מאמר שיטה

הקלטות אלקטרופיזיולוגיות של זרמי יונים של תא בודד תחת לחץ הטיה מוגדר היטב

6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59776

⸱

2 באוגוסט 2019

 , 
1Department of Medicine, Division of Pulmonary, Critical Care, Sleep and Allergy, University of Illinois at Chicago

במאמר זה

סיכום

המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר את חדר הזרימה המקביל של לוח הצלחת לשימוש בחקירת הפעלה בזמן אמת של ערוצי יונים מכניטיים הרגישים על ידי הטיית מתח.

תקציר

מתח הטיית נוזלים ידוע לשחק תפקיד מרכזי בפונקציה אנדותל. ברוב מיטות כלי הדם, מתח הטיה מוגבר מגדילה חריפה בזרימת הדם מעורר אשד איתות וכתוצאה מכך ובכך מקלה על לחץ מכני על הקיר כלי הדם. הדפוס של מתח הטיה ידוע גם להיות גורם קריטי בפיתוח טרשת עורקים עם מלבינו להטות את הלחץ להיות atherop, מופרע להטות מתח להיות pro-atherגנטית. בעוד יש לנו הבנה מפורטת של מסלולים שונים של תא ביניים איתות, הקולטנים הראשונים לתרגם את הגירוי המכני לתוך מגשרים כימיים לא מובנים לחלוטין. ערוצי יונים מכניתרגישים באופן קריטי לתגובה להטיה ולוויסות איתות התא המושרה להטיה ובכך שליטה בייצור מגשרים של vasoactive. ערוצים אלה הם בין הרכיבים המוקדמים ביותר המופעל איתות כדי להטות וקושרו המושרה להטות הנגרמת באמצעות קידום הייצור תחמוצת החנקן (g., מבפנים לתקן K+ [קיר] פוטנציאל קולטן ארעי [trp] ערוצים) ו מקדם היפרפרזת היתר (למשל, קיר והפעלת סידן K+ [kca] ערוצים) ו להטות המושרה באמצעות מנגנון לא נקבע המערבת ערוצי piezo. הבנת המנגנון הביופיזיקלי שדרכו ערוצים אלה מופעלים על-ידי כוחות הטיה (כלומר, ישירות או באמצעות קולטן מכונאי ראשי) יכול לספק מטרות חדשות פוטנציאליות כדי לפתור את הפתופסולוגיה הקשורים בתפקוד האנדותל ו atherogenesis. זה עדיין האתגר העיקרי להקליט הפעלת זרימה המושרה של ערוצי יון בזמן אמת באמצעות אלקטרופיזיולוגיה. השיטות הסטנדרטיות לחשוף תאים למתח הטיה מוגדר היטב, כגון חרוט ולוחית הצלחת ומתח מקביל לוחית הלוח לא מאפשרים מחקר בזמן אמת של הפעלת ערוץ יונים. המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר תא זרימה שונה של הלוח המקביל המאפשר הקלטה בזמן אמת אלקטרופיסיולוגית של ערוצי יון מכונאי מוגדר תחת לחץ הטיה מוגדרים היטב.

מבוא

כוחות הומודינמיים המופקים על ידי זרימת הדם ידועים לשחק תפקידים מרכזיים בפונקציה אנדותל ובתפקוד כלי דם1,2. כמו כן ידוע גם כי מספר סוגים של ערוצי יונים בחריפות להגיב לשינויים בלחץ הטיה3,4,5 המוביל ההשערה כי ערוצי יון יכול להיות ראשי מתח להטות חיישנים. לאחרונה, אנו ואחרים הראו כי ערוצי היונים הרגישים מאוד לשחק תפקידים קריטיים בכמה פונקציות המתח להטות-לחץ רגיש, כולל התגובה vasoactive כדי להטות את הלחץ6,7,8 ואנגיוגנזה התפתחותי9. לעומת זאת, המנגנונים של רגישות ההטיה של ערוצי היונים אינם ידועים כמעט לחלוטין. פער הידע הזה עשוי להיות בשל הקושי הטכני של ביצוע הקלטות אלקטרופיזיולוגיות תחת לחץ גזירה מוגדר היטב. במאמר זה, לכן, אנו מספקים צעד אחר צעד פרוטוקול מפורט באופן שגרתי במעבדה שלנו כדי להשיג את המטרה הזאת6,7,10,11.

המטרה הכוללת של שיטה זו היא לאפשר חקירה בזמן אמת של ערוץ יון מכונאי תחת מוגדר להדגיש הטיה בטווח הפיזיולוגי. זה מושגת על ידי שינוי תא מקביל לוחית הלוח המקביל כדי לאפשר לצינורות אלקטרופיזיולוגיה להיות מופחת לתוך התאים לתאי הגישה גדל על הלוח התחתון בזמן חשיפה ממשית לזרום, מתן גישה ייחודית כדי להשיג את זה . מטרה6,7,11 לעומת זאת, תאים סטנדרטיים מקבילים לוחות הלוח, המתואר בפרסומים קודמים ניתן להשתמש עבור ניתוח הדמיה בזמן אמת של תאים חשופים כוחות הטיה12 או אחרים שאינם פולשנית גישות13,14 אבל לא עבור אלקטרופיזיולוגיה. באופן דומה, חרוט ומכשיר צלחת, עוד גישה רבת עוצמה כדי לחשוף את התאים כדי להטות את הלחץ15,16 הוא גם לא מתאים הקלטות אלקטרופיזיולוגיות. לפיכך, מתקני זרימה אלה אינם מאפשרים את החקירה של הטיית הרגישות של ערוצי יונים. הקושי בביצוע הקלטות אלקטרופיזיולוגיות מתחת לזרימה הוא הסיבה העיקרית לפאולעיר המידע על המנגנונים האחראים להשפעות הקריטיות הללו.

מבחינת הגישות החלופיות להשגת אותה מטרה, אין כאלה מדויקים או מבוקרים. כמה מחקרים קודמים ניסו להקליט את הפעילות ערוץ יון תחת הזרימה על ידי חשיפת תאים לזרם של נוזל המגיע מצינורות אחרים הביא לקרבת תא מ17,18. זה מאוד לא פיזיולוגי, כמו כוחות מכניים שנוצרו בתנאים אלה יש מעט משותף עם פרופילים פיזיולוגיים של מתח הטיה בכלי הדם. חששות דומים חלים על ניסיונות לדמות לחץ הטיה פיסיולוגיים על ידי הפרזיה של התאים הפתוחים. כפי שנדונו בפירוט במחקר המוקדם שלנו10, ממשק פתוח באוויר הנוזלי יוצר הפרעות מרובות, שאינן פיזיולוגיות. כדי לטפל בכל החששות האלה, עיצבנו לוחית מקבילית שונה (MPP) תא זרימה, המכונה גם "מכשיר הזרמת מינימלית פולשנית" במחקרים המוקדמים שלנו6,7,10,11, עשה מאקריליק ושימוש נרחב במעבדה שלנו. עם זאת, למרות העובדה כי התיאור המקורי של העיצוב פורסם כמעט לפני 20 שנה והוא מכשיר הזרימה היחיד המאפשר ביצוע הקלטות אלקטרופיזיולוגיות תחת מוגדרים היטב להדגיש הטיה, מתודולוגיה זו לא היתה שאומצה על-ידי מעבדות אחרות ויש רק מעט מחקרים שמנסים להקליט זרמים בזרם. אנו מאמינים, אפוא, כי מתן תיאור מפורט עבור שימוש בחדר הזרימה MPP יהיה לעזר רב למחקרים המעוניינים בערוצי יון ומכנירגישים וביולוגיה כלי דם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

השימוש בבעלי חיים בלימודים שלנו מאושר על ידי אוניברסיטת אילינוי בוועדת הטיפול בבעלי חיים בשיקגו (16-183).

1. הרכבת לשכת הזרם של הלוח המקביל המתוקן

הערה: נא עיין בטבלה 1 ובאיור 1 עבור מזהי החלקים הקאמריים של זרימת MPP. אנא התייחס לאיור 1 עבור סכמטי המפרט את כיוון הכלים הקאמריים להרכבה.

  1. כדי לדבוק זכוכית כיסוי מלבני, פיסת D, לחלק התחתון של פיסת C, תחילה להפוך את הפתרון אלסטורר סיליקון על-ידי ערבוב ביסודיות 500 μL סיליקון אלסטוייר לריפוי סוכן לתוך 5 מ ל של בסיס אלסטומר סיליקון.
  2. להחיל שכבה דקה של הפתרון elastomer סיליקון סביב הקצוות של החלל המלבני של פיסת C ובעדינות למקם את העטיפה מלבני זכוכית פיסת D ישירות על הפתרון elastomer כגון זה חתיכת D מכסה לחלוטין את החלל מלבני פתוח של פיסת C. נגב בזהירות את התמיסה העודפת של אלסטומר סיליקון.
  3. חזור על שלב 1.2 עבור שמירה על זכוכית העטיפה המלבנית, פיסת F, לחלק התחתון של פיסת E ולאפשר פתרון אלסטונר סיליקון לריפוי בלילה בטמפרטורת החדר.
    הערה: לאחר שנרפא, הזכוכית המכסה מלבני יישאר במשך עד שישה חודשים לפני הצורך להיות מוחלף.
  4. החל עם פיסת החדר התחתון, חתיכת E, להרכיב את החדר לזרום MPP ידי ברציפות הצבת כל פיסת על גבי הקודם בסדר הבא: פיסה E (למטה), חתיכה C, חתיכת B, piece A (למעלה).
  5. יישר את חורי הברגים של כל חתיכה בפינות והברג בחוזקה את החלקים ביחד כדי למנוע התרחשות של דליפות בעת ניהול הזרימה אל תא זרימת MPP.

2. תא הכנה וזריעה לתוך תא הזרמת MPP

הערה: בצע את שלבים 2.1-2.7 על תאי האנדותל התרבותי. בצע את השיטה המפורטת בשלבים 2.8-2.14 לבידוד תאי האנדותל מתוך ארקייד עורקי העכבר והכנת תאי האנדותל הבודדים הטריים.

  1. בצלחת 6-הבאר, במקום 4 כדי 5 12 מ"מ לכסות עיגולים זכוכית/גם תאים זרע בין 10% ו 30% שטף כזה תאים בודדים ניתן לגשת עבור הקלטות אלקטרופיזיולוגיות.
  2. התאים מודניים תחת תנאי תרבות סטנדרטיים (5% CO2, 37 ° c) עבור לא פחות מ 2 h כדי לאפשר לתאים לדבוק ולא יותר 24 שעות כמו תאים אנדותל בניסיון המחברים להיות שטוח מאוד וקשה תיקון כאשר הזרע בתוך משנה שליטה עבור יותר מ -24 h.
  3. הסרת זכוכית כיסוי המכילה תאים דבק מבאר של 6-היטב צלחת, לשטוף במהירות מלוחים באגירה פוספט (PBS), ולהעביר לצלחת פטרי 35 מ"מ המכיל 2 מוצרי אמבטיה אלקטרולוגיים (שולחן 2) לפני העברה לזרימת MPP קאמרית.
  4. העבר את העיגול זכוכית המכסה את הזכוכית לכסות מלבני, פיסת D, אשר דבקה של פיסת C של תא הזרימה MPP להיות בטוח כי פתרון הולם נשאר על הזכוכית לכסות כך תאים לא להיות חשופים לאוויר. הוסף את פתרון האמבטיה הרצוי (~ 250 μL) אל התאים כך שמעגל הזכוכית והתאים המכסה שקועים לחלוטין בתמיסה.
  5. מקמו את מעגל זכוכית המכסה כך שהוא נח במחצית הקרובה בצד של מאגר הוואקום, כך תאים יהיו בקנה אחד עם פתחי החריץ של פיסת B. ודא כי מעגל כיסוי הזכוכית דבק D דרך הפתרון-הדבקה זכוכית כך יישום של הזרימה אל החדר אינה משבש את מיקומו של מעגל הזכוכית המכסה.
  6. הכנס את תא זרימת MPP על-ידי התעסקות בחלקים בסדר המתאים, כמתואר בשלבים 1.4 ו-1.5 וכמוצג באיור 1. להעביר את החדר לשלב המיקרוסקופ ומיד מיד בחדר עם פתרון אמבטיה כזה הפתרון מגיע למאגר הוואקום לשאיפה (~ 10 mL).
  7. זיהוי תא בריא לניסוי על-ידי זיהוי תא באמצעות גבול כהה וגרעין ברור. הימנע מתאים הנראים כבלתרים או תאים הנמצאים בקשר עם תאים אחרים.
    הערה: במעבדת המחברים, משתמשים בתאי אבי העורקים האנושיים ובתאים הראשוניים של העכבר הראשי בתרבות. עם זאת, כל סוג אחר של תא חסיד שהוא עניין צרכי מחקר ספציפיים ניתן להשתמש באותו אופן.
  8. שטוף ארקייד עורקים מבודדים בתמיסה הדיסוציאציה (שולחן 2). העבר את הארקייד לצינורית צנטריפוגה של 2 מ ל המכילה 2 מ ל של פתרון דיסוציאציה מחומם (37 ° c) (מתכון לפתרון הדיסוציאציה המוצג בטבלה 2) המכיל פרוטאז נייטרלי (0.5 Mg/ml) ו elastase (0.5 Mg/ml). דגירה של 1 h ב 37 ° צ' עם טלטול עדין כל 10 דקות.
  9. הסר 1 mL של הפתרון הניטרלי פרוטאז/elastase דיסוציאציה ולהוסיף 1 מ"ג/mL קולגן סוג 1. החזר את הפתרון הקולגן לפתרון המכיל את העורקים עבור כקולגן הסופי סוג 1 ריכוז של 0.5 mg/mL. מודקון עבור 2 עד 3 דקות ב 37 ° c.
  10. שימוש 5 מלקחיים כיתה, במהירות להעביר את הארקייד אל הצלחת פטרי 35 מ"מ המכילים ירידה של 750 μL של פתרון הדיסוציאציה רענן, מקורר. עוד לנתק את הרקמה באמצעות 2 20 G מזרק מחטים לשחרור מכני תאים אנדותל מעורקים מתעכל אנזימטי.
  11. באמצעות 9 "חד פעמי מזכוכית פסטר, קצוצות פתרון התא 10x לפני העברת התאים שפופרת חדש 1.5 mL צנטריפוגה באמצעות הזכוכית pipet.
  12. שטוף את צלחת פטרי עם עוד 750 μL של פתרון הדיסוציאציה והעבר לאותה צינורית. באמצעות הצינורות זכוכית, עוד לפזר מכנית את התאים על ידי ליטוף לפחות 10x כדי ליצור תא הבולם היחיד נזהר לא להציג בועות שעלולות לגרום נזק לשלמות התא של האנדותל.
  13. הוסף 750 μL של השעיית התא האנדותל (~ 500-1000) ישירות כדי לחלק D של תא הזרימה MPP על החצי הקרוב ביותר של ואקום בצד המאגר. אפשר לתאי האנדותל לדבוק בין 45 דקות ו-1 h בטמפרטורת החדר.
  14. הכנס את תא זרימת MPP על-ידי התעסקות בחלקים בסדר המתאים כמתואר בשלבים 1.4 ו-1.5 וכמוצג באיור 1. העבר את החדר לשלב המיקרוסקופ והוא מיד מבצע את החדר עם פתרון האמבטיה כך הפתרון מגיע שאיפה ואקום (~ 10 mL). זיהוי תאי האנדותל הנגישים באמצעות הפנוטיפ הגולמי והעגול שלהם19,20.
    הערה: מגוון שיטות עיכול וקוקטיילים אנזימים שימשו לבידוד תאי האנדותל ממיטות עורקים שונות. ראה שולחן 3 לתיאורים מפורטים של פרוטוקולים ששימשו מגוון חוקרים לבידוד תאי האנדותל לצורך הדבקת מהדק של שימוש בערוצי יון מכניקלים. שיטות אלה עשויות להתאים לשימוש בשילוב עם תא הזרימה MPP.

3. שליטה במתח הטיה לחדר הזרמת MPP עבור הקלטות אלקטרופיזיולוגיות של הטיה-ערוצי יון-מכניתרגישים מופעלים

  1. הגדרת מערכת הכבידה זלוף על ידי חיבור 30 mL בוגר גליל מזרק למנעול 3-way לנעול מצויד צינורות microbore (בקוטר פנימי: 0.05 אינץ ', קוטר החיצוני: 0.09 אינץ ') מתאים הכניסה לתוך החור בקוטר 3 מ"מ של פיסת a של MPP קאמרית.
  2. חברו את גליל הסיום לפנים החיצוניות של כלוב פאראדיי שמסביב למעטה האלקטרופיזיולוגיה (איור 2) תוך שימוש בטייפ דו-צידי. לפני החדרת אבובים בחדר MPP, למלא מראש את המזרק ואבובים עם פתרון אמבטיה (ראה שולחן 2 עבור הפתרון אמבטיה המשמש לחקירת מבפנים K+ ערוצים בתאי האנדותל). הכנס את הצינורות לתוך חור הזרימה של הזרם MPP של חתיכה A.
  3. טרום למלא את תא הזרימה MPP עם פתרון כזה הפתרון הוא הוסר במאגר ואקום. להפסיק לזרום לחדר ולמלא את גליל הסיום לסמן העליון. לחשב את קצב הזרימה באופן ידני על ידי מתן הפתרון לזרום דרך החדר ובאמצעות לעצור-שעון כדי לחשב mL/s בגובה מזרק שניתנו צילינדר.
  4. הרימו או הורידו את המזרק כדי לשנות את הזרימה, ובכך להטות את החדר, ולהמשיך בתהליך זה עד שתימצא רמה רצויה של מתח הטיה.
  5. חישוב לחץ הטיה בתא מקביל באמצעות המשוואה הבאה21:
    τ = 6μQ/h2w
    כאשר μ = צמיגות של נוזלים (גר'/cm · s), Q = קצב הזרימה (mL/s), ורוחב חדר הצלחת המקביל (w = 2.2 ס מ) וגובה (h = 0.1 ס מ).
    הערה: במערכת הכבידה הנוכחית מערכת, בגובה גליל מזרק (כפי שנמדד מראש גליל) של 57 ס מ מעל לשלב המיקרוסקופ, קצב הזרימה הוא 0.3 mL/s. ההטיה מחושבת בחדר בגובה גליל זה מזרק ושיעור הזרימה הוא 0.7 דינמיקה/cm2. כמו כן יש לציין כי מערכות פרסטזיה אחרות, כגון משאבה פריסטלטית, יכולות לשמש לשליטה בזרימה לחדר הזרימה של MPP. עם זאת, התקנים אלה עשויים להוסיף מערבולות לא רצויות ויציבות השפעה של מדידות אלקטרופיזיולוגיה בזרימה, ולכן, באמצעות מערכת הכבידה שתוארה כאן מומלץ.
  6. העבר חדר מורכב המכיל תאים הדבקה לשלב המיקרוסקופ של המתקן אלקטרופיזיולוגיה ולהכניס את האבובים מתמלא מראש עם פתרון אמבטיה לתוך החור של פיסת A. במקביל למלא את התא ולשטוף את התאים עם 10 מ ל של פתרון אמבטיה על ידי הפיכת המנעול התלת-ממדי לנעול כגון הפתרון זורם אל החדר.
  7. לאחר קביעת תצורת התיקון הרצויה מושגת בהצלחה לאפשר זרמי הערוץ לייצב באמבט סטטי בטמפרטורת החדר. פעם הזרמים התייצב, להחיל את ההטיה באופן צעד נבון המאפשר עליות בזרם לייצב לפני להגדיל את השלב הבא במתח הטיה.
    הערה: המחברים מוצאים את ההצלחה הגדולה ביותר עם תצורת טלאי מחורר בעת לימוד ערוצי יון מכניתפעילים בתאי האנדותל. כדי לבצע מחורר התיקון השלם בתאים, להוסיף 5 μl של 60 mg/mL מלאי אמפוריטיצין B ב diמתיל סולפוקסיד (dmso) ל 1 מ ל של 0.2 יקרומטר מסוננים ניקוי הפתרון צנרת. לאחר יצירת חותמת giga-אוהם בתצורה המצורפת לתא, מחורר את הצורה של תיקוני תאים שלמים בתוך 2 עד 5 דקות.
  8. להסיר את החשיפה הטיה לתאים על ידי עצירת זרימת לחדר לאפשר זרמים מכנימים רגישים לחזור זרמים בסיסיים נצפתה באמבט סטטי.
  9. בידוד זרמים מכונאי ערוץ יון של עניין על ידי שינוי הערכיות הפתרון (למשל, 60 mM K+ בפתרון אמבטיה עם 0 Ca2 + בתמיסה הפיפטה כדי ללמוד מבפנים K + ערוצים. Table 2 מציג מתכוני פתרון לדוגמה) ו/או עיכוב תרופתי של מקורות נוכחיים העלולים לזהם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

תצלומים מרובים המציגים תצוגות שונות של תא הזרימה MPP על הבמה המיקרוסקופ (הפאנל העליון) וייצוג סכמטי של תא הזרימה MPP (הפאנל התחתון) מוצגים באיור 1. הסכמטי מפרט את הממדים של המתקן כולו ותאי הזרימה. איור 2 מראה תצלום של מערכת הכבידה של המערכת לחדר הזרמת MPP במעבדה שלנו (הפאנל העליון). המוצג גם הוא ייצוג סכמטי של מערכת הזרימה (הפאנל התחתון) נועד להדגיש את השלבים אשר לבודד את התאים בחדר הזרימה מן העומס של הפתרון מן המערכת זלוף ואת הכ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מערכת כלי הדם נחשפת כל הזמן לכוחות המטדינאמיים הפעילים, המפעילים את ערוצי היון המכניים3,22 אך התפקידים הפיזיולוגיים של הערוצים הללו בהטיה הנגרמת רק . מתחילים להופיע4,6,8 המנגנונים האחראים לרגישות המנגנון של התעלות המופעלות במתחים, נותרים בלתי ידועים. הפרוטוקול המפורט כאן מתאר את השיטה לחקירה ישירה של ערוצי יונים מכניביים החשופים למתח מאוזן בזמן אמת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

עבודה זו ממומנת על ידי הלב הלאומי, ריאות, ובדם המכון (R01 HL073965, IL) ו (T32 HL007829-24, קרן הלאומית). המחברים גם רוצה להכיר את המכונה המדעית חנות באוניברסיטת אילינוי בשיקגו להפקת שלנו האחרונים שלנו לתאי זרימה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.2 ומיקרו; מסנני מזרק סטריליים mVWR28145-501משמש לסינון תמיסת פיפטה אלקטרופיזיולוגית
5 מלקחיים בדרגהFine Scientific Tools1252-30משמש להעברת עורקים מעוכלים לתמיסה טרייה
9 אינץ' פסטר פיפטפישר Scientifc13-678-20Dמשמש לשיבוש מכני של עורקים מעוכלים והעברת תאים אנדוטליאליים מבודדים טריים 
קוטר 12 מ"מ כיסוי עיגולי זכוכיתFisher Scientifc12-545-80לשימוש עם מחקרים הכוללים תאים מתורבתים וטיפולים מרובים. תאים המודבקים לזכוכית הכיסוי משמשים לניתוחי מהדק תיקון
24 מ"מ x 40 מ"מ זכוכית כיסוי מלבניתSigma-AldrichCLS2975224 זכוכית כיסוי להוספת חלקי תא זרימה MPP C (איור 1)
24 מ"מ x 50 מ"מ זכוכית כיסוי מלבניתSigma-AldrichCLS2975245זכוכית כיסוי לתוספת לתא זרימת MPP E (איור 1)
מחטי מזרק 20 GBecton Dickinson and Co305175לשימוש בשיבוש מכני של עורקים מזנטריים מעוכלים
צלחת פטרי 35 מ"מGenesee Scientific32-103לשימוש בשיבוש מכני של עורקים מזנטרים מעוכלים
Amphotericin B מסיסSigma-AldrichA9528-50MGמשמש ליצירת תצורת תיקון תא שלם מחורר.
קולגנאז, סוג Iוורת'ינגטון ביוכימי100 מ"ג - LS004194אנזים המשמש במעבדתנו כעיכול קצר לאחר הקוקטייל הראשוני של פרוטאז ניטרלי ואלסטאז
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)פישר סיינטיפיק67-68-5ממס לאמפוטריצין B המשמש במהדק טלאי מחורר של תאים שלמים
אלסטאז, ליופיליזציהוורת'ינגטון ביוכימי25 מ"ג - LS002290 אנזים המשמש במעבדה שלנו בקוקטייל עם פרוטאז/דיספאז ניטרלי להתחלת עיכול העורקים לבידוד תאי אנדותל.
צלחת תרבית רקמות פלקון, 6 בארות, תחתית שטוחה עם מכסה אידוי נמוך קורנינג353046לשימוש עם מחקרים הכוללים תאים מתורבתים וטיפולים מרובים
פרוטאז ניטרלי/דיספאזוורת'ינגטון ביוכימי10 מ"ג-LS02100 50 מ"ג - LS02104אנזים המשמש במעבדה שלנו בקוקטייל עם אלסטאז להתחלת עיכול העורקים לבידוד תאי אנדותל
SylGard World Precision InstrumentsSYLG184אלסטומר סיליקון להדבקת החלקת הכיסוי המלבני לחלקי תא הזרימה MPP C ו-E (איור 1)
Tygon ND 10-80 צינורותMicrobore AAQ04133מזהה: 0.05 אינץ', OD: 0.09 אינץ', צינורות זלוף כניסה לניהול זרימה לתא

מקורות

  1. Green, D. J., Hopman, M. T., Padilla, J., Laughlin, M. H., Thijssen, D. H. Vascular Adaptation to Exercise in Humans: Role of Hemodynamic Stimuli. Physiological Reviews. 97 (2), 495-528 (2017).
  2. Gimbrone, M. A. Jr, Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. Endothelial dysfunction, hemodynamic forces, and atherogenesis. Annals of the New York Academy of Sciences. 902, discussion 239-240 230-239 (2000).
  3. Olesen, S. P., Clapham, D. E., Davies, P. F. Haemodynamic shear stress activates a K+ current in vascular endothelial cells. Nature. 331 (6152), 168-170 (1988).
  4. Barakat, A. I., Lieu, D. K., Gojova, A. Secrets of the code: do vascular endothelial cells use ion channels to decipher complex flow signals? Biomaterials. 27 (5), 671-678 (2006).
  5. Beech, D. J. Endothelial Piezo1 channels as sensors of exercise. Journal of Physiology. 596 (6), 979-984 (2018).
  6. Ahn, S. J., et al. Inwardly rectifying K(+) channels are major contributors to flow-induced vasodilatation in resistance arteries. Journal of Physiology. 595 (7), 2339-2364 (2017).
  7. Fancher, I. S., et al. Hypercholesterolemia-Induced Loss of Flow-Induced Vasodilation and Lesion Formation in Apolipoprotein E-Deficient Mice Critically Depend on Inwardly Rectifying K(+) Channels. Journal of the American Heart Association. 7 (5), (2018).
  8. Rode, B., et al. Piezo1 channels sense whole body physical activity to reset cardiovascular homeostasis and enhance performance. Nature Communications. 8 (1), 350(2017).
  9. Li, J., et al. Piezo1 integration of vascular architecture with physiological force. Nature. 515 (7526), 279-282 (2014).
  10. Levitan, I., Helmke, B. P., Davies, P. F. A chamber to permit invasive manipulation of adherent cells in laminar flow with minimal disturbance of the flow field. Annals of Biomed Engineering. 28 (10), 1184-1193 (2000).
  11. Fang, Y., et al. Hypercholesterolemia suppresses inwardly rectifying K+ channels in aortic endothelium in vitro and in vivo. Circulation Research. 98 (8), 1064-1071 (2006).
  12. Shetty, S., Weston, C. J., Adams, D. H., Lalor, P. F. A flow adhesion assay to study leucocyte recruitment to human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of shear stress. Journal of Visualized Experiments. (85), e51330(2014).
  13. Man, H. S. J., et al. Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers. Journal of Visualized Experiments. (140), e58478(2018).
  14. White, L. A., et al. The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress. Journal of Visualized Experiments. (116), e54632(2016).
  15. Franzoni, M., et al. Design of a cone-and-plate device for controlled realistic shear stress stimulation on endothelial cell monolayers. Cytotechnology. 68 (5), 1885-1896 (2016).
  16. Dewey, C. F. Jr, Bussolari, S. R., Gimbrone, M. A. Jr, Davies, P. F. The dynamic response of vascular endothelial cells to fluid shear stress. Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 177-185 (1981).
  17. Hoger, J. H., Ilyin, V. I., Forsyth, S., Hoger, A. Shear stress regulates the endothelial Kir2.1 ion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7780-7785 (2002).
  18. Moccia, F., Villa, A., Tanzi, F. Flow-activated Na(+)and K(+)Current in cardiac microvascular endothelial cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 32 (8), 1589-1593 (2000).
  19. Crane, G. J., Walker, S. D., Dora, K. A., Garland, C. J. Evidence for a differential cellular distribution of inward rectifier K channels in the rat isolated mesenteric artery. Journal of Vascular Research. 40 (2), 159-168 (2003).
  20. Hannah, R. M., Dunn, K. M., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Endothelial SK(Ca) and IK(Ca) channels regulate brain parenchymal arteriolar diameter and cortical cerebral blood flow. Journal of Cereberal Blood Flow and Metabolism. 31 (5), 1175-1186 (2011).
  21. Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of Visualized Experiments. (59), e3349(2012).
  22. Lieu, D. K., Pappone, P. A., Barakat, A. I. Differential membrane potential and ion current responses to different types of shear stress in vascular endothelial cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (6), C1367-C1375 (2004).
  23. Le Master, E., et al. Proatherogenic Flow Increases Endothelial Stiffness via Enhanced CD36-Mediated Uptake of Oxidized Low-Density Lipoproteins. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (1), 64-75 (2018).
  24. Kim, J. G., et al. Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow. Journal of Visualized Experiments. (143), e58228(2019).
  25. Kim, J. G., et al. Fluid flow facilitates inward rectifier K(+) current by convectively restoring [K(+)] at the cell membrane surface. Scientific Reports. 6, 39585(2016).
  26. Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis. Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).
  27. Jacobs, E. R., et al. Shear activated channels in cell-attached patches of cultured bovine aortic endothelial cells. Pflugers Archiv. European Journal of Physiology. 431 (1), 129-131 (1995).
  28. Barakat, A. I., Leaver, E. V., Pappone, P. A., Davies, P. F. A flow-activated chloride-selective membrane current in vascular endothelial cells. Circulation Research. 85 (9), 820-828 (1999).
  29. Fitzgerald, T. N., et al. Laminar shear stress stimulates vascular smooth muscle cell apoptosis via the Akt pathway. Journal of Cellular Physiology. 216 (2), 389-395 (2008).
  30. Ueba, H., Kawakami, M., Yaginuma, T. Shear stress as an inhibitor of vascular smooth muscle cell proliferation. Role of transforming growth factor-beta 1 and tissue-type plasminogen activator. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17 (8), 1512-1516 (1997).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Patch Clamp

מאמרים קשורים