כאן, אנו מציגים פרוטוקול של מסוף העכבר למבוגרים פלקים כריתת כריתה לחקור היווצרות בלסטאמה blastema ו intramembranous להתקשות, מנותח על ידי הפלורסנט אימונוהיסטוכימיה ו רציפים ב-vivo מיקרו טומוגרפיית.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
כריתה של ספרות עכבר למבוגרים והתחדשות: מודל פשוט כדי לחקור ממגי בלסטאמה היווצרות הIntramembranous פיקציה
במאמר זה
סיכום
תקציר
כאן, אנו מציגים פרוטוקול של העכבר המבוגר מהטרמינל פלנקס (P3) קטיעה, המודל התהליכים פשוטה ומתחדעה של התחדשות אפימורדית, אשר כרוך היווצרות blastema ו intramembranous האוסיפיקציה שנותחו על ידי אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית ו רציפים ב-vivo מיקרו טומוגרפיה (μCT). התחדשות היונקים מוגבלת לקטיעות המעבר באזור המרוחק של הטרמינל (P3); ספרות הנככרות ברמות הגבוהות יותר אינן מצליחות להתחדש ולעבור ריפוי פיברוטי והיווצרות צלקת. תגובת ההתחדשות מתווכת על ידי היווצרות blastema שהתרבות, ואחריו התחדשות העצם דרך intramembranous אוסיפיקציה כדי לשחזר את אורך השלד הקטוע. P3 קטיעה היא מודל טרום קליני לחקור התחדשות אפימורמכולה יונקים, והוא כלי רב עוצמה לעיצוב של אסטרטגיות טיפוליות להחליף ריפוי פיברוטיק עם תגובת התחדשות מוצלחת. הפרוטוקול שלנו משתמש אימונוהיסטוכימיה הפלואורסצנטית ל 1) לזהות אוכלוסיות מוקדמות ומאוחרות של בלסטאמה, 2) מחקר revascularization בהקשר של התחדשות, ו 3) לחקור האוסיפיקציה intramembranous ללא צורך בעצם מורכב מכשירי ייצוב. אנו גם להדגים את השימוש רציפים ב vivo μCT כדי ליצור תמונות ברזולוציה גבוהה כדי לבחון שינויים מורפולוגיים לאחר קטיעה, כמו גם לכמת נפח ושינויי אורך באותה ספרה במהלך התחדשות. אנו מאמינים פרוטוקול זה מציע כלי השירות העצום כדי לחקור את התגובות שניהם התחדשות מנוונת ורקמות ביונקים.
מבוא
יונקים, כולל בני אדם ועכברים, יש את היכולת לחדש את קצות הספרות שלהם לאחר הסדר המרוחק של הטרמינל פלנקס (P3)1,2,3. בעכברים, תגובת ההתחדשות היא תלוית ברמת קטיעה; קטיעות הספרות האבותיים יותר ויותר להציג תגובת משובי בהדרגה החליש עד כשל התחדשות מלאה בקטיעות transecting ואת האבובית לתוך P3 מטריצה4,5,6 , מיכל סבן , 8. P3 התחדשות מתווכת על ידי היווצרות blastema, מוגדר כאוכלוסייה של תאים מתרבים העוברים מורפולגנזה כדי לחדש את....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל השימוש בעלי חיים וטכניקות היו בהתאם לנהלי ההפעלה הסטנדרטיים של טיפול בעלי חיים מוסדיים והשתמש הוועדה של טקסס מ& M אוניברסיטת.
1. עכבר למבוגרים הגפיים האחוריות P3 קטיעה
- שימוש ב-8 עד 12 שבוע בדיסק CD-1 (טבלה של חומרים) באמצעות גז isofלאנה בחמצן; בתחילה הורדם ב 3% בחדר, ואחריו 2% isofלאנה שסופקו על ידי nosecone במשך הניתוח. החלת משחה אופטלמולוגית על העיניים כדי למנוע יובש תוך כדי הרדמה.
הערה: P3 למבוגרים כריתת מחקרים מתוקננת במעבדה שלנו מבוצעים על 8 כדי 12 שבוע עכברים בן, ואת תגובת התחדשות נשמרים כל הזנים נבדק. - תחת מיקרוסקופ לנתיחה 10x, לחטא את הספרות של האיבר האחוריות עם Povidone כיר....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
עכבר למבוגרים מתחדשות P3 ספרות ב 6/7 DPA (איור 2A-D), 9 Dpa (איור 2a-H), ו 10 dpa (איור 2a-L) היו מוכתמים בנוגדנים ל Runx2, OSX, ו pcna להמחיש intramembranous עצם התחדשות, ומוכתם בנוגדנים ל CXCR4 ו-vWF כדי להמחיש היווצרות blastema. הנציג μCT העיבודים של ספרות שנסרקו לפני קטיעה ובנקודות זמן שונות במהלך התחדשות (איור 3A, B) וזיהוי של ציונ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקול זה מתאר הליך מתוקננת של העכבר המבוגר הP3 קטיעה, כתמים מבוססי פלורסנט מכתים כדי להמחיש ולחקור היווצרות blastema ו intramembranous האוסיפיקציה, ו רציפים ב-vivo μct סריקה כדי ל זיהוי עצם מורפולוגית, נפח, ואורך שינויים לאחר קטיעה. P3 קטיעה הוא ייחודי, תהליכים פשוטה, מודל ליצירת לנתח סביבה פרו-משובי הפצע המפעיל היווצרות blastema. יתרה מזאת, מודל הספרות P3 מציע יתרונות רבים על פני מודלים לפגיעה בעצם מסורתית כדי לחקור intramembranous האוסיפיקציה.
כדי להבטיח הצלחה של פרוטוקול זה, יש לבצע deca.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
. למחברים אין מה לגלות
תודות
אנו מודים לחברי מעבדת Muneoka ומכון טקסס לרפואה גנומית (TIGM). העבודה הזאת נתמכת על ידי אוניברסיטת טקסס A & M.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| חלבון בלוק סרום חינם | DAKO | X0909 | מוכן לשימוש |
| עכבר אנטי-PCNA נוגדן | Abcam | ab29 | 1:2000 דילול |
| חולדה אנטי-CXCR4 נוגדן | R& D Systems | MAB21651 | 1:500 דילול |
| ארנב אנטי אנושי vWF XIII נוגדן | DAKO | A0082 | 1:800 דילול |
| ארנב נגד אוסטריקס, נוגדן SP7 | Abcam | ab22552 | 1:400 דילול |
| ארנב נגד Runx2 נוגדן | Sigma-Aldrich Co. | HPA022040 | 1:250 דילול |
| Alexa Fluor 647 מצומד עז נגד עכבר IgG (H+L) | Invitrogen | A21235 | 1:500 דילול |
| Alexa Fluor 488 מצומד עז אנטי ארנב IgG (H+L) | Invitrogen | A11008 | 1:500 דילול |
| Alexa Fluor 568 מצומד עז נגד חולדות IgG (H+L) | Invitrogen | A11077 | 1:500 דילול |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | מוכן לשימוש |
| Surgipath Decalicifier 1 | Leica Biosystems | 3800400 | מוכן לשימוש |
| Z-Fix, מאגר מימי אבץ פורמלין מקבע | Anatech LTD | 174 | מוכן לשימוש |
| CD-1 עכבר נקבה | Envigo | ICR (CD-1) | בן 8-12 שבועות |
| vivaCT 40 | SCANCO Medical |
מקורות
- Douglas, B. S. Conservative management of guillotine amputation of the finger in children. Australian Paediatric Journal. 8, 86-89 (1972).
- Illingworth, C. M. Trapped fingers and amputated finger tips in children. Journal of Pediatric Surgery. <....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
