אנו מתארים בפירוט קלינית המעי הגס הרלבנטי סרטן הכבד גרורות (CRLM) הגידול מודל ההשפעה של איסכמיה של הכבד reperfusion (I/R) גידול גרורות. מודל זה יכול לעזור להבין טוב יותר את המנגנונים בבסיס קידום הניתוח המושרה של צמיחה גרורתית הכבד.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מודל מורנה של גידולים גרורות בכבד בהגדרה של איסכמיה Reperfusion פציעה
במאמר זה
סיכום
תקציר
איסכמיה של הכבד ו reperfusion (I/R) פציעה, אתגר קליני נפוץ, נשאר תהליך פתופסולוגי בלתי נמנע אשר הוכח לגרום לנזק רקמות מרובות איברים. למרות ההתקדמות האחרונה ואת הגישות הטיפוליות, התחלואה הכללית נותרה משביעת רצון במיוחד בחולים עם מומים מסוימים המשמשים כבסיס. בהקשר של גידול סרטן אגרסיבי גרורות, כירורגי I/R הוא חשוד להיות היזם ויסות הישנות הגידול. מאמר זה מטרתו לתאר מודל מורטין רלוונטי קלינית של כבד I/R ו גרורות בכבד המעי הגס. בלעשות זאת, אנו מכוונים לסייע לחוקרים אחרים בהקמה ושיפור מודל זה עבור מחקר שגרתיות שלהם בתחום המחקר כדי להבין טוב יותר את ההשפעות של הכבד I/R על קידום גרורות בכבד.
מבוא
הכבד הוא אחד האתרים הנפוצים ביותר לפיתוח מחלה גרורתית1. התמותה כמעט תמיד המיוחס סיבוכים הקשורים לגידול בכבד. בחולים עם גידולים מוצק גרורתי בכבד, הניתוח נשאר התערבות קריטית לבקרת מחלות וגישה מרפא אפשרי. עם זאת, הרוב המכריע של חולים בסופו של דבר להציג עם מחלה חוזרות, בעיקר בכבד2,3. במהלך ניתוח הכבד, דימום פנימי הוא נפוץ, לעתים קרובות המחייב עירוי דם וגישות טכניות שונות לשליטה על דימום, כולל שיטות לולאה כלי דם. עם זאת, צעדים כאלה לגרום איסכמיה הכבד/reperfusion (I/R) לרקמת הכבד. תופעות לוואי של I/R על הפונקציה hepatocellular תועדו היטב. הכבד I/R העלבון מדליקה מפלים דלקתיים במהלך השיקום של זרימת הדם באמצעות מסלולים דלקתיים4. לא רק הכבד הפציעה I/R לתרום לקריסת הכבד, אבל הראיות הנוכחיות מראה גם כי פציעה I/R מעוררת הדבקה תא הגידול, ומקדמת את השכיחות של היווצרות גרורות ואת הצמיחה של מחלת המיקרוסטטי הקיים5. בעבר דיווחו כי לחץ כירורגי גורם הפעלה של תאים חיסוניים אשר לא רק מסייע בצמיחה של הגידול העיקרי, אלא גם מקלה גרורות על ידי לכידת תאים סרטניים בתוך המחזור6.
כאן אנו מתארים בפרוטרוט טכניקה להקמת מודל הגידול גרורות בכבד העכבר. במודל זה, אנו גם להציג שיטה לגרום איסכמיה הכבד reperfusion פציעה אשר מעשים כתחליף ללחץ כירורגי הנוכחי קלינית במהלך הניתוח. השיטות המשולבות של הזרקת סרטן הכבד I/R יכול לפרש בהצלחה את ההתפתחות של CRLM בחולים שעברו כריתת הגידול העיקרי.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל פרוטוקולי החיות אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים והשתמש בהנחיות המכון הלאומי לבריאות (NIH). כלים המשמשים עבור כל הליך כירורגי היו מעוקר ביסודיות.
1. הכנה ראשונית
- לפני הזרקת תאים סרטניים לתוך הטחול העכבר, לחיטוי ולעקר את כל המכשירים כדי לשמש במהלך ההליך.
- חטא ו/או אוטוקלב כרית חימום, כפפות כירורגי, גזה, זוגות של מספריים, מלחציים קטנים, כלי הקיבול, מלקחיים כירורגי, ומחזיק מחט.
- הכינו משכך כאבים שלאחר הניתוח (0.1 מ"ג/ק"ג של buprenorphine) שניתן לערוך לאחר כריתת טחול ובכל 12 שעות במשך יומיים.
2. תרבית תאים
- ודא כי התאים הסרטניים חופשיים מזיהום mycoplasma באמצעות ערכה mycoplasma אליסה.
- הכנת פתרון 500 mL של מדיום הנשר של Dulbecco (DMEM) culturing בינוני ב 4 ° c עבור התרבות של תאים מורטין סרטן המעי הגס (MC38). התקשורת culturing צריך להיות שיושלם עם 10% חום העובר בלתי מופעל סרום (FBS), 100 U/mL של פניצילין, 100 μg/mL של סטרפטומיצין, 15 מ"מ של HEPES ו 200 mM של L-גלוטמין.
- סרטן תאים סרטניים בבקבוקון DNAse-ו-RNAse-חינם (75 ס מ2). מודטת התרבות התא בתא/רקמה מחולל לחות בחממה המכילה 5% CO2. שמרו על טמפרטורה ב37 ° c.
- לאחר התאים מתרבים להגיע 90-100% השטף, מחית את התקשורת הישנה, לשטוף תאים עם מלוחים 1 x פוספט מאגור (PBS) ולאחר מכן לטפל בהם עם 1x טריפסין (0.25%) לנתק את התאים מהבקבוקון.
- לאסוף תאים בצינור 15 mL ו צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 700 x g.
- מטפי את התקשורת ושוטף עם 1x PBS פעמיים על ידי חוזר צנטריפוגה.
- המשך לאשר את הכדאיות בתאים על-ידי צביעת תאים באמצעות הכתם הכחול (0.4%).
- השהה את התאים מחדש לריכוז של 1 x 106 תאים/100 μl ב-1X PBS. התאים pipet ביסודיות כדי למנוע כל הגושים. לשמור על תאים סרטניים על קרח לפני ההזרקה.
3. הזרקת תאים סרטניים
- מתחת לגיל 8 – 12-שבוע בן זכר (C57BL6) עכברים על ידי ניהול קטמין (150 מ"ג/ק"ג) ו xylazine (12 מ"ג/ק"ג) intraperitoneally באמצעות 1 mL 25 G (0.5 מ"מ x 16 מ"מ) מחט.
- לגלח את עור הבטן של העכברים באמצעות הקוצץ כדי למנוע זיהומים לאחר הניתוח.
- הניחו עכברים במערכת הנסיגה המגנטית. ודא כי העכברים הם לגמרי תחת השפעת ההרדמה על ידי צובט אצבע או זנב.
- הוסף טיפות מלוחים לתוך העיניים כדי למנוע יובש במהלך ההליך.
- ניקוי משפשף-תמיסת יוד (7.5%) לקיר הבטן מגולח לחטא את העור לפני ביצוע חתך כירורגי.
- בתחילה להרים את העור עם מלקחיים שיניים ולעשות חתך באמצע קו בעזרת מספריים כירורגי. ואז, להרים את שריר הבטן ואת צפק ליצור חתך באמצע הדרך של כ 3 ס מ אורך (באמצע הבטן לתהליך xiphoid לחשוף את תכולת הבטן. יש להיזהר לא להאריך את החתך מעבר לתהליך xiphoid כדי למנוע דימום מעמיק.
- מניחים את הדימום בשני צידי החתך ומתחת לתהליך xiphoid. מתחו את הבטן על ידי משיכת הזנב כלפי מטה ומקליטים אותו. השימוש המוליך 6 אינץ ' מכותנה סטרילית עצה להפריד לחשוף את הטחול מרקמת שומן הלבלב.
- לפני ההזרקה לתוך הטחול, מערבולת התאים הסרטניים כדי למנוע כל הגושים תאים.
- השתמש 0.5 mL 28 G (0.36 מ"מ x 13 מ"מ) מזרק אינסולין להזרקה. להימנע בועות אוויר.
- לאט ובזהירות להזריק 100 μL של תאים לקצה הטחול. מניחים טיפ כותנה ומוסיפים לחץ עדין כדי למנוע חזרה לתוך אזור הבטן. זריקה מוצלחת ניתן לצפות על ידי זיהוי השינוי בצבע הכבד במהלך הזריקה.
- מויסטן גזה סטרילית עם 1x PBS ומניחים אותו על שטח גזור.
- להעביר את העכברים על משטח חימום עבור 15 דקות כדי לאפשר לתאי סרטן לזרום בתוך המערכת.
- כדי להמשיך עם איסכמיה כירורגית פציעה reperfusion, בצע את השלבים 5.3-5.10.
הערה: הליך זה הוא ללמוד את ההשפעה של הקמת I/R המושרה של foci גרורתי.
4. כריתת טחול
- , כדי לבצע כריתת טחול. השתמש במכשיר הקאטרי שמוחזק ביד הרם בזהירות את הטחול עם מלקחיים חלקים וצרוב את כלי הדם בטחול כדי למנוע דימום מופרז. להסיר את הטחול על ידי הסטת הכלים בסעיף הצרוב.
- מיד לאחר ההליך, לסגור את החתך בתבנית שכבה כפולה על ידי הראשון שכבת שריר ולאחר מכן את העור. השתמש בתפרים 4-0 פוליפרופילן לקיר הבטן ולעור.
- לפני שתחזור על ההליך על חיה אחרת, חטא את כל המכשירים על ידי התזת הכלים עם 70% איזופנול או הכנסתו לאמבט חרוזים.
- מניחים עכברים בחזרה לתוך הכלובים המקוריים ומחפשים סימנים של מצוקה וכאבים שלאחר ניתוח.
- הזרקת כאבים שלאחר הניתוח (בופרימטין 0.1 מ"ג/ק"ג) כל 12 שעות במשך יומיים כדי למנוע כאבים שלאחר ניתוח.
5. איסכמיה reperfusion פציעה
- ב 5 ימים לאחר כריתת האונה הראשונה, העכברים מורדם על ידי ניהול קטמין (150 מ"ג/ק"ג) ו xylazine (12 מ"ג/ק"ג) intraperitoneally באמצעות 1 mL 25 G (0.5 מ"מ x 16 מ"מ) מחט. בצע את השלבים 3.3 – 3.4.
- ניקוי משפשף-תמיסת יוד (7.5%) על הבטן מגולח של העכבר כדי לחטא את העור ולבצע כריתת באמצע הדרך כמתואר לעיל בשלב 3.6.
- באמצעות שתי עצות כותנה לחלח, הזיזו בעדינות את המעיים מהחלל כדי לחשוף את המבנים המשויכים, כולל הווריד השער. . לנתח את הכבד מרקמת הסביבה
- הרם את האונות הצדדיים שמאל נגד הסרעפת. הפרד את האונה מרובע האונה השמאלית על ידי מנתח את hilum הכבד עם מספריים האביב באמצעות מיקרוסקופ הפעלה כדי לאפשר ניראות ברורה לכיוון המבנה שילוש הפורטל.
- מניחים משטח כותנה קטן לחות בין האונה החציוני והאונה הצדדית הימנית כדי ליצור מקום מספיק להדית. באמצעות מלקחיים כלי הקיבול, בזהירות לעבור את 10 ס מ חוט (4.0 פוליפרופילן תפר) כדי להרים את שילוש הפורטל. סגר את כל המבנים שילוש הפורטל (עורק הכבד, וריד הפורטל, ואת צינור המרה) לאונות הכבד החציוני שמאל על ידי הצבת מהדק מיקרוכלי דם באמצעות מיקרו-serrefine המוליך מהדק עם נעל.
- אם האונות לא להראות שחיקת משמעותי, לקרוא רק את המלחציים על ידי הסרת והחלה.
הערה: אם הקושי המיידי של הכבד אינו מתרחש גם לאחר הקראת התפס, שקול בזהירות אם להמשיך עם ה-I/R. - להסיר את הספוגית כותנה קטנה ממוקם בין האונות לרוחב החציוני הימני. החליפו בעדינות את המעיים בחלל הבטן. לכסות את קיר הבטן עם גזה לח (ספוגה עם 1x PBS) ולכסות עם עטיפת פלסטיק כדי למזער את אובדן הסלע העצמי.
- מניחים את העכבר על כרית החימום ומחילים את המלחציים לתקופה של 60 דקות.
- במהלך מרווח האיסכמי, מחפשים ראיות של פציעה איסכמיה על ידי המחשה של החיוור האמצעי של ימין המדיאלי הימני האמצעי ואת האונות הצדדיים.
- התחל reperfusion על ידי הסרת התפסים לאחר 60 דקות.
הערה: ראיות של reperfusion ניתן לצפות על ידי שינוי צבע מיידי של האונות הרוחבי השמאלית לרוחב. - מיד לאחר reperfusion, לסגור את החתך עם דפוס כפול תפר על ידי הראשון תפירה את שכבת השריר ולאחר מכן את העור. השימוש 4-0 פוליפרופילן תפר בעזרת מחזיק מחט לסגור את קיר הבטן ואת העור.
- לפני שתחזור על ההליך על חיה אחרת, חטא את כל המכשירים על ידי התזת הכלים עם 70% איזופנול או הכנסתו לאמבט חרוזים מחומם.
- מניחים עכברים בחזרה לתוך הכלובים המקוריים ומחפשים סימנים של מצוקה וכאבים שלאחר ניתוח.
- להזריק כאבים שלאחר הניתוח (0.1 מ"ג/ק ג של buprenorphine) כל 12 h במשך יומיים כדי למנוע כאבים שלאחר ניתוח.
- עבור עכברים בעלי/R בעלי הכבד, בצע ניתוח לפני, היליום ותפרים בבטן.
הערה: התפקיד של לחץ כירורגי המשפיעים על הקמתה של גרורות בכבד ניתן לחקור באמצעות שני עיצובים ניסיוניים שונים. הפרוטוקול הנ ל (דגם -1) משמש להקמת מחלת כבד מיקרומטר וללמוד את ההשפעה של הכבד I/R על התפתחותם (איור 1a). לחילופין, הכבד I/R והזרקת הגידול ניתן לבצע במקביל (דגם -2) כדי ללמוד את ההשפעה של פציעה I/R בהקמת וקדי גרורתי חדש (איור 1b). כדי לעשות זאת, להזריק תאים סרטניים לתוך הטחול כמתואר לעיל ולאפשר להם להסתובב עבור 15 דקות. לבצע ניתוח I/R הכבד או לאחר תקופת המחזור עבור 60 דקות. בצע כריתת טחול לרוחב 60 דקות מאוחר יותר, ולאחר מכן לסגור את החתך לתוך האונה.
6. הערכת עכברים מופעלים
- במהלך ההליך הכירורגי להבטיח כי העכברים נמצאים תחת השפעת הרדמה בשלב III על ידי ביצוע בדיקת רפלקס palpebral והקרנית. מינון נוסף של הרדמה חייב להינתן על סימני רפלקסים.
- לספק כאבים שלאחר הניתוח (Buprenorphine 0.1 מ"ג/ק"ג) מיד לאחר הניתוח וכל 12h במשך יומיים כדי למנוע כאבים פוסט כירורגי.
- אפשר לעכברים 30 – 60 דקות של זמן ההחלמה מהרדמה. כל הזמן לפקח על עכברים ולא להשאיר אותם ללא השגחה עד התאוששות מלאה.
- חפשו סימני מצוקה כגון: גב מסוגר, עיניים עצומות, תנועה איטית וכישלון החתן. התייחס בהתאם עד שעכברים יחזרו לפעילותם הרגילה.
- טיפול מספק כולל נוזלים, חום, Yo, היפוך הסוכן מאפשר xylazine, נייר רך מגבת מצעים (כדי למנוע שאיפה) צריך להינתן לאחר הניתוח כדי לשפר את תקופת ההחלמה.
7. הערכה של איסכמיה של הכבד reperfusion פציעה
- מיד לאחר החלת המלחציים, לוודא את הציפוי החיוור של החציון ואת האונות לרוחב השמאלי מתרחשת לעומת מזונבת ואת האונות לבני.
- הערכת פגיעה איסכמיה של הכבד על ידי מדידת סרום אלטין טרנסאמיאז (מלח), סרום אספאנאז (sAST) ו סרום לקטט דהידרוגנאז (sLDH) רמות. הדם יכול להיגרר מווריד הפנים כדי לחלץ סרום 3 – 6 h לאחר החניכה של reperfusion. לבצע היסטולוגיה הכבד כדי לנתח את האזור הגידול אחוז בתוך האונה האיסכמי.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כל סוג wildtype C57BL6) עכברים (n = 20) היו חשופים המודל גרורות בכבד באמצעות הפרוטוקול המתואר לעיל. כל העכברים המוזרקים עם או ללא פציעה reperfusion איסכמיה שרדו עד לתאריך ההקרבה. התרשים הסכמטי באיור 1A של הכבד מוזרק סרטן ממחיש את הפקקת של שילוש הפורטל (עורק הכבד, וריד הפורטל, וצינור המרה) אשר משרה איסכמי כבד חלקי (70%) עלבון כלפי החציון והאונות הרוחבי השמאלית. גידול במספר גרורות בכבד ניתן להבחין בתוך 2-3 שבועות שלאחר איסכמיה reperfusion פציעה. עכברים שהוחדרו עם תאים MC38 סרטניים חולקו באופן ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
המודל החי המתואר בכתב יד זה מתבסס על שתי גישות עיקריות. הראשון הוא להכיר את היכולת של תאים סרטניים לוקליזציה ומתרבים באונות הכבד. השני הוא ללמוד את ההשפעה של איסכמיה הכבד reperfusion פציעה השפעה על צמיחת הגידול גרורות. מודל זה מתיר את המחקר הרלוונטי של גרורות בכבד בהעדר גרורות משניות בעכבר חיסוני. המודל שימושי לטיפול בשאלות של יעילות גרורתית, כגון הישרדות והתפשטות תאים.
במודל הראשון, התאים הסרטניים מוזרק ראשון ו-micrometastatic מחלה מותר לטופס. לאחר מכן, מבוצע מבצע בכבד I/R 5 ימים לאחר מכן. מו...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אינם מוסרים קונפליקטים של עניין הקשורים לעבודה זו.
תודות
המחברים מודים לשרה מינמייר ולאלכסנדר קומיצ לתיקון השפה הלשונית.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Lonza | 12-614F | |
| סרום בקר עוברי | לונזה | 900-108 | |
| L-גלוטמין | Gibco | 25030-081 | |
| פניצילין | פישר מדעי | 15-140-122 | |
| Stretomysin | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| HEPES | Fisher Scientific | ||
| טריפסין | Hyclone | sh30042.02 | |
| בקבוק תרבית תאים 75 ס"מ | 5 תאים כוכב | 658170 | |
| 15 מ"ל PP צינורות חרוטיים | BioExcell | 41021037 | |
| טריפאן כתם כחול | Giibco | 15250-061 | |
| גזה | פישרברנד | 1376152 | |
| Cautry | Bovie | AA01 | |
| מהדק מיקרו-וסקולרי | כלי מדע עדין | 18055-03 | |
| מוליך מהדק מיקרו-Serrefine עם מנעול | toosl מדע עדין | FST-18056-14 | |
| מספריים קפיציים | מדע משובח toosl | FST-15021-15 | |
| מרחיב כלי | כלי מדע עדין toosl | FST-00276-13 | |
| מערכת נסיגה מגנטית | מקבע עדין מדע toosl | FST-18200020 | |
| מיקרו-אדסון מלקחיים | מדע משובח toosl | FST-11019-12 | |
| מיקרו-אדסון מלקחיים | מדע משובח toosl | FST-11018-12 | |
| 4-0 תפר פוליפרופילן | Ethicon | K881H | |
| מחזיק מחט | הרווארד מנגנון | 72-8826 | |
| כרית חימום | פישר מדעי | ||
| קליפר | אוסטר | 559A | |
| תמיסת פובידון-יוד | Medline | MDS093945 | |
| 1 מ"ל 25 גרם | BD בטיחות גלישה | 305903 | |
| מזרק אינסולין 0.5 מ"ל | BD מזרקי אינסולין | 32946 | |
| כותנה מוליך קצה | פישר סיינטיפיק | 23-400-101 | |
| כירורגי מיקרוסקופ | Leica | LR92240 | |
| Mycoplasma Elisa Kit | Roche | 11663925910 | |
| Ketamine | Putney | #056344 | |
| Xylazine | NADA | #139-236 | |
| רצועת ALT | רצועת Heska | 15809554 | |
| AST | רצועת Heska | 15809542 | |
| LDH | Heska | 15809607 |
מקורות
- Riihimäki, M., Hemminki, A., Sundquist, J., Hemminki, K. Patterns of metastasis in colon and rectal cancer. Scientific Reports. 6 (1), 29765(2016).
- Oki, E., et al. Recent advances in treatment for colorectal liver metastasis. Annals of gastroenterological surgery. 2 (3), 167-175 (2018).
- Wolpin, B. M., Mayer, R. J. Systemic treatment of colorectal cancer. Gastroenterology. 134 (5), 1296-1310 (2008).
- van Golen, R. F., Reiniers, M. J., Olthof, P. B., van Gulik, T. M., Heger, M. Sterile inflammation in hepatic ischemia/reperfusion injury: present concepts and potential therapeutics. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 28 (3), 394-400 (2013).
- Demicheli, R., Retsky, M. W., Hrushesky, W. J. M., Baum, M., Gukas, I. D. The effects of surgery on tumor growth: a century of investigations. Annals of Oncology. 19 (11), 1821-1828 (2008).
- Tohme, S., et al. Neutrophil Extracellular Traps Promote the Development and Progression of Liver Metastases after Surgical Stress. Cancer Research. 76 (6), 1367-1380 (2016).
- Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. Orthotopic mouse model of colorectal cancer. Journal of Visualized Experiments. (10), 484(2007).
- Elkin, M., Vlodavsky, I. Tail vein assay of cancer metastasis. Current Protocols in Cell Biology. 19 (19.2), (2001).
- Thalheimer, A., et al. The intraportal injection model: A practical animal model for hepatic metastases and tumor cell dissemination in human colon cancer. BMC Cancer. 9 (1), 29(2009).
- Frampas, E., Maurel, C., Thedrez, P., Le Saëc, P. R. emaud-, Faivre-Chauvet, A., Barbet, J. The intraportal injection model for liver metastasis: Advantages of associated bioluminescence to assess tumor growth and influences on tumor uptake of radiolabeled anti-carcinoembryonic antigen antibody. Nuclear Medicine Communications. 32 (2), 147-154 (2011).
- Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
- Limani, P., et al. Selective portal vein injection for the design of syngeneic models of liver malignancy. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 310 (9), G682-G688 (2016).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
