כירורגיה של חוט השדרה הLocomotor הניתוח והערכה פתוחה בשדה החזה בעכברוש

סיכום

הטיפול בעמוד השדרה של החולדה הוא מודל רב ערך ומשחזר של פגיעה חד-צדדית בחוט השדרה כדי לחקור את המנגנונים העצביים של locomotor התאוששות ויעילות הטיפול. מאמר זה כולל מדריך מפורט של שלב אחר שלב לביצוע הליך החצייה ולהערכת ביצועים locomotor בזירה בשטח פתוח.

תקציר

פגיעה בחוט השדרה גורמת להפרעות בתפקוד המוטורי, החושי והאוטונומי מתחת לרמת הנגע. דגמי בעלי חיים ניסיוניים הם כלים יקרי ערך כדי להבין את המנגנונים העצביים המעורבים בשחזור locomotor לאחר SCI ולעצב טיפולים לאוכלוסיות קליניות. ישנם מספר מודלים של SCI ניסיוני, כולל החבלה, דחיסה, ופציעות רוחבי המשמשים במגוון רחב של מינים. החצייה כרוכה בחתך חד צדדי של חוט השדרה ומשבשת את כל העולים ויורדים על צד אחד בלבד. הפגיעה בעמוד השדרה מייצרת פציעה סלקטיבית ובררנית מאוד בהשוואה לשיטות החבלה או הדחיסה שהיא שימושית לחקירת הפלסטיות העצבית במסלולים שנפגעו וניזוקו הקשורים להתאוששות תפקודית. אנו מציגים פרוטוקול צעד אחר צעד מפורט עבור ביצוע הT8 בית החזה ברמה החוליות של בחולדה כי התוצאה שיתוק הראשונית של הנגע בצד של הפצע עם התאוששות ספונטנית מדורגת של locomotor פונקציה על מספר שבועות. אנו מספקים גם פרוטוקול locomotor הבקיע להערכת התאוששות תפקודית בשדה הפתוח. הערכה locomotor מספקת פרופיל התאוששות לינארית ניתן לבצע הן מוקדם יותר ושוב לאחר הפציעה כדי להתאים במדויק בעלי חיים עבור נקודות זמן מתאים שבו לבצע בדיקות התנהגותיות מיוחדות יותר. טכניקת הזיהום הציג ניתן להתאים בקלות מודלים אחרים רוחבי ומינים, ואת הערכה locomotor ניתן להשתמש במגוון של SCI ומודלים פציעה אחרים כדי להבקיע פונקציה locomotor.

מבוא

פגיעה בחוט השדרה (SCI) קשורה להפרעות חמורות בתפקוד המוטורי, החושי והאוטונומי. מודלים ניסויים בעלי חיים של SCI הם כלים יקרי ערך כדי להבין את האירועים האנטומיים והפיסיולוגיים המעורבים ב-SCI פתולוגיה, כדי לחקור את המנגנונים העצביים תיקון והתאוששות, ועל המסך עבור יעילות ובטיחות של טיפול פוטנציאלי תערבויות. העכברוש הוא המינים הנפוצים ביותר במחקר SCI¹. מודלים חולדה הם בעלות נמוכה, קל להתרבות, ו סוללה גדולה של בדיקות התנהגותיות זמינים להעריך את התוצאות תפקודית². למרות כמה הבדלים מיקומי בדרכי, חוט השדרה העכברוש משתף פונקציות דומות sensorimotor דומה עם יונקים גדולים יותר, כולל פרימטים^3,4. חולדות גם לחלוק השלכות פיסיולוגיים והתנהגותיים של SCI המתייחסים לבני אדם⁵. פרימטים לא אנושיים ודגמי בעלי חיים גדולים יכולים לספק הערכה מקרוב יותר של SCI^-6 והינם חיוניים להוכחת בטיחות ויעילות הטיפול לפני ניסויים אנושיים, אך משתמשים בהם פחות בגלל הרווחה האתית והחיה שיקולים, הוצאות ודרישות רגולטוריות⁷.

ההמרה עכברוש מודלים SCI מבוצעים על ידי הפרעה ממוקדת של חוט השדרה עם נגע סלקטיבי באמצעות סכין לחיתוך או מספריים iridectomy לאחר כריתת למינציה. לעומת רוחבי מלאה, הטרנס חלקית התוצאות החולדה בפציעה חמורה פחות, טיפול בבעלי חיים קלה יותר, התאוששות locomotor ספונטנית, והדוק יותר מודלים SCI בבני אדם אשר לא שלם באופן חלקי עם חוסך חלקית של רקמה המחברת את חוט השדרה ואת המבנים הסופרעמוד⁸. הדלקת המעי החד מפריעה לכל העולה ויורדת על צד אחד בלבד, ומייצרת locomotor גרזמים מיוניתן לכימות ומאוד, שיפור החקירה של המנגנון הביולוגי הבסיסי. התוצאה התפקודית הבולטת ביותר של ההאחריכת הוא שיתוק הגפיים הראשונית באותו צד ומתחת לרמה של הנגע עם התאוששות ספונטנית מדורגת של locomotor פונקציה במשך מספר שבועות^9,10, מיכל בן ^{11 , 12}. דגם המסכה שימושי במיוחד כדי לחקור את הפלסטיות העצבית של השרשרות והמעגלים הקשורים להתאוששות תפקודית^9,11,^{12, 13,14,15,16,17,18}. באופן ספציפי, ביצוע החצייה ברמת בית החזה, כלומר, מעל מעגלי השדרה כי שליטה התנועה הגפיים, שימושי במיוחד עבור חקירת שינויים locomotor בקרת. כמו קשר שאינו ליניארי קיים בין חומרת הנגע להתאוששות locomotor לאחר SCI¹⁹, בדיקות התנהגותיות המתאים כדי להעריך את התוצאות תפקודית היא העליונה במודלים ניסיוניים.

סוללה מקיפה של בדיקות התנהגותיות זמינים כדי להעריך היבטים ספציפיים של התאוששות תפקודית locomotor ב עכברוש^2,20. בדיקות locomotor רבות לא מספקים אמצעים אמינים מוקדם לאחר SCI כמו חולדות הם נכים מדי כדי לתמוך במשקל הגוף שלהם. מידה של ביצועים locomotor ספונטניים רגיש לפגיעות מוקדם לאחר הפציעה, ואינו דורש הכשרה מראש או ציוד מיוחד, מועיל כדי לפקח על ההתאוששות locomotor לנקודות הזמן המתאימות ל תוספת בדיקות התנהגותיות מיוחדות. הערכה מרטינז פתוח שדה הציון¹⁰, שפותחה במקור עבור הערכת locomotor ביצועים לאחר SCI הצווארי בעכברוש, הוא ציון 20 נקודת מסודר הערכה הביצועים הגלובליים locomotor במהלך תנועה הקרקע ספונטנית ב שדה פתוח. הניקוד מבוצע בנפרד עבור כל איבר באמצעות טבלת עזר להערכת הישגים המוערכת פרמטרים ספציפיים של מגוון של מדדים locomotor, כולל תנועת הגפיים הפרקולארית, תמיכה במשקל, מיקום הספרה, היכולת לצעוד, התאום האחורי של הגפיים, וזנב עמדה. תוצאת ההערכה נגזרת מן באסו, ביטי ו Bresnahan (BBB) קנה המידה שדה השטח הפתוח שנועד להעריך ביצועים locomotor לאחר החבלה בחזה²¹. הוא מותאם במדויק ואמין להעריך הן forelimb ו הlocomotor הפונקציה הגוף, מאפשר הערכה עצמאית של פרמטרים שונים הבקיע כי הוא לא מוכן עם הניקוד ההיררכי של BBB, ומספק שחזור ליניארי . פרופיל¹⁰ בנוסף, בהשוואה bbb, תוצאת ההערכה היא רגישה ואמינה במודלים חמורים יותר נזק^10,11,20,22. תוצאת ההערכה שימש להערכת locomotor ליקוי בחולדה בעקבות צוואר הרחם^10,12 ובית החזה⁹ SCI לבד בשילוב עם פגיעה מוחית טראומטית²³.

אנו מציגים כאן פרוטוקול צעד אחר צעד מפורט לביצוע SCI הT8 הבית החזה ברמה השדרה היחידה של האישה עכברוש ארוך-אוונס, ועל הערכת התאוששות הlocomotor הגפיים בשדה הפתוח.

פרוטוקול

הניסויים המתוארים במאמר זה בוצעו בהתאם להנחיות של המועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים ואושרו על ידי ועדת האתיקה באוניברסיטת מונטריאול.

1. ניתוח החצייה בחזה

1. ללבוש ציוד הגנה מתאים (כפפות, מסכה, ושמלת) כדי לשמור על סביבה אספטי לניתוח. לנקות את האזור כירורגי עם מגבונים אלכוהול, ולמקם וילונות כירורגי סטרילי על השדה כירורגי. לעקר כלים כירורגיים ולמקם בשדה כירורגי.
2. מייבשים את החולדה תחת שילוב של גז איזופלוט (3% אינדוקציה, 0.5-3% תחזוקה) וחמצן (1 ל/דקות). לאשר עומק הרדמה כירורגי הנכון על ידי אימות העדר צביטה הבוהן התגובה רפלקס המצמוץ. ברציפות לפקח על החולדה במהלך ההליך כולו, ולהתאים את כמות משלוח הרדמה כנדרש כדי לשמור על עומק הרדמה כירורגית.
3. לגלח את הגזע הגבי בין הירך והצוואר, מניחים את העכברוש על השדה כירורגי, לחטא את האתר החתך עם מגבונים אלכוהול ופתרון הספק, ולשמור על טמפרטורת הגוף ליבה ב 37 ° צ' באמצעות כרית הסקה מבוקרת משוב בפיקוח על ידי פי הטבעת דחום.
4. הניחו משחה אופטלמולוגית על העיניים כדי לשמור אותם מהתייבשות ולהחיל מחדש במהלך הניתוח כנדרש.
5. לעשות חתך 2.5 ס מ בעור מעל הנחת החוליות T6-T10 עם אזמל. למשוך את העור ושומן שטחי באמצעות מספריים לחיתוך קהה.
   הערה: מגזרים T6-T10 החוליות ניתן לזהות גם rostrally על ידי מישוש עדין של מקטעי עמוד השדרה הראשי מהבסיס של הגולגולת החל איזשהו בולטת של החוליה 2 החזה השני²⁴, או מקבל על ידי מישוש של הצלע הצפה האחוריים ביותר אשר יגרום לתנועה בחוליות החזה של^ה -13.
6. הפרד בין השרירים הפרחוליות מוסיף על ההיבט הגבי של החוליות T7-T9 באמצעות מספריים לחיתוך קהה ומפסק שמירה עצמית. Debride כלה וברור את כל הרקמה הנותרת באמצעות מלקחיים עדינים כותנה המוליך לחשוף את התהליכים spinous ואת החוליות למינציה.
   הערה: זה, והשלבים הבאים מסייעת רבות להדמיה מיקרוסקופית (~ 5-15x).
7. חותכים בזהירות את ההיבטים (המפרקים הבקיעים) על הT7 והT8 חוליות עם טרימרים עצם עדינים. חותכים את רקמת החיבור החלק התחתון בין T8 ו T9 החוליות למינציה שטחית עם אזמל (עומק 1 מ"מ) להיות זהיר לא לפגוע הכבל התחתון.
8. הסר את התהליך spinous של חוליה T8 עם טרימרים עצם. עם מלקחיים מעוקל הומוסטטי מהודק בקפידה על התהליך T7 spinous, לסובב את הקצה caudal של T8 מלמינציה מעט rostrally (~ 20 °), להכניס את העצמות העצם תחת T8 lamina, ולהפוך את קו האמצע לחתוך הארכת לאורך lamina. המשך הניתוח למינציה על ידי חזרה על חתכים בצד שמאל וימין של החוליה המדיאלי האמצעי לתהליכים רוחבי כדי לחשוף את חוט השדרה.
   הערה: היזהרו להסיר את כל שברי העצם שנוצרו מניתוח למינציה.
9. לידוקאין לטפטף (2%, 0.1 mL) בתעלת עמוד השדרה החשופה ולהסיר את השכבה היתר של הדור השדרה T8 באמצעות מלקחיים עדינים מספריים iridectomy. חזור על מינהל לידוקאין לחוט החשוף וזהה את קו האמצע של החוט על ידי הדמיה של קו מרכזי שנוצר בין התהליכים הספיסתיים החורגים בין החוליה החשופה T7-T9.
   הערה: יחד עם התהליכים spinous ב-T7 ו T9, השורש החשוף של שורש הראש ב T8 יכול לשמש גם כדי לסייע זיהוי של קו האמצע ומחט של 30 גרם ניתן להציב את קו האמצע של חוט לסייע עם הזיהום הבאים.
10. הוא מטעה את חוט השדרה מאמצע הקו לכיוון צד אחד עם סכין מבתר. להיזהר לא לחתוך דרך עורק השדרה הקדמי על הצד הגחוני (לא להחיל לחץ המשרד על הגוף החוליות). באמצעות מספריים iridectomy, לחתוך בזהירות דרך כל הרקמה הנותרת על הצד מגירסה של חוט השדרה כדי להבטיח את הרביע הרוחבי הוא מתאים להמרה.
11. מניחים ספוג חיטוי מלוחים ספוגים הומוסטטי (~ 6 x 2 מ"מ) בחלל חשוף מעל חוט השדרה ולתפור את שכבות השריר (4-0 polyglactin 910). בשלב הבא, תפר את העור. מסביב לאתר החתך
12. לספק משכך כאבים נאותים (ביפרנורפין 0.05 mg/ק"ג תת עורית [ספורטינג ראגה]), אנטיביוטי (enrofloxacin, 10 מ"ג/ק"ג ספורטינג ראגה), ולחדש לחדש את הנוזלים עם הפתרון של 5 cc הרטמן (הצפק) מיד לאחר הניתוח.
13. . תסיר את העכברוש מההרדמה מניחים את החולדה בסביבה חמה תחת כרית חימום או מנורה (~ 33 ° c) עד שהחיה ערה לגמרי.
14. לספק כאבים משלימים מדי יום במשך 3 הימים האחרונים שלאחר ניתוח ולפקח ללא הרף עבור סימנים של כאב, ירידה במשקל, micturition לא תקין, זיהום, בעיות עם ריפוי הפצע, או האוטומטית.

2. הליך בדיקה בשדה הפתוח והlocomotor ביצועים

1. להתמודד עם חולדות מדי יום במשך 1 שבוע ו habituate אותם לזירה עבור שני הפעלות 5 דקות לפני בדיקה כדי להיות שנאסף, בעדינות מאמצע הגזע, תוך בשדה הפתוח כדי להבטיח אמינות המדידה במהלך הבדיקה.
2. הניחו מצלמה בקומת הקרקע מול הזירה הפלקסיגלס בשטח הפתוח כדי להקליט הפעלות בדיקה לניתוח לא מקוון (30-60 מסגרות למינימום).
3. התחל הקלטת וידאו והציבו את החולדה במרכז הזירה תחת תנאי תאורה עמומים כדי לעודד פעילות locomotor.
4. להמשיך את הבדיקה בדיקה עבור 4 דקות כדי להבטיח כמות נאותה של locomotor התקפי לניתוח. להרים ולהחליף חולדות במרכז הזירה כאשר הם נשארים נייח יותר מ -20 s כדי לקדם תנועה.
5. ציון locomotor ביצועים של הפעלת הבדיקה המוקלטת על-ידי השלמת הטבלת הישגים שסופקה בשולחן 1לפי הפרמטרים בסעיפים הבאים.
   הערה: מומלץ להבקיע כל פרמטר בנפרד על-ידי הצגה חוזרת של הפעלת הבדיקה המוקלטת באמצעות תוכנה המאפשרת מהירות הפעלה משתנה וניתוח מסגרת אחר מסגרת (לדוגמה, נגן המדיה VLC).
   1. עבור תנועות הגפיים הפרקולריות, הציון תנועות משותפות הגוף במהלך תנועה ספונטנית בנפרד עבור הקרסול, הברך, והירך כרגיל או נורמלי (יותר ממחצית טווח התנועה, הוענק ציון = 2), קל (פחות ממחצית טווח התנועה, הוענק ציון = 1), או נעדר (הוענק ציון = 0).
   2. עבור תמיכה במשקל, להעריך את היכולת של השרירים פושט הגפיים הגוף לחוזה ולתמוך הטעון משקל מערכת כאשר האיבר הוא על הקרקע בנפרד כאשר העכברוש הוא נייח, כמו גם במהלך תנועה פעיל. הענקת ציון של 1 כאשר קיימת תמיכה במשקל וציון 0 כאשר חסרה תמיכה במשקל.
      הערה: תמיכה במשקל נייח נחשבת כאתר הפרקוויזיט לתמיכה במשקל פעיל.
   3. עבור מיקום הספרה, להעריך את המיקום של הספרות האחרונות בעוד העכברוש הוא נייח במהלך תנועה. הענקת ציון של 2 כאשר הספרות האחרונות מורחבות, מורווחים זה מזה, וטוניק במהלך תנועה ביותר מ 50% מתקופת הבדיקה (נחשב נורמלי). הענקת ציון של 1 כאשר הספרות נשארות מתוקנות בעיקר וציון של 0 כאשר הספרות נשארות בעיקר טוני.
   4. עבור צעד, להשלים פרמטר זה רק אם העכברוש יכול לתמוך במשקל הגוף שלה במהלך הצעידה. הערכת צעד על ידי דירוג הכיוון של מיקום כף יד הגפיים בזמן המגע הראשוני במעלית מהקרקע בנוסף נזילות של שלב הנדנדה במהלך הצעידה.
      הערה: ישנם 3 ציונים עבור פרמטר זה המתואר בסעיפים הקטנים הבאים הערכת בנפרד: 1) כיוון הציר של כפה מיקום במגע האיבר (מיקום הראש/plantar), 2) כיוון האורך של כף המיקום על הקשר הראשוני ובמהלך המעלית (במקביל לציר הגוף או לסיבוב פנימי/חיצוני) ו-3) איכות תנועת הגפיים במהלך הנדנדה (רגיל או לא סדיר).
      1. עבור מיקום כף היד על הקשר איבר, הציון כיוון הציר של מיקום כף היד במגע האיבר כמו 0 כאשר המיקומים האלה מתרחשים יותר מ 50% של צעדים.
         הערה: מיקום Plantar הוא נחשב perquisite עבור הבקיע את הכיוון של כפה על איש קשר ולהרים (שלב 2.5.4.2), הנדנדה התנועה (שלב 2.5.4.3) ותיאום forelimb-הגפיים (שלב 2.5.5).
      2. לכיוון כפה על קשר איבר ולהרים, הענקת ציון של 2 כאשר כף האורך ואת צירי הגוף מקבילים וציון של 1 כאשר האיבר מסובב חיצוני או פנימי, בנפרד עבור שני קשר איבר ולהרים.
      3. עבור התנועה הנדנדה, הענקת ציון של 2 כאשר המפרקים החודש להעביר באופן הרמוני ורגיל במהלך הנדנדה ציון של 1 כאשר תנועות מיובש או ספריות של המפרקים להתרחש במהלך הנדנדה.
   5. לתאום הגיבוי העצמי, להשלים פרמטר זה רק אם 4 שלבים רצופים מתרחשים במהלך הבדיקה ואם הגפיים יכולים באופן פעיל לתמוך במשקל הגוף. הענקת ציון של 3 כאשר הקואורדינציה עקבית (> 90% מהצעדים), 2 כאשר בתדירות גבוהה (50-90% מהשלבים), 1 כאשר מדי פעם (< 50% מהצעדים), או 0 כאשר נעדרים (0% מהצעדים).
      הערה: Forelimb-תיאום החוצה האיבר מוגדר בתור החילוף הרגיל בצעד בין האיבר התחתון להיות הבקיע ואת forelimb באותו צד של הגוף.
   6. עבור מיקום הזנב, להעריך את מיקום הזנב במהלך תנועה כלפי מעלה (מעל הקרקע, הוענק ציון = 1) או למטה (לגעת בקרקע, הוענק ציון = 0).
      הערה: מיקום זנב מוגבה במהלך תנועה הוא מחוון של יציבות העורק בחולדה. לאחר הזיהום, הזנב מוחזק בדרך כלל קרוב או נוגע בקרקע כמו יציבות העורק הוא לקוי.
   7. הוסף את התוצאות הבודדות מכל אחד מהפרמטרים כדי לספק סכום עבור כל אחד מהאיברים המרביים של 20 נקודות לכל היותר.
      הערה: ציון של 20 מציין ביצועים locomotor נורמליים. ציונים < 20 מייצגים הגדלת כמויות של ליקוי locomotor וציון של 0 מציין שיתוק הגפיים.

תוצאות

ניתן ליצור נגעים הניתנים לקריאה בעלת מידת עקביות גבוהה בטכניקת ההיאחקות. כדי להעריך ולהשוות בין נגעים בין קבוצות ניסיוני, האזור המקסימלי של הנגע כאחוז של החתך הכולל של חוט השדרה יכול להיות מחושב בקלות עם כתמים היסטולוגית של סעיפים חוט השדרה. איור 1 מציג את הנגע הנציג של ההימיקורד השמאלי ואת כיסוי של החלק של אזור נגע מקסימאלי משותף בין חולדות עם גודל הנגע ממוצע של 47.3% ± 4.0% של אזור הכבל החוצה החתך (n = 6).

דיון

החוזק העיקרי של טכניקת ההיחיצות הוא הסלקטיביות והתוכסות של הנגע המוביל לשונות מופחתת בפנוטיפים היסטלוגיים והתנהגותיים בין בעלי חיים²⁵. על מנת להבטיח פגיעה חד צדדית ברמת עמוד השדרה המתאימה, זיהוי מדויק של מקטע החוליות הנכון ואת חוט השדרה באמצע הדרך הוא קריטי. כפי שיכול להיות נטייה חוט השדרה לסובב בכיוון של לחתוך במהלך הליך החצייה, זה יכול להיות מועיל כדי לייצב את החוט בעדינות עם מלקחיים עדינים להציב בכל צד במהלך ההליך. הצבת החולדה במסגרת סטריאוטקאית עם הזנב מודבק בעדינות תחת מתח קל יכול לעזור עם יצ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Baytril	CDMV	11242
מספריים דיסקציה קהה	מכשירי דיוק עולמיים	503669
בופרנורפין הידרוכוריד	עדשת מצלמה CDMV
Pentax			C31204TH 12.5-75 מ"מ, f1.8, פורמט 2/3 אינץ',
מצלמת וידאו CMOS	Basler	acA2000-165uc	פורמט 2/3 אינץ', 2048 x 1088 פיקסלים, עד 165 fps, C-mount, USB3
גז חמצן דחוס	Praxair
כותנה אפליקטורים	CDMV	108703
גוזמי עצמות עדינים	Fine Science Tools	16109-14
סכין חיתוך	כלי מדע עדינים	10055-12
מלקחיים עדינים של Dumont	Fine Science Tools	11254-20
Ethicon Vicryl 4/0 סגול קלוע FS-2  תפר (J392H)	CDMV	111689
כרית חימום מבוקרת משוב	מכשיר הרווארד	55-7020
נקבה חולדות לונג-אוונס מעבדות	נהר צ'ארלס	קוד מתח: 006	225-250 גרם
קצף ג'ל	CDMV	102348
מלקחיים מעוקלים המוסטט	בסדר Science Tools	13003-10
מעקר חרוזים	חמים Fine Science Tools	18000-45
הידרוג'ל	70-01-5022	Clear H20
Isofluorane	CDMV	118740
תמיסת רינגר חלב	CDMV	116373
לידוקאין (2%)	CDMV	123684
מחט 30 ga	CDMV	4799
שטח פתוח	מותאמת אישית		קוטר 96 ס"מ, גובה קיר 40 ס"מ
משחה אופטלמית	CDMV	110704
מחשב אישי			עם קישוריות USB3 להקלטת וידאו עם המצלמה הרשומה
תמיסת מלח פיזיולוגית	CDMV	1399
Proviodine	CDMV	4568
מכרסמים נוזלי דיאטה	Bioserv	F1268
להב אזרקפת #11	CDMV	6671
מפסק שמירה עצמית	World Precision Instruments	14240
Vannas אירידקטומיה מספריים קפיציים	Fine Science Tools	15002-08
מכונת הרדמה וטרינרית ומכשיר אידוי איזופלוארן	Dispomed	975-0510-000
נגן מדיה VLC	VideoLAN		videolan.org/vlc

C-mount זירת פרספקס עגולה