח הוא שימור בין בני אדם והזחלים הדגים20. מחקר זה מדגים את המתודולוגיה הנדרשת כדי להשיג ולהמחיש דימום המוח ספונטנית של הזחלים דג זברה וכיצד לכמת את הפגיעה במוח, ו locomotor והפנוטיפים נוירודלקתיים המתייחסים למצב האנושי. הנתונים והטכניקות הללו תומכים בשימוש במינים מדגם זה כמערכת משלימה רבת ערך עבור מחקר מקדם קליני.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zebrafish הועלו והתוחזק ביחידת השירותים הביולוגיים של אוניברסיטת מנצ תחת תנאים סטנדרטיים כפי שתוארו בעבר21. בוגרים גידול דגים אושרה על ידי אוניברסיטת מנצ בעלי חיים רווחה וביקורת אתית הלוח. כל הניסויים בוצעו בהתאם לתקנות הבית בבריטניה (PPL: P132EB6D7).

הערה: הקווים הטרנסגניים המשמשים במחקר זה כוללים מקרופאג mpeg1 היוחסין הספציפיים :mcherry (נבנה ב-הבית כפי שתיאר קודם לכן22), נויטרופילים ספציפי mpo:gfp23,אריתרופואיד ספציפי gata1: ה-dsred24 ו- אוביq:סנאקסיב-מוונוס, כתב למוות תאים (נגזר מחדש בבית25)על מסוג פראי, הנארה (mitfaw2/w2) ו-חשבונאי (צאתןm292) רקעים. איור 1 מציג את ציר הזמן הנסיוני.

figure-protocol-1
איור 1 : גרפיקה של ציר הזמן ניסיוני לאפיון פגיעה מוחית, locomotor ותוצאות נוירודלקתיות. גרם; . בסדר. האיור שוחזר מ-"כריסטו ואח '" עם אישור תחת רישיון קריאייטיב מלאי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. 

1. יום 0: ייצור ביצים ואוסף

  1. לאסוף עוברים מופרית מההשמה הטבעי בתיבות רבייה המיוצר מ 1 זכר ו 1-2 נקבה zebrafish מבוגרים.
    הערה: עבור פרוטוקול atorvastatin כל סוג מחיה/הטרנסגניים בעלי חיים ניתן להשתמש אך תעריפי הדימום שונים מעט בין זנים.
  2. מודטה 100 עוברים ב 28 ° צ' בממוצע בינונית העובר E3 לצלחת פטרי והבמה לפי קווים מנחים סטנדרטיים26.
  3. ב ~ 6 שעות הפריה פוסט (hpf) להסיר עוברים מתים ובלתי מופרות מן התבשיל באמצעות פיפטה פסטר.

2. יום 1: Atorvastatin טיפול at 24 hpf

  1. עוברים deatorvastatin onate לטיפול באמצעות מלקחיים חדה במיוחד לחיתוך דק27. ניתן לכוונן בהתאם את המספרים הדרושים לניסויים.
  2. הוסף 30 מ ל של E3 העובר בינוני לשתי מנות פטרי נקיות. השתמש במנה אחת עבור 100 עוברים.
    הערה: אם לוחיות הרישוי מיועדות לתרבות התאים, בשלב מוקדם זה לעתים קרובות נדבקים לתחתית. כדי למנוע זאת, לשטוף את הצלחות ביסודיות במים נקיים לפני השימוש.
  3. הסר 60 μL של מים העובר מצלחת הטיפול ולהוסיף 60 μL של 0.5 mM atorvastatin (טרקטורונים). בריכוז מניות 0.5 מ"מ, הדילול הנ ל יגרום לריכוז הסופי של 1 μM אשר יגרום ל-~ 20% של הזחלים ללא שטפי דם (הקצה-) ו-~ 80% של הזחלים מדימום (כיום +). השתמש בלוח השני עבור פקדים לא מטופל
    הערה: Atorvastatin הוא מסיסות במים מזוקקים (3 מ"ג לתוך 10 mL) כדי לבצע פתרון מלאי 0.5 mM. דגירה לילה בטמפרטורת החדר בחושך עם עצבנות כמו מסיסות לוקח קצת זמן. פתרונות משלימים יכולים להימשך עד שבוע אחד. אין להשתמש ב-DMSO. הפתרון מצוטט ומאוחסן ב-20 ° c. אל תקפיא את ההפשרה.
  4. באמצעות הפיפטה פסטר, העברת 100 עוברים בתוך מים קטנים ככל האפשר ללוחות הטיפול.
  5. מודאת הצלחות ב -28 ° c.
    הערה: הת תתרחש בין 33 ל-48 hpf. Atorvastatin אינו צריך להיות מוסר כמו דגירה יותר מ -24 h אינו גורם לבעיות התפתחותיות נוספות.

3. יום 2: הפרדת האוכלוסיה בת וב50

  1. הפרידו את הדגים מתוך האוכלוסייה והעבירו אותם למנות חדשות בקלות.
    1. אם באמצעות מודל טרקטורונים בריכוז של 1 μM, 75-100% של הזחלים יהיה דימום (הקצה +) בשלב זה.
      הערה: תגובת הזחלים שונה בין זנים, אם הזחלים אינם דימום בתדרים הרצויים, להשתמש באצווה טרייה של atorvastatin או ריכוז גבוה יותר. אם הזחלים לא הציגו דימום על ידי 48 hpf אז לשקול אותם כלפי הוראות.
    2. אם באמצעות מודל צאתן, כל המוטציות homozygous יהיה דימום על ידי 48 hpf. אם באמצעות שימוש heterozygous incross, אחים heterozygous ומסוג wildtype ניתן להשתמש בעלי חיים שליטה עבור ניסויים.
  2. במקרה הצורך, ההרדים את הזחלים על-ידי הוספת 0.02% MS222 למדיית E3. באמצעות פיפטה פסטר, מיין את הזחלים לנוכחות דם בראש לתוך מדיית E3 טרייה. ראה איור 2.
    הערה: דם בראש עשוי להופיע בפני המוח, באמצע או העורף או בשילוב, ונפח הבליד יכול להשתנות בין בעלי חיים. במוטציות צאתן מקושרת לעתים קרובות עם בצקת חריפה לזיהוי ראשים גדולים יותר, מרחב רחב יותר בין העיניים לדימום מפוזר יותר. עם זאת לא כל הזחלים האלה + צאתן מציגים בצקת.

figure-protocol-2
איור 2 : זה + המוח דימום פנוטיפים. דוגמאות של זחל פנוטיפים של ת א שמרו על הgata1 הטרנסגניים: העיתונאי DsRed ברקע נצפה עם ברייטפילד stereomicroscope (לוחות העליון) ו הפלואורסצנטית (הפאנל התחתון) ב ~ 48 h הפריה פוסט. לא נצפו שום דימום בתוך הזחלים (לוחות שמאל). הצטברות ברורה של כדוריות הדם האדומות במוח הקדמי והמוח התחתון (חיצים) נצפו בתוך הזחלים האלה + (פאנלים מימין). סרגלי קנה מידה מייצגים 250 μm. האיור שוחזר מקרילי ואח '20 עם אישור תחת רישיון Creative commons. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. 

4. יום 3: מוות תאים וניתוח לוקיציט ב 72 hpf

  1. מיסוך הזחלים באמצעות מיקרוסקופ ניאון כדי להבטיח את הביטוי של חלבון פלורסנט.
    הערה: במחקר זה, הזחלים הטרנסגניים: שימשו לדיווח על מוות תאי המוח וכפול טרנסגניים mpo: gfp; mpeg1: מצ או אוביq: סקונשין קסיב-מוונוס; mpeg1: מ דובדבן המשמש לניתוח לוקיציט.
  2. מילוי חדר ההרכבה של האור עם E3 מדיה המכיל 0.02% MS222.
  3. הרדים הזחלים באמצעות 0.02% MS222. העברת זחלים להרכבה (n = 1-6) למשטח של צלחת פטרי יבש ב-droplet אחת. הסר ככל האפשר את הכמות הנוזלית.
    הערה: 1.5% נמוך להמיס agarose מוכן באמצעות 0.15 g של ממיסים נמוך להמיס מומס 10 מ ל של E3 בינוני ללא מתילן blue במיקרוגל ושמרו על 45 ° צ' עד השימוש.
  4. הוסף טיפה של 1.5% נמוך להמיס (מתוחזק כנוזל בבלוק של 45 ° c) על הזחלים ובאמצעות 800 יקרומטר הרכבה קפילר, ולמשוך את הזחלים הראש הראשון. אם המיקום אינו מדויק, ניתן לסלק את הזחלים מהאגקם ולרכוב שוב. להשאיר את הנימים להתקרר לפני החדרת לתא האור.
    הערה: לחלופין, ניתן להשתמש במיקרוסקופ מוקד לפרוצדורה זו. בשביל זה, הזחלים צריכים להיות מותקן מתחת לפני הזכוכית על הצלחת התחתונה בחלון.
  5. לרכוש z-מחסנית תמונות של הראש בין עדשות העין (~ 300 μm) ולעבד את התמונה בעוצמה מקסימלית ההקרנה.
    1. לנתח את אזור המוח מתמונות שנאספו עבור מספר כולל של תאי פלורסנט ועוצמה מוחלטת של הזריחה20.
  6. ליצור וידאו פקיעה זמן של הקרנה מרובים על 18-24 h כדי לעקוב אחר ניידות לוקיציט ואינטראקציה עם תאים גוססים.
    הערה: אם מבוצעת הדמיה חיה לטווח ארוך, רק זחל אחד מותקן בקפילר.
  7. כאשר הדמיה מסתיימת לגרש את הזחלים מן הקפילר לתוך מנת יתר קטלנית של 4% MS222 כדי המתת חסד.

5. יום 3: בחירת הזחלים לצורך תנועתיות ב 72 hpf

  1. הרדים הזחלים בצלחות פטרי עם 0.02% MS222.
  2. באופן אקראי לבחור n = 24 הזחלים לצורך תנועתיות ולהעביר לתוך מדיה E3 חדש ולאפשר לבעלי חיים להתאושש הרדמה.
    הערה: הרדמה בשלב זה מסיר הטיית בחירה עבור שחיינים איטיים קלים לתפיסה.

6. יום 3-5: Assaying ב 72, 96 ו120 hpf

  1. הזחלים העברה שנבחרו ב 72 hpf לתוך E3 בינוני ללא מתילן כחול.
    הערה: בשביל לומר ב 3 dpf לאפשר הזחלים מספיק זמן כדי להתאושש הרדמה (> 1 h).
  2. צלחת אחד זחל ב 1 מ ל לכל באר של 24 הבאר באמצעות פיפטה.
    הערה: חותכים את קצה הפיפטה כדי להימנע מפגיעה בזחלים. גודל צלחת ניתן לשנות בהתאם לעיצוב ניסיוני.
  3. לטעון את הצלחות לתוך חדר המצלמה ואת התנועה שיטת הפעולה 10 דקות באמצעות אור לבן שיגרה להבהיל כדי להגביר שחייה ספונטנית.
    הערה: מעקב אחר התנהגות שחייה באמצעות תא מצלמה ותוכנת מעקב (עיין בטבלת החומרים).
  4. חזור על הניסוי עם הזחלים אותו ב 96 ו 120 hpf. הזיזו את הזחלים מהדיור הפרטי בלוח התיתינה לצלחת פטרי ומשם ב -28 ° c בין העשור.
  5. . במנת יתר קטלנית של 4% MS222

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערכה של מוות בתאי המוח באמצעות הטרנסגניים אוביq:secאנסי xinv-mvenus התוצאות אשכולות ברורים של תאים מתים בתוך הזחלים השני בטרקטורון ומודלים צאתן כי נעדרים כל הזחלים של ת. א. (איור 3). אשכולות נסוגים לפני 96 hpf. באמצעות ניתוח תמונה, דימום קשורה לעלייה משמעותית שתי קיפול בעוצמה מוחלטת של אות הזריחה במוח, המציין מוות תאים מסומן.

תגובה נוירודלקתית מזוהה ב-הזחלים האלה + על ידי מספר גדל באופן משמעותי של תאים מקרופאג mpeg1 חיוביים במוח. מספר התאים mpo חיוביים סך הכול גם גדל עם זאת לא להגיע משמעות סטטיסטית (איור 4). את המבנה של מקרופאגים mpeg1 חיוביים ניתן לראות גם כדי לשנות את הזחלים האלה + התאים לאמץ פעיל, מעוגל, הצורה אמבות. תאים מעוגלים אלה הופעלו יכול להיות גם פיקוח על הזמן כדי להראות תגובה phagocytic מוגברת של אוביq:sec, קסינווי-mvenus ביטוי תאים גוססים בתוך הזחלים (איור 5). mpeg1 מקרופאגים חיוביים המציגות תהליכים מ היו מסווגים כלא פעילים.

דימום המוח משויך ירידה משמעותית בתנועתיות ב 72 ו 96 hpf בהשוואה לפקדי האחים האחרים בשני צאתן ו טרקטורונים מודלים (איור 6). תנועתיות ב 120 hpf משחזרת לרמות בסיסית בקרבת מפלס. לעתים קרובות יש הבדלים בתנועתיות הבסיס בין מצמדי ביצים וזנים ולכן יש לעשות זאת באמצעות שליטה בכל פעם.

figure-results-1
איור 3 : דימום גרם (ת א) ב הזחלים דג זברה התוצאות לפגיעה במוח ככמת. (א) דמויות מייצגות של פגיעה במוח פנוטיפ בתוך הזחלים (לוחות מימין), בהשוואה ל-"האחים האחרים" (לוחות שמאל), ב 72 hpf. ברייטפילד תמונות (לוחות התחתון, סרגל קנה מידה = 250 μm) להפגין נוכחות של המוח בלידים (חיצים) בתוך הזחלים האלה +. מיקרוסקופ פלורסנט בוצע כדי להמחיש מוות התא ב- אוביq:שורת הכתב הראשי של העיתונאי (לוחות עליונים, סרגל קנה מידה = 100 μm). אשכולות של תאים מתים נצפו באזורים פרי-המטאואל. תמונות נחתכו לאזורים מוחית בלבד ונותחו עבור עוצמת הקרינה הירוקה הכוללת בחלקיקים עגולים גדולים יותר מ-30 פיקסלים בקוטר (קו לבן) באמצעות המאקרו בקובץ משלים 1. (ב) כימות של האות הפלואורסצנטית במוחם של מטופל, הזחלים של החברה השנייה והשנייה השיגו דרך מודל טרקטורונים (n = 12 לכל קבוצה; 3 משכפל עצמאי) ב 72 hpf. הבדלים משמעותיים נצפו בעת השוואת ת א + עם מטופל (* * p = 0.004) ו עם ת-(* p = 0.03) אחים. (ג) כימות של האות הפלואורסצנטית כקריאה עבור מאגד מסוג אנקסיב במוחם של הזחלים של הקצה השני והשני הרימות שהתקבלו דרך המודל (bbh) (n = 12 לכל קבוצה; 2 משכפל עצמאי) ב 72 hpf. גרפים מציגים SD מן הממוצע. ההבדל המשמעותי ביותר של הקרינה הפלואורסצנטית של mVenus נצפתה בין האחים האלה + ו-כלפי מעלה-גיל (* * p = 0.002). האיור שוחזר מ-"כריסטו ואח '" עם אישור תחת רישיון קריאייטיב מלאי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 4 : גרם דימום (ה) מאתחל תגובה חיסונית מולדת הסלולר במוח זחל של דג דג זברה. מספרים של כימות לוקיציטים בתוך אזורי המוח שתוארו בעבר עבור mpo: GFP; mpeg1: הזחלים כפולים הטרנסגניים הכפולה (n = 8 לכל קבוצה; 2 משכפל עצמאי) ב 72 hpf חושף גידול משמעותי מקרופאגים (* p = 0.01), אבל לא נויטרופילים (p = 0.5), בתגובה לייך. האיור שוחזר מ-"כריסטו ואח '" עם אישור תחת רישיון קריאייטיב מלאי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. 

figure-results-3
איור 5 : תאים מקרופאג מופעל להראות תגובת phagocytic לנגע במוח. (א) נציג הזמן לפקיעה תמונות סטילס20 מראה ממקרופאג המסיירים מעביר לעבר תא חיובי של אנקסיב (i-vi). צילומי סטילס מתקבלים מסדרה של תמונות שצולמו של המוח כולו באמצעות מטרה 20x. סרגל קנה מידה מייצג 50 μm. המקרופאג רכשה מורפולוגיה אמבות (v) לפני הפצרות את התא החיובי של אנקסיב (vi, vii). לאחר phagocyציטוזה המקרופאג מחדשת את המבנה המבוקר ומתרחק ואת התא החיובי של ה-, לא ניתן עוד לראות (viii). מקרופאג מעשה מצוין (), תא חיובי של התאים (), האמבות מקרופאג (*) מצוינים. (ב) תמונות מייצגות של תאים חיוביים במוח הmpeg1 ובראש הזחל מציג אמבות ומורפולוגיות מרמידים. סרגלי קנה מידה מייצגים 50 μm. (ג) חלק מוגבר של אמבות (phagocytic) ושיעור ירידה של מקרופאגים (לא פעיל) שנצפו במוחות של הבנק האמריקאי בהשוואה לאחים. האיור שוחזר מ-"כריסטו ואח '" עם אישור תחת רישיון קריאייטיב מלאי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. 

figure-results-4
איור 6 : פגיעה במוח הנגרמת כתוצאה. מגרעון locomotor לכימות בזחלים (א) דוגמאות מייצגות למסלולי השחייה בתוך הזחלים של הספר הטוב ביותר ב-72, 96 ו120 hpf. (ב) ו הזחלים הציגו ירידה משמעותית בזמן המצטבר שהושקע במהלך 10 דקות הקלטה בשני 72 ו 96 hpf. המשמעות אבדה בנקודת הזמן 120 hpf העלולה להצביע על התאוששות מפגיעה במוח (n = 24 הזחלים לקבוצה; 3 משכפל בלתי תלוי; * * * * p = 0.00006; * * p = 0.003; ns: p = 0.08). (ג) כימות הזמן המצטבר שהושקע במעבר בלתי מטופל וטרקטורונים שטופלו באמצעות הזחלים האלה-ו-הקצה האחר מטופלים ב 120 hpf. הרימות הללו + הזחלים הציגו ירידה משמעותית בזמן המצטבר שהושקע במהלך 10 דקות הקלטה. שלושה משכפל טכני (n = 24 הזחלים לכל קבוצה) שימשו כדי לחשב SD מן הממוצע (* * * p = 0.00004, * * p = 0.0003). האיור שוחזר מ-"כריסטו ואח '" עם אישור תחת רישיון קריאייטיב מלאי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. 

קובץ משלים 1. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מראה כי בשנת הזחלים של הדגים בזברפיש מעורר תגובה לפגיעה במוח המהווה את ההיבטים המרכזיים של המצב האנושי שניתן להפרכה בשיטתיות ולכמת. Zebrafish מציעים מודל עקבי ומושתל של הח הספונטנית אשר תסייע עם מחקרים בעתיד התערבות הסמים התמקדו במיקוד פציעה במוח המושרה בדם, במקום למנוע קרע הספינה17,28. ואכן, בהתחשב באופי המהיר של התפרצות המחלה הדומה למצב הקליני, גישה כזו מציעה הזדמנויות מלהיבות לתרגום מוצלח בעתיד.

מספר מגבלות משויכות לשימוש בזחלים של דגי הדגים, כגון שימוש במערכת מתפתחת ובדרגת מטקמי, אך היתרונות המעשיים והמדעיים של מודל זה חייבים להיחשב לתובנות חדשות בנוגע ל. שום ניתוח אינו נדרש ליזום דימום או לנטר תהליכים סלולריים במשך פרקי זמן ארוכים לאחר הפציעה. פוריות גבוהה של זיווגים דגים ליצור בקלות ונגישים בגדלים גדולים, ובגלל התפתחות מהירה של הזחלים ציר הזמן ניסיוני מופחת באופן משמעותי לעומת מחקרים מכרסמים29,30.

כיום, המודלים האלה מתאימים להסבר מיידי להבעת התגובה הפתולוגית והחיסונית המיידית לתוך המוח הספונטני במוחו של חיות שלמות. באופן פוטנציאלי, מודל זה יכול להיות מותאם עבור מסכי סמים בינונית-גבוהה התפוקה עבור טיפולים בנושא, אם מניעה או שחזור קידום. ככזה, הפתווגיות פוסט-האלה שהוצגו במחקר זה מייצגים פלטפורמה חלופית, משלימה עבור מחקר ה-it קליני מראש.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוני להודות לד ר דוד ספילר ולמרכז הליבה של מיקרוסקופ מערכות של אוניברסיטת מנצ לשימוש בציוד, פרופ ' ריצ'רד ביינס לשימוש ב דניאוז'ן וד ר ג'ק ריברס-אאוטי להתייעצות סטטיסטית. הקו צאתן שיתף באדיבות ניקול munsie מן המעבדה של ד ר שרה הילד באוניברסיטת קלגרי. אנו מודים גם לפרופ ' סטפן רנשו, ד ר אדם הורסטון, ד ר אנדרו בדרוק וד ר הלן יאנג לקווי דגים וציוד.

מחקר זה היה נתמך על ידי NC3Rs (NC/N002598/1), האגודה לשבץ (2017/02 השמש LECT), ERA-NET עצב (מר/M501803/1) ואת קרן הלב הבריטי (FS/15/67/32038). אנחנו גם אסירי תודה במיוחד לקרן נטלי קייט מוס והפקולטה לביולוגיה של אוניברסיטת מנצ, רפואה ובריאות עבור המשך התמיכה הכספית שלהם.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
24 צלחות בארסיגמא-אולדריץ'CLS3527
28 & deg; חממת CLMS210
AtorvastatinSigma-AldrichPZ0001-5mg
קופסאות גידולThoren Aquatics systems10011
תא תצפית DaniovisionNoldusn/a
E3 בינוני 1x4% Instant Ocean, 500 ומיקרו; L מתילן כחול ב 1 ליטר dH2O
תוכנת EthoVision XTNoldusגרסה 11
בלוק חוםGrant-BioPHMT-PSC18
Instant oceanInstant OceanSS15-10
מיקרוסקופ גיליון אורZeissZ.1
מיקרוסקופ גיליון אור הרכבה נימיZeiss402100-9320-000
נמס נמוך אגרוזPromegaV2111
מתילן כחולסיגמא-אולדריץ'319112-100ML
מיקרוסקופ מיקרוסקופ דיסקציהLeicaMZ95
מיקרוסקופLeicaM165FCמיקרוסקופ פלואורסצנטי
MS2224 גרם אבקת טריקאין, 500 מ"ל של dH2O, 10 מ"ל של 1 M Tris (pH 9). התאם את ה-pH ל-~7
פיפטה P1000קצות
P1000 StarlabS1122-1830
פיפטות פסטרStarlabE1414-0300
צלחות פטרי Corning101VR20
PipetboyIntegra BiosciencesPIPETBOY
Stripette 25 מ"לאבקת CLS3527
טריקאיןSigma-AldrichA5040-25G
Tris BaseFisher BioReagentsBP152-1
מלקחיים דקים במיוחדAgar ScientificAGT502
תוכנת ZenZeissגרסה 2.3
פיפטה גילסון F144059M קורנינג

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. An, S. J., Kim, T. J., Epidemiology Yoon, B. W. Epidemiology, risk factors, and clinical features of intracerebral hemorrhage: an update. Journal of stroke. 19 (1), 3(2017).
  2. WHO. The top 10 causes of death. , http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs310/en/ (2017).
  3. Casals, J. B. The use of animal models for stroke research: a review. Comparative medicine. 61 (4), 305-313 (2011).
  4. Kellner, C. P., Connolly, E. S. Neuroprotective Strategies for Intracerebral Hemorrhage Trials and Translation. Stroke. 41 (10 Suppl 1), S99-S102 (2010).
  5. Kirkman, M. A., Allan, S. M., Parry-Jones, A. R. Experimental intracerebral hemorrhage: avoiding pitfalls in translational research. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (11), 2135-2151 (2011).
  6. ASPA. 1986 amendments. , (2012).
  7. Butler, M. G., Gore, A. V., Weinstein, B. M. Methods in cell biology. 105, Elsevier. 137-161 (2011).
  8. Walcott, B. P., Peterson, R. T. Zebrafish models of cerebrovascular disease. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 34 (4), 571-577 (2014).
  9. Liu, C. Macrophages mediate the repair of brain vascular rupture through direct physical adhesion and mechanical traction. Immunity. 44 (5), 1162-1176 (2016).
  10. Kasher, P. R. Characterization of samhd1 morphant zebrafish recapitulates features of the human type I interferonopathy Aicardi-Goutieres syndrome. The Journal of Immunology. 194 (6), 2819-2825 (2015).
  11. Wen, J. Mutation of rnf213a by TALEN causes abnormal angiogenesis and circulation defects in zebrafish. Brain research. 1644, 70-78 (2016).
  12. Eisa-Beygi, S., Rezaei, M. Etiology of intracerebral hemorrhage (ICH): novel insights from Zebrafish embryos. International Journal of Developmental Biology. 60 (4-5-6), 119-126 (2016).
  13. Mracsko, E., Veltkamp, R. Neuroinflammation after intracerebral hemorrhage. Frontiers in cellular neuroscience. 8, 388(2014).
  14. Eisa-Beygi, S., Hatch, G., Noble, S., Ekker, M., Moon, T. W. The 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase (HMGCR) pathway regulates developmental cerebral-vascular stability via prenylation-dependent signalling pathway. Developmental biology. 373 (2), 258-266 (2013).
  15. Shen, M. Discovery of Rho-kinase inhibitors by docking-based virtual screening. Molecular BioSystems. 9 (6), 1511-1521 (2013).
  16. Huang, B. Tanshinone I prevents atorvastatin-induced cerebral hemorrhage in zebrafish and stabilizes endothelial cell-cell adhesion by inhibiting VE-cadherin internalization and actin-myosin contractility. Pharmacological research. , (2017).
  17. Li, S. Discovery of a ROCK inhibitor, FPND, which prevents cerebral hemorrhage through maintaining vascular integrity by interference with VE-cadherin. Cell death discovery. 3, 17051(2017).
  18. Liu, J. A βPix-Pak2a signaling pathway regulates cerebral vascular stability in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (35), 13990-13995 (2007).
  19. ten Klooster, P. J., Jaffer, Z. M., Chernoff, J., Hordijk, P. L. Targeting and activation of Rac1 are mediated by the exchange factor β-Pix. The Journal of cell biology. 172 (5), 759-769 (2006).
  20. Crilly, S. Using zebrafish larval models to study brain injury, locomotor and neuroinflammatory outcomes following intracerebral haemorrhage. F1000Research. 7, (2018).
  21. Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish. , http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html (2000).
  22. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).
  23. Renshaw, S. A. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
  24. Traver, D. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nature immunology. 4 (12), 1238(2003).
  25. Morsch, M. In vivo characterization of microglial engulfment of dying neurons in the zebrafish spinal cord. Frontiers in cellular neuroscience. 9, (2015).
  26. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  27. Liang, J. O. Zebrafish in the Classroom. , http://www.zfic.org (2011).
  28. Yang, R. Miconazole protects blood vessels from MMP9-dependent rupture and hemorrhage. Disease Models & Mechanisms. 10 (3), 337-348 (2017).
  29. Andaluz, N., Zuccarello, M., Wagner, K. R. Experimental animal models of intracerebral hemorrhage. Neurosurgery Clinics of North America. 13 (3), 385-393 (2002).
  30. Rosenberg, G. A., Mun-Bryce, S., Wesley, M., Kornfeld, M. Collagenase-induced intracerebral hemorrhage in rats. Stroke. 21 (5), 801-807 (1990).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Zebrafish LarvaeHemorrhagic StrokeIntracerebral HemorrhageLive ImagingMotility AssayBrain HemorrhageNeuroinflammationFluorescent MicroscopyAtorvastatin TreatmentEthoVision XT

Related Articles