אנו מציגים שיטה מועילה לסינתזה אנזימטית וטיהור של אנאנטימרים ספציפיים ובעלי מגוון רחב של חומצה ארכידונית (AA), חומצה docosahexaenoic (DHA), וחומצה eicosapentaenoic (EPA) עם שימוש של ציטוכרום בקטריאלי אנזים P450 (BM3).
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
סינתזה אנזימטית של אפוקסי מטבוליטים של דוקוסקסהקאקאנוק, אייאיסאופנטנואית וחומצות ארכידונית
במאמר זה
סיכום
תקציר
האפוקסי מטבוליטים של חומצות שומן רב בלתי רוויות שונות (PUFAs), הנקראת חומצות שומן אפוקסי, יש מגוון רחב של תפקידים בפיזיולוגיה של האדם. אלה מטבוליטים מיוצרים באופן שורש על ידי מחלקת P450 ציטוכרום של אנזימים. בגלל השפעות ביולוגיות מגוונות וחזקות שלהם, יש עניין רב בלמידה אלה מטבוליטים. קביעת התפקידים הייחודיים של מטבוליטים אלה בגוף היא משימה קשה, כמו חומצות שומן אפוקסי יש לקבל תחילה בכמויות משמעותיות עם טוהר גבוהה. קבלת תרכובות ממקורות טבעיים היא לעתים קרובות עבודה אינטנסיבית, ו לייף hydrolases מסיסים הידרו במהירות את מטבוליטים. מצד שני, קבלת אלה מטבוליטים באמצעות תגובות כימיות הוא מאוד לא יעיל, בשל הקושי של קבלת regisomers טהור, enantiomers, תשואות נמוכות, ונרחב (ויקר) טיהור. כאן, אנו מציגים סינתזה אנזימטית יעיל של 19 (s), 20 (r)-ו-16 (s), 17 (r)-האפוקסי חומצות (edps) מ-DHA באמצעות אפוקסי עם BM3, אנזים CYP450 חיידקי מבודד במקור ממלוס מקרתגו megaterium (המתבטא בקלות באסאנכיה קולי). אפיון וקביעת טוהר מתבצעים באמצעות ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית (NMR), כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים, וספקטרומטר מסה (MS). הליך זה ממחיש את היתרונות של סינתזה אנזימטית של PUFA אפוקסי מטבוליטים, והוא חל על האפוקסי של חומצות שומן אחרות, כולל חומצה ארכידונית (AA) וחומצה eאיסאופנטקאנומית (EPA) כדי לייצר את האפוקסי האנלוגי חומצות (EETs) ומוצרי אפוקסי (EEQs), בהתאמה.
מבוא
כעניין התפקיד כי חומצות שומן רב בלתי רווי (במיוחד אומגה 3 ו אומגה 6 חומצות שומן רב בלתי רווי) לשחק בביולוגיה אנושית גדל בשנים האחרונות, החוקרים הבחינו של מגוון רחב של הטבות מושך כי מטבוליטים שלהם תערוכה. במיוחד, שומן אפוקסי חומצת מטבוליטים המיוצר על ידי מחלקה P450 ציטוכרום של אנזימים היו נקודת גדול של מיקוד. לדוגמה, באפופא רבים, כולל חומצות שונות (eets), חומצות שמנת (edps) וחומצות אפוקסי (eeqs), משחקים תפקיד קריטי בוויסות לחץ הדם ודלקת1,2 ....... , מיכל שלוש , ד , 5. מעניין, enantiomers ספציפיים ו regioiso....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
התראה: נא להתייעץ עם כל גליונות הנתונים הרלוונטיים של בטיחות חומרים (MSDS) לפני השימוש בכימיקלים המפורטים.
1. ביטוי מסוג פראי BM3
- איחסן pBS-BM3 מDH5α E. coli (תרומה נדיבה של ד ר פ. אן ווקר) ב 5 מ ל של מרק LB סטרילי עם 0.5 מ"ג של אמפיצילין נוסף לתוך שפופרת תרבות 20 מ ל.
- מודטה את תרבות התא בשייקר ב 37 ° c עבור 24 שעות ב 200 rpm. להוסיף את התרבות לילה המתנע (5 מ ל) ו 100 mg של אמפיצילין L של מרק ליברות סטרילי בבקבוקון פרנבאך או Erlenmeyer אייר. נענעי ב 37 ° צ' עבור 6 h ב 200 סל"ד, ואז ב 30 ° c עבור 18 h ב 200 rpm.
- איסוף וצנטריפוגה את תרבות התא ב 4 ° צ' עבור 10 דקות ב 1,000 x g. השמט את הסופרנטנט ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כרומאטוגרמה הבזק (מבוצע באמצעות מערכת טיהור פלאש אוטומטית כפי שמתואר להלן) שהושג על ידי טיהור התערובת הגולמי מתוך מראה של אפוקסי אנזימטי מוצג באיור 1. לאחר הפרדת המוני והפרדה של האריאוינים הטהורים 16 (s), 17 (r)-Edp ו -19 (s), 20 (r)-אסטרים של מתיל edp הושגו. בדרך כלל, הם נמצאים 1:4 בקירוב ליחס 1:5, עם המוצר העיקרי להיות 19 (S), 20 (R)-edp. לא מתקבלים עוד מגזרי EDP (לדוגמה, 13, 14 או 10, 11-EDP). 1
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
אנו מציגים כאן שיטה פשוטה וחסכונית עבור הכנת שני מטבוליטים אפוקסי השפע ביותר של DHA-19, 20 ו 16, 17-EDP. חומצות שומן אפוקסי אלה ניתן להכין ב enantiopure מאוד (כמו S שלהם , R-איזוers) טופס באמצעות האנזים BM3 סוג פראי. כמה נקודות קריטיות שניתן להשתמש בהם לפתרון בעיות, ואת השלוחה של השיטה שלנו להכנת אפוקסי אנאנטיפורה מטבוליטים של AA ו-EPA, מתוארים להלן.
BM3 הנחיות לאחסון
אחסון האנזים BM3 מטוהרים אפשרי על ידי ערבוב תמיסת חלבון עם נפח שווה של גל.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין קונפליקטים של עניין לגלות.
תודות
עבודה זו ממומנת על ידי R00 ES024806 (המכון הלאומי לבריאות), DMS-1761320 (הקרן הלאומית למדע) וכספי הפעלה מאוניברסיטת מישיגן סטייט. המחברים מבקשים להודות לד ר ג'ון יאנג (אוניברסיטת קליפורניה בדיוויס) ולליתה קראלה (אונ' מישיגן) לסיוע במיטוב התגובה האנזימטית, וד ר טוני שילמילר (MSU טבולומיקס מאסה ספקטרומטר מתקן ומיתקן) לקבלת סיוע ברכישת נתונים HRMS.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| אמוניום ביקרבונט | סיגמא | 9830 | NA |
| אמפיצילין | GoldBio | A30125 | NA |
| מגנזיום גופרתי נטול מים | Fisher Scientific | M65-3 | NA |
| מתנול נטול מים | Sigma-Aldrich | 322515 | NA |
| נתרן גופרתי נטול מים | Fisher Scientific | S421-500 | NA |
| נטול מים טולואן | סיגמא-אולדריץ | 244511 | NA |
| חומצה ארכידונית (AA) | Nu-Chek Prep | U-71A | רגיש לאוויר. |
| דיאתיל אתר | סיגמא | 296082 | NA |
| DMSO (דרגת ביולוגיה מולקולרית) | סיגמא-אולדריץ' | D8418 | NA |
| חומצה דוקוסהקסאנואית (DHA) | Nu-Chek Prep | U-84A | רגיש לאוויר. |
| EDTA (חומצה אתילנדיאמינטטראצטית) | Invitrogen | 15576028 | NA |
| חומצה איקוסאפנטאנואית (EPA) | מכינה Nu-Chek | U-99A | רגיש לאוויר. |
| אתיל אצטט | סיגמא | 34858 | |
| מחסניות עמודות פלאש NA 25, 40, 4, 12 גרם גדלים | Fisher Scientific | 145170203, 145154064, 5170200 | לחלופין, ניתן להשתמש בכרומטוגרפיה של עמודות קונבנציונלית |
| חומצה פורמית (דרגת HPLC) | J.T. Baker | 0128-01 | NA |
| גליצרול | סיגמא | G7757 | NA |
| הקסנים | VWR | BDH24575 | מרק |
| NA LBSigma | L3022 | NA | |
| ליתיום הידרוקסיד | סיגמא-אולדריץ' | 442410 | NA |
| מגנזיום כלוריד | פישר סיינטיפיק | 2444-01 | NA |
| מתנול (בדרגת HPLC) | סיגמא-אולדריץ' | 34860-41-R | NA |
| NADPH מלח טטרסודיום | סיגמא-אולדריץ | 481973 | רגיש לאוויר. |
| חומצה אוקסלית | Sigma-Aldrich | 194131 | NA |
| pBS-BM3 שעבר טרנספטציה DH5 ואלפא; E. coli | NA | NA | |
| PMSF (פנילמתאן סולפוניל פלואוריד) | Sigma | P7626 | רעיל! |
| אשלגן פרמנגנט | סיגמא-אולדריץ' | 223468 | לצביעה TLC. |
| אשלגן פוספט דו-בסיסי | סיגמא | 795496 | NA |
| אשלגן פוספט מונו-בסיסי | סיגמא | 795488 | NA |
| Q שרף זרימה מהירה (GE Healthcare מדעי החיים) | פישר סיינטיפיק | 17-0515-01 | לטיהור חילופי אניונים של האנזים |
| נתרן כלורי | סיגמא | 71376 | NA |
| טטרהידרופורן, | סיגמא-אולדריץ' נטול מים | 186562 | NA |
| TMS-דיאזומתאן (2.0 מ' בהקסאנים) | סיגמא-אולדריץ' | 362832 | רעיל מאוד. |
| Tris-HCl | GoldBio | T-400 | NA |
| strong>הכרחי גם:מערכת טיהור פלאש | |||
| אוטומטית (השתמשנו ב-Buchi Reveleris X2) | עמודת HPLC Buchi | ||
| C18 (Zorbax Eclipse XDB-C18) | זריזה | ||
| המסוגלת ל-10,000 x גרם | |||
| עמודת HPLC כיראלית (תאית לוקס-3), 250 x 4.6 מ"מ, 5 ומיקרו; M, 1000 Å) | של פנומנקס | ||
| : משפך הפרדה של 2 ליטר, כוסות וצלוחיות ארלנמאייר בקיבולת של 1000-2000 ליטר, בקבוקונים של 20 מ"ל, בקבוקוני HPLC, צלוחיות קטנות עם תחתית עגולה ומוטות ערבוב | |||
| HPLC (אנו משתמשים במשאבה אנליטית Shimadzu Prominence LC-20AT וגלאי SPD-20A UV-vis | Shimadzu | ||
| Nanodrop 2000 | Thermo-Fisher Scientific | ||
| NMR | NMR: ספקטרומטר Agilent DD2 (500 מגה-הרץ) | ||
| מאייד סיבובי | Buchi | ||
| Sonic dismembrator או הומוגנייזר קולי | Cole-Parmer |
מקורות
- Campbell, W. B., Gebremedhin, D., Pratt, P. F., Harder, D. R. Identification of epoxyeicosatrienoic acids as endothelium-derived hyperpolarizing factors. Circulation Research. 78, 415-423 (1996).
- Ulu, A., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
