הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

סינתזה אנזימטית של אפוקסי מטבוליטים של דוקוסקסהקאקאנוק, אייאיסאופנטנואית וחומצות ארכידונית

8.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59770

⸱

28 ביוני 2019

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Toxicology, Michigan State University

במאמר זה

סיכום

אנו מציגים שיטה מועילה לסינתזה אנזימטית וטיהור של אנאנטימרים ספציפיים ובעלי מגוון רחב של חומצה ארכידונית (AA), חומצה docosahexaenoic (DHA), וחומצה eicosapentaenoic (EPA) עם שימוש של ציטוכרום בקטריאלי אנזים P450 (BM3).

תקציר

האפוקסי מטבוליטים של חומצות שומן רב בלתי רוויות שונות (PUFAs), הנקראת חומצות שומן אפוקסי, יש מגוון רחב של תפקידים בפיזיולוגיה של האדם. אלה מטבוליטים מיוצרים באופן שורש על ידי מחלקת P450 ציטוכרום של אנזימים. בגלל השפעות ביולוגיות מגוונות וחזקות שלהם, יש עניין רב בלמידה אלה מטבוליטים. קביעת התפקידים הייחודיים של מטבוליטים אלה בגוף היא משימה קשה, כמו חומצות שומן אפוקסי יש לקבל תחילה בכמויות משמעותיות עם טוהר גבוהה. קבלת תרכובות ממקורות טבעיים היא לעתים קרובות עבודה אינטנסיבית, ו לייף hydrolases מסיסים הידרו במהירות את מטבוליטים. מצד שני, קבלת אלה מטבוליטים באמצעות תגובות כימיות הוא מאוד לא יעיל, בשל הקושי של קבלת regisomers טהור, enantiomers, תשואות נמוכות, ונרחב (ויקר) טיהור. כאן, אנו מציגים סינתזה אנזימטית יעיל של 19 (s), 20 (r)-ו-16 (s), 17 (r)-האפוקסי חומצות (edps) מ-DHA באמצעות אפוקסי עם BM3, אנזים CYP450 חיידקי מבודד במקור ממלוס מקרתגו megaterium (המתבטא בקלות באסאנכיה קולי). אפיון וקביעת טוהר מתבצעים באמצעות ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית (NMR), כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים, וספקטרומטר מסה (MS). הליך זה ממחיש את היתרונות של סינתזה אנזימטית של PUFA אפוקסי מטבוליטים, והוא חל על האפוקסי של חומצות שומן אחרות, כולל חומצה ארכידונית (AA) וחומצה eאיסאופנטקאנומית (EPA) כדי לייצר את האפוקסי האנלוגי חומצות (EETs) ומוצרי אפוקסי (EEQs), בהתאמה.

מבוא

כעניין התפקיד כי חומצות שומן רב בלתי רווי (במיוחד אומגה 3 ו אומגה 6 חומצות שומן רב בלתי רווי) לשחק בביולוגיה אנושית גדל בשנים האחרונות, החוקרים הבחינו של מגוון רחב של הטבות מושך כי מטבוליטים שלהם תערוכה. במיוחד, שומן אפוקסי חומצת מטבוליטים המיוצר על ידי מחלקה P450 ציטוכרום של אנזימים היו נקודת גדול של מיקוד. לדוגמה, באפופא רבים, כולל חומצות שונות (eets), חומצות שמנת (edps) וחומצות אפוקסי (eeqs), משחקים תפקיד קריטי בוויסות לחץ הדם ודלקת1,2 ....... , מיכל שלוש , ד , 5. מעניין, enantiomers ספציפיים ו regioisomers של AA ו-EPA ואפוקסידס ידועים יש השפעות שונות על הצומת6,7. בעוד ההשפעות הפיזיולוגיות של enantiomers ו regioisomers של EETs ו-EEQs תועדו, מעט ידוע על ההשפעה של חומצות האפוקסי מקבילה ביותר (EDPs) נוצר מ DHA. שימוש נרחב של שמן דגים8, אשר עשיר הן EPA ו-DHA, גם עוררה עניין ב-edps9. היתרונות של תוספי מזון אלה הם האמינו בחלקו בשל הזרם מטבוליטים DHA (16, 17-EDP ו 19, 20-EDP להיות הנפוץ ביותר) כי ברמות vivo של הקואורדינטות Edp טוב מאוד עם כמות של DHA בדיאטה10, . בסדר, 11

לימוד המנגנונים והיעדים של חומצות שומן אפוקסי אלה על ידי טבולומיקס, ביולוגיה כימית, ושיטות אחרות הוכיחו מאתגרת, בין השאר כי הם קיימים כתערובות של regio-ו-מערכת סטריאו, ושיטה להשיג כמויות טהורות של המלון מחויב ליחידים ולמבודדים. אמצעים קונבנציונליים לסינתזה תרכובות אלה הוכחו ללא יעילים. שימוש בחומצות הפראוקסיטציה כמו חומצה מטה-כלורמטומית לאפוקסי בעלי חסרונות רבים, ובראשם העדר סלקטיביות, הדורשת טיהור יקר ומדקדק של המוני ואנאנטינים בודדים. סינתזה הכולל של DHA ו-EPA מטבוליטים אפשרי, אבל גם סובל מחסרונות שעושים את זה מעשי סינתזה בקנה מידה גדול כגון עלויות גבוהות תשואה נמוכה12,13. הייצור הכולל יעיל ניתן להשיג עם סינתזה אנזימטית, כמו תגובות אנזימטיות הם regio-ו סטריאוסלקטיבית14. מחקרים מראים כי מגוון אנזימטית של AA ו-EPA (עם BM3) הוא שניהם regioselective ו enantioselective15,16,17,18, אבל הליך זה לא נבדק עם DHA, או על גדול ידה. המטרה הכללית של השיטה שלנו היתה לשנות את היקף ולייעל את האפוקסי כימוזציה זו כדי לייצר במהירות כמויות משמעותיות של חומצות שומן באפוקסי טהור כמו enantiomers הפרט שלהם. באמצעות השיטה המוצגת כאן, החוקרים יש גישה אסטרטגיה פשוטה וחסכונית לסינתזה של EDPs ו-PUFA אחרים אפוקסי מטבוליטים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

התראה: נא להתייעץ עם כל גליונות הנתונים הרלוונטיים של בטיחות חומרים (MSDS) לפני השימוש בכימיקלים המפורטים.

1. ביטוי מסוג פראי BM3

  1. איחסן pBS-BM3 מDH5α E. coli (תרומה נדיבה של ד ר פ. אן ווקר) ב 5 מ ל של מרק LB סטרילי עם 0.5 מ"ג של אמפיצילין נוסף לתוך שפופרת תרבות 20 מ ל.
  2. מודטה את תרבות התא בשייקר ב 37 ° c עבור 24 שעות ב 200 rpm. להוסיף את התרבות לילה המתנע (5 מ ל) ו 100 mg של אמפיצילין L של מרק ליברות סטרילי בבקבוקון פרנבאך או Erlenmeyer אייר. נענעי ב 37 ° צ' עבור 6 h ב 200 סל"ד, ואז ב 30 ° c עבור 18 h ב 200 rpm.
  3. איסוף וצנטריפוגה את תרבות התא ב 4 ° צ' עבור 10 דקות ב 1,000 x g. השמט את הסופרנטנט ואחסן את הגלולה בתא-78 ° צ' עד לטיהור אנזימים.
    הערה: supernatant יכול להיות מעוקר כימית על ידי טיפול עם אקונומיקה או מעוקר באמצעות החיטוי ולאחר מכן נשפך לטמיון.

2. טיהור של BM3.

  1. פירוק תאים
    1. הפשרת את הגלולה הסלולרית על הקרח והשעיית מחדש ב-40 מ ל של מאגר מסיסות (4 ° c) של קרח קר (ארבע מעלות צלזיוס) (10 מ"מ טריס, 0.01 מ"מ פנילמתיל פלופקסיל (PMSF;), 0.01 מ"מ EDTA; pH 7.8).
      התראה: PMSF הוא רעיל על ידי מגע.
    2. בעוד בקרח, sonicate את התאים עבור 1 דקות עם הומוגניצר אולטרה סאונד (פלט כוח הגדרת 10, חובת 100%), ואחריו הפסקה 1 דקות על הקרח על מנת lyse את התאים. חזור על הליך זה 6 פעמים. צנטריפוגה את התא ליפוסט ב 4 ° צ' עבור 30 דקות ב 11,000 x g כדי לכלוך תא גלולה.
  2. כרומטוגרפיה של אהדה
    1. הכנת עמודה חזקה של חילופי כרומטוגרפיה (ראה טבלת חומרים; קוטר: 2.8 ס"מ x 6 ס"מ, נפח עמודה: 37 mL) על ידי כביסה עם 5 כרכים של עמודות (CV) של מאגר a (10 מ"מ טריס, pH 7.8) ב 4 ° c.
    2. הוסף את התאים הניידים לעמודה מעורפלת ושטוף את העמודה עם 3 קורות חיים של מאגר קר A. Elute the BM3 על ידי שטיפת הטור עם מאגר קר B (10 מ"מ טריס, 600 mM הנאקל, 6 קורות חיים).
    3. לאסוף את שבר משחרלי חום אדמדם. אם החלבון אינו משמש באופן מיידי, ערבב אותו עם נפח שווה של גליצרול והקפאת הבזק עם חנקן נוזלי. אחסן את הפתרון הקפוא ב-78 ° c.

3. אפוקסי של DHA על ידי BM3

  1. להכין את התגובה על ידי הוספת 0.308 g (0.940 mmol) של DHA ב 18.8 mL של dimethylsulfoxide (DMSO) כדי 2 L של מאגר התגובה זע (0.12 M אשלגן פוספט, 5 מ"מ MgCl2, pH 7.4) יחד עם 20 ננומטר של האנזים BM3 הופדיל. ריכוז האנזים ניתן לקבוע על ידי שיטת הדו חד תחמוצת הפחמן/דיתיוונייט19.
  2. בעוד הפתרון הוא זע, להתחיל את התגובה על ידי הוספת 1 שווה ערך ל-NADPH (מופחת בדרך-אגב, מופחתת מלח הטטרנתרן, 0.808 g, 0.940 mmol) הומס מאגר התגובה. מערבבים את התגובה עבור 30 דקות תוך מבעבע אוויר דרך תערובת התגובה עם בלון מלא אוויר מוצמד מזרק מחט.
  3. באמצעות ספקטרוסקופיה (ראה טבלת חומרים), בדוק את ספיגת תערובת התגובה ב 340 nm כדי לקבוע אם nadph מתרוקן. אם אין ספיגה נוספת המציינת את הצריכה של NADPH, התגובה תושלם.
    הערה: בדרך כלל, התגובה הושלמה לאחר 30 דקות.
  4. להרוות את תערובת התגובה על ידי הוספת לאט חומצה אוקסלית 1 M, dropwise, עד pH של הפתרון מגיע 4.

4. הפקת האדפס

  1. לחלץ את הפתרון מאגר הקרה עם 2 L של דיאתיל אתר (anהידרוous, ללא תחמוצת) 3 פעמים. לאסוף את שכבת האתר (6 L) ויבש עם מגנזיום אנמים סולפט (MgSO4).
  2. מסננים את MgSO4 מן הפתרון ולרכז את שכבת האתר מיובש על מאייד רוטרי להניב שאריות edp גסה.
  3. לטהר את השאריות על ידי כרומטוגרפיה עמודה פלאש (מחסנית 40 g סיליקה מספיקה). התחל ב 10% אתיל אצטט (אטואק) ב הקסנס ואת הרמפה עד 60% אטואק ב הקסאנס מעל 22 דקות.
    הערה: שלוש פסגות גדולות מתקבלות ונאספות, משחררי בסדר של 1. לא הגיב DHA; 2. תערובת של איזופ איפולימרים; ו-3. di-לייף (מוצרים נורמליים על חמצון (ראה איור 1)).
  4. לשלב את השברים ולמקד אותם על המאדה רוטרי. מדוגמה זו, 0.074 g, (24%) של DHA בלתי מגיב, 0.151 g (47%) של EDP איזוers, ו 0.076 g, (22%) של di-לייף הושגו.

5. הריפיקציה של EDPs, הפרדה של 16 (s), 17 (r)-ו-19 (s), 20 (r)-edps, ו סאפפיקציה של אסטרים

התראה: טרימתיל סיללדימתאן (TMS-diazomane) הוא רעיל מאוד על ידי מגע ואינהלציה. השתמש רק בתוך מכסה עם ציוד הגנה אישי תקין.

  1. דלל את האפוקסידות (0.151 g, 0.435 manm) בבקבוקון עם תחתית עגול או בקבוקון קטן עם 2 מ ל של anמתנול ous (MeOH) ו-3 מ ל של אנידראן טולואן, מוסיפים בר-מהומה, ומוסיפים TMS-diazomane (1.2 מקבילות, או 0.26 mL של 2 M פתרון ב hexanes) תחת ארגון.
  2. המתן 10 דקות והוסף תוספת TMS-diazomane (0.050 mL) עד שיישאר צבע צהוב חיוור.
  3. לאחר 30 דקות, לרכז בזהירות את התערובת באמצעות מאייד רוטרי ולטהר את השאריות על ידי כרומטוגרפיה העמודה פלאש. אליוט עם 4% אטואק בהקסנס (באמצעות טור או מחסנית סיליקה ג'ל 40 g) במשך 22 דקות. בדוגמה זו, 19, 20-EDP מתיל אסתר (0.116 g, 74%) ו 16, 17-EDP מתיל אסתר (0.029 g, 19%), התקבלו כשמנים ברורים (תשואה כוללת, 93%).
  4. אספו את השברים המכילים את המוני מתיל EDP מטוהרים. 19 (ים), 20 (ה)-edp מתיל אסתר לראשונה, ואחריו 16 (ים), 17 (r)-edp מתיל אסתר.
  5. אם יישארו שברים מעורבים (המכילים גם איזוers; ניתן להעריך על-ידי כרומטוגרפיה בשכבה דקה (ועוד) ב-8:1 הקסאן/אטואק ומוכתמת באשלגן פרמנגנט (KMnO4)), מחדש כרומאטוגרף אותם עם מערכת ממיסים זהה לפני.
  6. רכזו את השברים המכילים את היחידות הבודדות.
    הערה: בשלב זה, הזהות והטוהר עשויים להיות מוערך על ידי NMR (באמצעות CDCl3 כמו הממס; ראה את האגדה עבור איור 2).
  7. כדי להמיר בודדים EDP מתיל אסתר regiאוינים כדי צורות החומצה שלהם, לדלל את אסתר EDP ב THF: מים (כ 0.7 mL/0.1 mmol של אסתר). להוסיף 2 מימית ליהוי (3 מקבילות טוחנת) ומערבבים בן לילה.
    הערה: שלמות התגובה יכולה להיות מוערך על-ידי השימוש ב-3:1 הקסאנס/אטואק, כתמים עם KMnO4; למוצר יש גורם שמירה של ~ 0.3.
  8. להרוות את התגובה לאט עם חומצה פורמית, עד pH של התערובת מגיע 3-4. הוסף מים ו אתיל אצטט (1-2 mL/0.100 mmol של אסתר) ולהפריד את השכבות. לחלץ את שכבת המים עם אטואק (3 x 5 מ ל), לשטוף עם תמיסת מלח רווי ("נמול"), ולייבש את שכבת אטואק מעל נתרן סולפט (Na2SO4).
  9. רכז את תמיסת אתיל אצטט באמצעות מאייד רוטרי, להוסיף הבעיה (10 mL) ולהתרכז שוב. חזרו פעמיים כדי להסיר את החומצה המיאוטרופית השיורית. לטהר את השאריות על ידי כרומטוגרפיה העמודה פלאש, משחררי עם 10-30% אטואק מעל 15 דקות.
  10. רכזו את השברים הרצויים ויבשו בתוך הריק כדי לממן את החומצה הטהורה.
    הערה: בשלב זה ניתן להעריך את טוהר enantiomeric (על-ידי כימיית מערכות, עיין באגדות לאיור 3 - איור 4 לעמודה ולתנאים). טוהר כימי יכול להיות מוערך על ידי סי18 (achiral) כרומטוגרפיה (ראה לוח חומרים והתייחסות 14).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כרומאטוגרמה הבזק (מבוצע באמצעות מערכת טיהור פלאש אוטומטית כפי שמתואר להלן) שהושג על ידי טיהור התערובת הגולמי מתוך מראה של אפוקסי אנזימטי מוצג באיור 1. לאחר הפרדת המוני והפרדה של האריאוינים הטהורים 16 (s), 17 (r)-Edp ו -19 (s), 20 (r)-אסטרים של מתיל edp הושגו. בדרך כלל, הם נמצאים 1:4 בקירוב ליחס 1:5, עם המוצר העיקרי להיות 19 (S), 20 (R)-edp. לא מתקבלים עוד מגזרי EDP (לדוגמה, 13, 14 או 10, 11-EDP). 1

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

אנו מציגים כאן שיטה פשוטה וחסכונית עבור הכנת שני מטבוליטים אפוקסי השפע ביותר של DHA-19, 20 ו 16, 17-EDP. חומצות שומן אפוקסי אלה ניתן להכין ב enantiopure מאוד (כמו S שלהם , R-איזוers) טופס באמצעות האנזים BM3 סוג פראי. כמה נקודות קריטיות שניתן להשתמש בהם לפתרון בעיות, ואת השלוחה של השיטה שלנו להכנת אפוקסי אנאנטיפורה מטבוליטים של AA ו-EPA, מתוארים להלן.

BM3 הנחיות לאחסון

אחסון האנזים BM3 מטוהרים אפשרי על ידי ערבוב תמיסת חלבון עם נפח שווה של גל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין קונפליקטים של עניין לגלות.

תודות

עבודה זו ממומנת על ידי R00 ES024806 (המכון הלאומי לבריאות), DMS-1761320 (הקרן הלאומית למדע) וכספי הפעלה מאוניברסיטת מישיגן סטייט. המחברים מבקשים להודות לד ר ג'ון יאנג (אוניברסיטת קליפורניה בדיוויס) ולליתה קראלה (אונ' מישיגן) לסיוע במיטוב התגובה האנזימטית, וד ר טוני שילמילר (MSU טבולומיקס מאסה ספקטרומטר מתקן ומיתקן) לקבלת סיוע ברכישת נתונים HRMS.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אמוניום ביקרבונטסיגמא9830NA
אמפיציליןGoldBioA30125NA
מגנזיום גופרתי נטול מיםFisher ScientificM65-3NA
מתנול נטול מיםSigma-Aldrich322515NA
נתרן גופרתי נטול מיםFisher ScientificS421-500NA
נטול מים טולואןסיגמא-אולדריץ244511NA
חומצה ארכידונית (AA)Nu-Chek PrepU-71Aרגיש לאוויר. 
דיאתיל אתרסיגמא296082NA
DMSO (דרגת ביולוגיה מולקולרית)סיגמא-אולדריץ'D8418NA
חומצה דוקוסהקסאנואית (DHA)Nu-Chek PrepU-84Aרגיש לאוויר. 
EDTA (חומצה אתילנדיאמינטטראצטית)Invitrogen15576028NA
חומצה איקוסאפנטאנואית (EPA)מכינה Nu-Chek  U-99Aרגיש לאוויר. 
אתיל אצטטסיגמא 34858
מחסניות עמודות פלאש NA 25, 40, 4, 12 גרם גדליםFisher Scientific145170203, 145154064, 5170200לחלופין, ניתן להשתמש בכרומטוגרפיה של עמודות קונבנציונלית
חומצה פורמית (דרגת HPLC)J.T. Baker0128-01NA
גליצרולסיגמאG7757NA
הקסניםVWRBDH24575מרק
NA LBSigmaL3022NA
ליתיום הידרוקסידסיגמא-אולדריץ'442410NA
מגנזיום כלורידפישר סיינטיפיק2444-01NA
מתנול (בדרגת HPLC)סיגמא-אולדריץ'34860-41-RNA
NADPH מלח טטרסודיוםסיגמא-אולדריץ481973רגיש לאוויר. 
חומצה אוקסליתSigma-Aldrich194131NA
pBS-BM3 שעבר טרנספטציה DH5 ואלפא; E. coliNANA
PMSF (פנילמתאן סולפוניל פלואוריד)SigmaP7626רעיל!
אשלגן פרמנגנטסיגמא-אולדריץ'223468לצביעה TLC. 
אשלגן פוספט דו-בסיסיסיגמא795496NA
אשלגן פוספט מונו-בסיסיסיגמא795488NA
Q שרף זרימה מהירה (GE Healthcare מדעי החיים)פישר סיינטיפיק17-0515-01לטיהור חילופי אניונים של האנזים
נתרן כלוריסיגמא71376NA
טטרהידרופורן,סיגמא-אולדריץ' נטול מים186562NA
TMS-דיאזומתאן (2.0 מ' בהקסאנים)סיגמא-אולדריץ'362832רעיל מאוד. 
Tris-HClGoldBioT-400NA
strong>הכרחי גם:מערכת טיהור פלאש
אוטומטית (השתמשנו ב-Buchi Reveleris X2) עמודת HPLC Buchi
C18 (Zorbax Eclipse XDB-C18)זריזה
המסוגלת ל-10,000 x גרם
עמודת HPLC כיראלית (תאית לוקס-3), 250 x 4.6 מ"מ, 5 ומיקרו; M, 1000 Å)של פנומנקס
: משפך הפרדה של 2 ליטר, כוסות וצלוחיות ארלנמאייר בקיבולת של 1000-2000 ליטר, בקבוקונים של 20 מ"ל, בקבוקוני HPLC, צלוחיות קטנות עם תחתית עגולה ומוטות ערבוב
HPLC (אנו משתמשים במשאבה אנליטית Shimadzu Prominence LC-20AT וגלאי SPD-20A UV-visShimadzu
Nanodrop 2000 Thermo-Fisher Scientific
NMRNMR: ספקטרומטר Agilent DD2 (500 מגה-הרץ)
מאייד סיבוביBuchi
Sonic dismembrator או הומוגנייזר קוליCole-Parmer
' ' <צנטריפוגה אספקה לכימיה כללית . ספקטרופוטומטר

מקורות

  1. Campbell, W. B., Gebremedhin, D., Pratt, P. F., Harder, D. R. Identification of epoxyeicosatrienoic acids as endothelium-derived hyperpolarizing factors. Circulation Research. 78, 415-423 (1996).
  2. Ulu, A., et al. An omega-3 epoxide of docosahexaenoic acid lowers blood pressure in angiotensin-II-dependent hypertension. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 64, 87-99 (2014).
  3. Ye, D., et al. Cytochrome p-450 epoxygenase metabolites of docosahexaenoate potently dilate coronary arterioles by activating large-conductance calcium-activated potassium channels. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 303, 768-776 (2002).
  4. Imig, J. D. Epoxyeicosatrienoic acids, hypertension, and kidney injury. Hypertension. 65, 476-682 (2015).
  5. Capozzi, M. E., Hammer, S. S., McCollum, G. W., Penn, J. S. Epoxygenated fatty acids inhibit retinal vascular inflammation. Scientific Reports. 6, 39211(2016).
  6. Zou, A. P., et al. Stereospecific effects of epoxyeicosatrienoic acids on renal vascular tone and K(+)-channel activity. American Journal of Physiology. 270, F822-F832 (1996).
  7. Lauterbach, B., et al. Cytochrome P450-dependent eicosapentaenoic acid metabolites are novel BK channel activators. Hypertension. 39, 609-613 (2002).
  8. Clarke, T. C., Black, T. I., Stussman, B. J., Barnes, P. M., Nahin, R. L. Trends in the use of complementary health approaches among adults: United States, 2002–2012. , National Center for Health Statistics. Hyattsville, MD. (2015).
  9. Mozaffarian, D., Wu, J. H. Y. Omega-3 fatty acids and cardiovascular disease. Journal of the American College of Cardiology. 58, 2047-2067 (2011).
  10. Shearer, G., Harris, W., Pederson, T., Newman, J. Detection of omega-3 oxylipins in human plasma in response to treatment with omega-3 acid ethyl esters. Journal of Lipid Research. 51, 2074-2081 (2010).
  11. Ostermann, A. I., Schebb, N. H. Effects of omega-3 fatty acid supplementation on the pattern of oxylipins: a short review about the modulation of hydroxy-, dihydroxy-, and epoxy-fatty acids. Food & Function. 8, 2355-2367 (2017).
  12. Khan, M. A., Wood, P. L. Method for the synthesis of DHA. , WO2012126088A1 (2012).
  13. Nanba, Y., Shinohara, R., Morita, M., Kobayashi, Y. Stereoselective synthesis of 17,18-epoxy derivative of EPA and stereoisomers of isoleukotoxin diol by ring-opening of TMS-substituted epoxide with dimsyl sodium. Organic and Biomolecular Chemistry. 15, 8614-8626 (2017).
  14. Cinelli, M. A., et al. Enzymatic synthesis and chemical inversion provide both enantiomers of bioactive epoxydocosapentaenoic acids. Journal of Lipid Research. 59, 2237-2252 (2018).
  15. Falck, J. R., et al. Practical, enantiospecific syntheses of 14,15-EET and leukotoxin B (vernolic acid). Tetrahedron Letters. 41, 4131-4133 (2001).
  16. Celik, A., Sperandio, D., Speight, R. E., Turner, N. Enantioselective epoxidation of linolenic acid catalyzed by cytochrome P450BM3 from Bacillus megaterium. Organic and Biomolecular Chemistry. 3, 1688-2690 (2005).
  17. Capdevila, J. H., et al. The highly stereoselective oxidation of polyunsaturated fatty acids by cytochrome P450BM-3. Journal of Biological Chemistry. 271, 22663-22671 (1996).
  18. Lucas, D., et al. Stereoselective epoxidation of the last double bond of polyunsaturated fatty acids by human cytochromes P450. Journal of Lipid Research. 51, 1125-1133 (2010).
  19. Guengerich, F. P., Martin, M. V., Sohl, C. D., Cheng, Q. Measurement of cytochrome P450 and NADPH-cytochrome P450 reductase. Nature Protocols. 4, 1245-1251 (2009).
  20. Cayman Chemical, 19,20-EpDPA. , https://www.caymanchem.com/product/10175 (2019).
  21. Graham-Lorence, S., et al. An active site substitution, F87V, converts cytochrome P450 BM-3 into a regio- and stereoselective (14S, 15R)-arachidonic acid epoxygenase. Journal of Biological Chemistry. 272, 1127-1135 (1996).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

אנזים BM3אנליזת NMRטיהור ב-HPLCספקטרומטריית מסותכרומטוגרפיה פלאשחומצות שומן אפוקסידיותחומצה דוקוזההקסנואיתחומצה ארכידונית
סינתזה אנזימטית של אפוקסי מטבוליטים של דוקוסקסהקאקאנוק, אייאיסאופנטנואית וחומצות ארכידונית
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.