מדידה של מחוז בקרת וירוס BK-פוליפוניים שאינו קידוד מונחה פעילות באמצעות הזרמת שפות

Summary

בכתב יד זה, פרוטוקול מוצג לבצע מדידה מבוססת FACS של וירוס BK-poly, באמצעות שימוש בתאי HEK293T באמצעות כתבת דו-מפלסי של כתב דו-כיווני המבטא tdTomato ו-eGFP. שיטה זו מאפשרת לקבוע את ההשפעה של תרכובות הרומן על תמלול ויראלי.

Abstract

וירוסים מפולדונים, כמו וירוס BK-polyדונים (BKPyV), יכול לגרום לפתווגיות חמורות בחולים חיסוני. עם זאת, מאז אנטי ויראלים יעילים מאוד אינם זמינים כרגע, שיטות מדידת ההשפעה של סוכני אנטי ויראליות פוטנציאליים נדרשים. כאן, כתב פלואורסצנטית כפול המאפשר ניתוח של BKPyV שאינו קידוד בקרת האזור (NCCR) מונחה מוקדם ומאוחר הפעילות יזם נבנה כדי לכמת את ההשפעה של תרופות אנטי ויראליות פוטנציאליים על ביטוי גנים נגיפי באמצעות tdTomato ו eGFP ביטוי. בנוסף, על ידי שיבוט BKPyV-NCCR הגברה אשר בפרוטוקול זה שהתקבלו בעבר מן ה-DNA הנגזר דם של חולי חיסוני מושתלים כליות, ההשפעה של NCCR-סידור מחדש על ביטוי גנים ויראלי ניתן לקבוע. בעקבות השיבוט של המטופל הופק הגברה, תאים HEK293T היו מזוהמים העיתונאי-פלמידים, וטיפל עם סוכני אנטי ויראליות פוטנציאליים. לאחר מכן, התאים היו חשופים FACS-ניתוח עבור מדידת ממוצע עוצמות זריחה 72 h לאחר התיקון. כדי לבדוק גם את הניתוח של תרופות כי יש מחזור התא פוטנציאלי השפעה מעכבת, רק מנוכר ובכך תאי פלורסנט משמשים. מאחר שהבדיקה מבוצעת בתאי T אנטיגן ביטוי גדול, ההשפעה של ביטוי מוקדם ומאוחר ניתן לנתח בצורה עצמאית הדדית.

Introduction

וירוסים פולידונים מייצגים משפחה עצמאית של קטן כפול תקועים DNA (dsDNA) וירוסים עם וירוס Simian 40 (SV40) כמו מינים אב טיפוס. הזיהום העיקרי מתרחשת בעיקר במהלך הילדות, אשר בדרך כלל להמשיך ללא תסמיני המחלה ובדרך כלל לגרום לזיהומים סמויים מארחים המוסמכים החיסונית. וירוס BK-פולידונים (BKPyV) ממשיך בעיקר בתאי tubules כליות מבלי לגרום לנפרולוגיה, עם זאת, במקרה של פגיעה ביכולת החיסון לאחר השתלת כליות הווירוס יכול להפעיל מחדש ולגרום נזקים חמורים השתל לקוי פונקציה בעת הגעה viremia גבוה (1 x 10⁴ bkpyv העתקים DNA/mL)^1,2. בתוך כ 10% של מקבלי השתלת כליה, ההפעלה מקדימה של וירוס BK-polyדונים (bkpyv) תוצאות וירוס מקושר הקשורים לנפרופתיה (pyvan), אשר היה עד 80% הקשורים בסיכון גבוה של כשלים השתלת כליות^3,4 . מכיוון שלא קיימים סוכני אנטי-ויראליים מאושרים, הטיפול הנוכחי מבוסס על צמצום הדיכוי החיסוני. מעניין, מעכבי mTOR נראה שיש לו אפקט אנטי ויראלי; לפיכך, העברת הטיפול המדכא לדיכוי חיסוני מבוסס mtor עשוי לייצג גישה חלופית כדי למנוע התקדמות של virepyv ויסמיה^5,6,7. עם זאת, מנגנון האנטי-ויראלי המבוסס על mTOR עדיין מובן לחלוטין. לפיכך, נדרשות שיטות למדידת ההשפעה של גורמי אנטי-ויראליים פוטנציאליים בריכוזים רלוונטיים של קליניות.

הגנום המעגלי של BKPyV מורכב כ 5 kb מחסה אזור שליטה ללא קידוד (NCCR) המשמש כמקור של השכפול ובמקביל יזם דו-כיווני המניע את הביטוי של מוקדם ומאוחר התעתיקים mRNA. מאז התרחשות באופן ספונטני nccr-rearrangements, מחיקות, וכפילויות מצויים ב-bkpyv הפתוגני⁸ והצטבר משמעותית בחולים הסובלים pvan^5,9, השוואה של הארכיאופייני (wt) ו מסודרים מחדש (rr) NCCR-פעילויות מועילים לאפיין כושר replicative ויראלי.

כפי שסוכם באיור 1, פרוטוקול זה מתאר שיטה בשימוש נפוץ כדי למדוד את הפעילות הנפוצה של BKPyV nccr על ידי כימות הזריחה של שני fluorophores tdTomato ו-egfp ביטא מתוך הכתב פלבאמצע^{5, 9,10,11}. ההליך מבוצע בנוכחות של האנטיגן T SV40 גדול (lTAg), אשר מאפשר לנתח את ההשפעה של סוכני אנטי ויראליים פוטנציאליים על מוקדם ומאוחר NCCR-פעילות בנפרד⁵. שיטת הפעולה עוד מנתחת את ההשפעה של הסדרים מחדש על פעילות nccr והשוואה עם wt-NCCRs^5,9. הכתב פלסמאמצע הנמלים את האות SV40 מאוחר במורד במורד של כל fluorophore לפתוח מסגרת קריאה כדי להבטיח עיבוד דומה ויעיל של שני התעתיקים של tdTomato ו-eGFP, בהתאמה. בהשוואה לשיטות המבוססות על רביעיית ה-PCR,^5,12, גישה זו מבוססת-facs מייצגת עלות נמוכה וחלופה גבוהה לתפוקה בקצב גבוה, מאחר שאין פרוטוקולי הוצאה מסובכים לתרבות התא הנגועה וללא יקר יש צורך בנוגדנים לצביעת מערכת הקרינה החיסונית. יתר על כן, מאז כמות מוגדרת של תאי פלורסנט מנותח באמצעות cy, הניתוח של מחזור התאים הסוכנים מעכבים ניתן גם באופן כמותי.

Protocol

פרוטוקול זה עוקב אחר ההנחיות של המחקר האנושי כפי שאושרו על ידי ועדת האתיקה של הפקולטה לרפואה של אוניברסיטת Duisburg-אסן (14-6028-BO).

1. אוסף דגימות דם או שתן ובידוד של דנ א וירוס רב-הסוכר

1. לאסוף לפחות 3 מ ל של דם בצינורות EDTA או שתן בצינורות הרכישה.
2. צנטריפוגה את המדגם ב 2,500 x g עבור 15 דקות. במקרה הצורך, יש לנקז את הפלסמה לתוך צינור חדש ולאחסן את דגימות הפלסמה ב -4 ° c למשך מספר ימים או להקפיא ב-20 ° c לאחסון ארוך יותר.
3. הכינו 40 μL של הפרוטאינאז K לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL ולהוסיף 400 μL של פלזמה על ידי ליטוף.
4. Lyse את המדגם על-ידי הוספת 400 μL של מאגר הליזה, מערבולת עבור 15 s, ו-דגירה עבור 10 דקות ב 56 ° c.
5. לבודד את ה-DNA באמצעות ערכת החילוץ דם DNA כפי שמתואר הוראות היצרן. בקצרה, להוסיף אלכוהול ולטעון את lysates על עמודת ספין המכיל ממברנה המבוסס סיליקה ה-DNA הממברנה. שטוף את העמודים מספר פעמים כדי להניב דנ א טהור.
6. . בשנת 30-50 μL של מאגר ה-TE

2. הגברה של אזור הבקרה שאינו קידוד (NCCR)

1. בצע את ההליך הבא בחדרים המופרדים פיזית. השתמש בחדר מבודד כדי להכין את הריאגנטים ולהפיץ את התערובת לצינורות ה-PCR.
2. הכינו את התמהיל הראשי עבור הפרה-PCR באמצעות התחל (טבלה 1) בנפח כולל של 50 μl ולהשתמש ב-DNA מבודדים בעבר משלב 1.6. ערכת הליטוף להכנת המיקס הראשי עבור ה-PCR הטרום והמקונן מודפסת בטבלה 2.
3. הפץ 45 μL של המיקס הראשי לצינורות ה-PCR.
4. הוסף 5 μL של ה-DNA המבודד לצינורות ה-PCR.
   הערה: השתמש בחדר אחר מאשר ההכנה לערבוב הורים כדי למנוע זיהום.
5. הפעל את ה-PCR עם תנאי התגובה כפי שמודגם בטבלה 3. חזור על הדנטורציה, הריפוי והסיומת ב-35 מחזורים.
6. לשימוש מקונן הגברה להשתמש בזוג B מחסה את אתרי ההגבלה עבור AgeI ו SpeI (שולחן 1).
7. הפעל את ה-PCR המקונן עם תנאי התגובה כמתואר בשלבים 2.2 עד 2.5 באמצעות 5 μL של הקדם-PCR.
8. מערבבים 10 μL של המוצר PCR עם 2 μL של שישה x ג'ל טעינת צבע. טען 10 μL של התערובת על 1.5% agarose ג'ל, ולהפעיל את ג'ל עבור 30 דקות ב 60 mA.
9. המחש את הג באמצעות מערכת התיעוד המתאימה של UV.
   הערה: גודל אמפליקון צפוי להיות בין 300-500 bp בהתאם אם הסדרים מחדש (מחיקות, הוספות, או כפילויות) התרחשה (איור 2c).
10. טיהור ה-PCR באמצעות ערכת טיהור PCR לפי הוראות היצרן. . ב -30 μL של מאגר הימנעות
11. שילחו את המתגברה לרצף שסנגר.

3. שיבוט של ה-NCCR לכתב הזריחה הכפולה

1. לעכל את מגביר מטוהר (שלב 2.10) עם AgeI ו SpeI עבור 2 h ב 37 ° צ' כפי שמתואר בטבלה 4.
2. חזור על שלב 2.10 וטהר את ההיגברה המתתעכלת.
3. במקביל, גם לעכל את עמוד השדרה הפלמיד (1.5 μg) עם AgeI ו SpeI עבור 2 h ב 37 ° צ' כפי שמתואר בטבלה 5. רק פעם אחת צריך לבצע את השלב הזה. לתגובות עוקבות, הקפאת העיכול ב-20 ° c.
4. לנתח את העמוד השדרה מתעכל על 0.8% ממיסים נמוכה ג'ל.
   הערה: אל תפעיל את הג עם הזרם גבוה יותר מאשר 40 mA. התוספת הצפויה של אזור מרווח נגזר במקור pEX-K4 2-משמאל לימין CD3¹³ הוא 128 Bp (איור 2c).
5. שברי DNA להמחיש באמצעות אור UV גל (320 nm) ולחתוך את הלהקה העמוד השדרה באמצעות אזמל נקי. להעביר את הרסיס הנמוך להמיס ג'ל לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה חדש 1.5 mL. למנוע הרבה זמן חשיפה UV כדי למנוע נזק DNA.
   הערה: מאחר שנעשה שימוש בהמיס נמוך, אין צורך לטהר את הדנ א לפני הארכה.
6. לחמם את עמוד השדרה המכיל את החלק הנמוך להמיס agarose עבור 10 דקות ב 65 ° c על מנת להמיס את פיסת ג'ל ולערבב כל 2 דקות על ידי vortexing עדין. ג'ל נמס ניתן להשתמש ישירות לצורך הארכה.
7. ליגייט השדרה ואת אמפליקון מתעכל באמצעות ה-DNA של T4 ליגאז בלילה על 16 ° צ' באמצעות הערכה המוצגת בטבלה 6.
8. לבצע טרנספורמציה ב -E. coli באמצעות שיטת התחשמלות, חיידקים צלחת על צלחות LB-amp, ותרבות ב 37 ° c בלילה.
9. ביום למחרת, לבחור שלושה שיבוטים חיוביים ולהכין לילה E. coli תרבויות (5 מ ל ליברות-Amp) ותרבות ב 37 ° c.
10. לבודד את הפלמיד-DNA באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים כמתואר במקום אחר¹⁴, לבצע את העיכול Agei ו spei לבדוק שיבוטים חיוביים ולהמחיש לגזור שברי על 1% agei ג'ל. הלהקה מרווח (128 bp) יוחלפו על ידי הגדול NCCR-רצף (300-500 bp, ראה לעיל).
11. שלח את הפלאמיד לקביעת רצף של סאנגר באמצעות פריימר EGFP-N או פריימר זוג B (שולחן 1).
12. מאז מוטציות עלול להתרחש באופן ספונטני, להשוות את התוצאות ברצף עם תוצאות רצף המתקבלים עם amplicon. רק להשתמש שיבוטים המכילים רצפים זהים לעומת amplicon.
13. השתמש בתוכנה מולקולרית ספסל העבודה (למשל, freeware 1.9.4 עדין או תוכניות אחרות לעריכת רצף) כדי ליישר ולערוך את רצפי שהתקבלו (איור 3).
14. התחל 1.9.4 עדין ולייבא את רצפי ה-DNA על ידי לחיצה על כפתור ייבוא (ירוק למטה החץ).
15. הקלק הבא על הכלי ובחר יישור מהתפריט (השתמש ב-Ctrl + G כקיצור דרך) ובחר ברצפי ה-DNA עבור יישור.
16. הוסף רצף ליישור על-ידי לחיצה על הוסף או הסר רצף על-ידי לחיצה על הסר. כלול רצף הקונצנזוס NCCR ההסכמה כמו JN192438¹⁵, לא להשתמש ברצף nccr מן הנפוץ ביותר דנלופ-זן¹⁶, מאז הוא הנמלים לסדר מחדש את האחרים מאשר bkpyv הארכיאופייני זנים.
    הערה: ה-NCCR כבר מכיל את ההתחלה הטרנסללית (איור 3).
17. בחר שיטה עבור היישור על-ידי לחיצה על האלגוריתם בסרגל הכלים ובחר באפשרות ' הגדר את פרמטרי היישור ' כדי להתאים 2; הרחבת הפער עונש -1; הפער עונש 2 ולחץ על אישור כדי להפעיל את היישור.

4. העברה ארעית של תאים HEK293T בעזרת הכתב הפלמיד והטיפול בסוכני אנטי-ויראליים פוטנציאליים

1. כדי להכין כמויות מספיקות של דנ א פלסטי לניסויים שלאחר החצייה, להכין תרבות לילה 150 mL. . באמצעות ערכת בידוד פלבאמצע לחילופין, ערכות טיהור אחרות הפלסטיות ניתן להשתמש.
2. Seed 1 x 10⁵ HEK293T תאים ב-dmem המכיל 10% fcs, פניצילין ו-סטרפטומיצין (1x) לכל טוב של 12-באר צלחת 24 שעות לפני התפשטות ו הדגירה לילה ב 37 ° צ' ו 5% CO₂ כדי לשמור על ההפצה הפעילה במהלך הגלגול.
   הערה: התאים אמורים להיות כ-80% בחיבור החוצה.
3. מקום 250 μL של מדיה סרום מופחת בצינור סטרילי ולהוסיף 1 μg של כל כתבת ה-DNA העיתונאי ומערבבים בעדינות על ידי ליטוף.
4. הוסף 3 μL של הזיהום מגיב לתערובת ה-DNA, לערבב בעדינות על ידי ליטוף ו דגירה עבור 15 דקות. לחמם את החצייה מגיב לטמפרטורת הסביבה של 22 ° צ' ומערבולת בעדינות לפני השימוש.
5. מוסיפים את התערובת לבארות ומפיצים בעדינות לבאר.
6. לאחר 4 שעות, החלף את הסופרנטאנט במדיום טרי המכיל את סוכני הבדיקה ואת בקרת הממס. מודטה ב 37 ° צ' עד לניתוח. בדוגמה זו, שימשו מעכבי mTOR INK128 (100 ng/mL) ו rapamycin (100 ng/mL).

5. מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית זרימה

1. בדוק את התאים של הזריחה האדומה והירוקה תחת המיקרוסקופ הפלואורסצנטית (איור 4).
   הערה: הקרינה האדומה והירוקה מתאימה לביטוי הגנים המוקדם והמאוחר של BKPyV, בהתאמה.
2. לאחר 72 h לאחר ההעברה, מטפי את הסופרנטנט ושוטף את התאים פעמיים עם 1 מ ל של ה-PBS הקרה.
3. הוסף בעדינות 500 μL של טריפסין וסובב את הצלחת מעט כדי למנוע התנתקות מוקדמת של התאים. שלב זה חשוב להימנע מתאי כלטים.
4. לאחר בנוסף, להסיר את הטריפסין ישירות עם אותו קצה הצינורות.
5. מודקון את התאים לפחות 5 דקות ב 37 ° c.
6. השהה מחדש את התאים באמצעות 1 mL של PBS המכיל 3% FCS ולהעביר את ההשעיה בצינורות FACS מראש מתויג.
7. הוסף DAPI (1 μg/mL) לפני ניתוח ה-FACS.
8. לנתח את התאים באמצעות cytometer זרימה. עבור כל דוגמה, למדוד לפחות 10,000 תאים חיים, אשר שליליים לצביעת DAPI.

6. ניתוח נתונים

1. יבא את הנתונים לתוכנת ניתוח cy, והוסף דגימות על-ידי לחץ וגרור לתוך סביבת העבודה.
2. לחץ פעמיים על הקובץ המיובא וצור מזימת גרף. בחר FSC-A לעומת המטה-מע על ידי לחיצה על ציר ה-x ו-y. שער את אוכלוסיית התא הראשי על- ידי לחיצה על מצולע בסרגל הכלים ומסגור את אוכלוסיית התאים (איור 5). נקוב בשמות של אוכלוסיית התאים הנבחרת כנדרש (לדוגמה "תאים בודדים"). "התאים היחידים" יופיעו כסביבת עבודה חדשה.
3. המשך באמצעות "תאים בודדים" עבור DAPI שלילי (כלומר, "תאים חיים"). כדי לזהות תאים חיים, השווה בין אוכלוסיית התא לבין ובין אם כתמים של DAPI. בשתי החלקות בחרו FSC-A מול פסיפיק-כחול-A.
4. לחץ על המלבן ובחר את האוכלוסיה השלילית של התאים DAPI, שם את האוכלוסייה בתאים הנבחרים "תאי החיים", וליצור העלילה נקודה חדשה המציגה FITC (eGFP) לעומת PE (tdTomato) כפי שמתואר לפני.
5. הוסף רבעים ב"תאים חיים" על-ידי בחירה באפשרות Quad מסרגל הכלים. שער את האוכלוסייה על ידי גרירת מרכז הרביע עד לקצה של כל אוכלוסיה. הרביעים מייצגים 1) eGFP-tdTOM-, 2. eGFP-tdTOM +, 3) Efp + tdTOM-, 4) eGFP + tdTOM +.
   הערה: בשל הכיסוי הספקטרלי של ספקטרום הפליטה בין ה-FITC ו-PE, הפיצוי הראשוני חיוני להבחנה בין אותות אדומים וירוקים ולהשיג תוצאות מדויקות.
6. קביעת עוצמות של כוונות זריחה (MFIs) על ידי לחיצה ימנית על הרביע ובחירה באפשרות ' הוסף סטטיסטיקה'. בחר ' ממוצע ' ולחץ על ' אישור'. MFI ממוצע כעת מוצג מתחת לאוכלוסיה בסעיף "סטטיסטיקות". רביעים 2 ו-4 תואמים לביטוי מוקדם, בעוד שרביעים 3 ו-4 מייצגים ביטוי מאוחר.
7. הוסף שכפול נוסף באותו אופן עבור כוח סטטיסטי.
8. עבור פרשנות נתונים להתוות ערכי MFI של מוקדם ומאוחר לתוך מגרש בר:
9. כדי להשוות את הפעילויות NCCR שהתקבלו מתורמים שונים או זנים וירוסים, להוסיף פקד הארכיאופייני או זן דנלופ¹⁶ ולהגדיר mfis היחסי שלה ל 100%, ולחשב את ערכי mfis היחסי. חזור על הפעולה כאשר כל שכפול וקבע ממוצע וסטיית תקן.
10. כדי להעריך את ההשפעה של תרכובות פוטנציאליות על הפעילות הטרנססקריפט, להגדיר את שליטה הממס ל 100% ולהתוות את MFI של התאים התייחסו.

Results

בניסוי מייצג זה, אזור הבקרה של וירוס BK-פולידוני שאינו קידוד מונחה הפעילות הטרנסדטית נמדדה באמצעות הזרימה cy, try. בנוסף, מעכב mTOR, אשר עשוי לשמש לטיפול בחולים אחרי BKPyV ההפעלה מראש, נבדק על העיכוב שלה של הביטוי הגן הקדומה ויראלי. למטרה זו, שימש שיטת הכתבת הפלואורסצנטית כפולה כפי שפורסמה בעבר⁵. ערכת זרימת העבודה הכוללת של הכיוונון הנסיוני מומחש ב- Figure 1. ראשית, דגימות דם מהחולים מושתלים כליות חיסוני נאספו על פי ההנחיות של מחקר...

Discussion

במאמר זה, שיטה בשימוש נפוץ מוצגת המאפשרת ניתוח של BKPyV לא קידוד בקרת אזור (NCCR) מונחה מוקדם ומאוחר הפעילות המקדם. ניתן למדוד את פעילות NCCR בו ואינה זקוקה לפירוק של התאים הניתנים להעברה. יתרה מזאת, ניתן לנתח מספר גדול יחסית של תאים ושיתוף ההעברה של סמנים נוספים לנורמליזציה של ערכי הקרינה הפלואורסצנטית אינו הכרחי.

חלק קריטי של שיטה זו הוא כי משוכפל nccr צריך להכיל בדיוק את אותם רצפים כפי שזוהו על ידי אמפליקון ברצף, אשר מתאים את משתני רוב נוכח הפלזמה המטופל. כדי להשיג תוצאות מדויקות ולמזער שגי...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
סולם 100 bp	NEB	N3231	ניתן להחליף כל סולם עם טווח של עד 1 kb סולם
2 בולי עץ	NEB	N0550	ניתן להחליף כל סולם עם טווח של עד 10 kb
Agar-Agar, Kobe I	Carl Roth	5210.3
AgeI-HF	NEB	R3552
Ampicillin Natriumsalz Cellpure	Carl Roth	HP62.1
Aqua ad iniectabilia	Bbraun	2351744	יכול להיות מוחלף על ידי כל יצרן
BD FACSCanto™ II	BD Biosciences
BD FACSDiva	BD Biosciences
DAPI	Sigma	10236276001
מודול מצלמה DFC450C	Leica		ניתן להשתמש בכל מצלמה
DMEM	Gibco	41966-029	ניתן להחליף על ידי כל יצרן
DMIL LED מיקרוסקופ	Leica		כל מיקרוסקופ פלואורסצנטי ניתן להשתמש
ב-DNA Blood Mini Kit	Qiagen	51104	ניתן להחליף על ידי כל יצרן
E.coli DH5alpha Qualified Cells	Thermo Scientific	18258012
FBS Superior	MerckMillipore	50615	ניתן להשתמש בכל FBS
FlowJo v10.5.3	FlowJo, LLC		ניתן להשתמש בכל תוכנת זרימה ציטומטריה FBS צבע
טעינת ג'ל, סגול (6X)	NEB	B7024	ניתן להחליף כל צבע טעינה פי 6
HEK293T תאים	ATCC	11268	תאים אלה מבטאים באופן מכונן את אנטיגן ה-T הגדול של נגיף הסימיאן 40 (SV40), ושיבוט 17 נבחר במיוחד בשל יכולת ההעברה הגבוהה שלו.
HERAcell® 240i CO2 Incubator	Thermo Scientific		ניתן להחליף על ידי כל יצרן
ערכת HotStar PCR	Qiagen	203203
Intas Gel	Documentation System Intas		ניתן להשתמש בכל מערכת הדמיה ל-DNA מוכתם המכילה ג'ל אגרוז ניתן להשתמש
ב-Low Melt	Agarose Biozym	850081	ניתן להחליף על ידי כל יצרן
Opti-MEM	Invitrogen	31985070	על ידי כל יצרן
pBKV (34-2)	ATCC	45025	פלסמיד המכיל את הגנום באורך מלא של זן BKPyV Dunlop; שימש כבקרה חיובית; DNA Seq. Acc.: KP412983
PBS	Gibco	14190-136
PCR Cycler MJ Mini 48-Well Personal	Cycler Bio-Rad	מוצר שהופסק המוצר שהופסק	ניתן להשתמש בכל תרמו-סייקלר
PCR Nucleotide Mix, 10 מ"מ	Promega	#C1145	ניתן להחליף על ידי כל יצרן
PCR1 ו-PCR2 פריימרים	metabion	לא ישים	מותפל. יש לדלל ל-(10 ומיקרו; M) עם מים בדרגת PCR
PenStrep (100x)	Gibco	15140-122	ניתן להחליף על ידי כל יצרן
Roti®-GelStain	Carl Roth	3865	כתם מבוסס פלואורסצנטי למדידת ריכוז dsDNA
SpeI-HF	NEB	R3133
T4-DNA Ligase	NEB	M0202
TransIT LT1	Mirus	MIR2300
טריפסין 0.05% - ניתן להחליף את EDTA	Gibco	25300-054	על ידי כל יצרן
ערכת פלסמיד ZymoPURE II	Zymo	D4201	ידי כל יצרן