הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ב Vivo אימונוofor, לוקליזציה להערכת הטיפול הרפואי והאבחון ביופצת התרופות בחקר הסרטן

9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59810

⸱

16 בספטמבר 2019

 , 
1Apoptosis, Cancer and Development Laboratory - Equipe labellisée 'La Ligue', LabEx DEVweCAN, Centre de Cancérologie de Lyon, INSERM U1052-CNRS UMR5286, Centre Léon Bérard, 2Department of Radiology/Molecular Imaging Program at Stanford, School of Medicine, Stanford University

במאמר זה

סיכום

שיטת לוקליזציה vivo immunofluorescence ניתן להשתמש כדי לבחון ב vivo biodistribution של נוגדנים ושערי מעלה נוגדן למטרות אונולוגיות באורגניזמים חיים באמצעות שילוב של vivo הגידול מיקוד ולשעבר vivo חיסוני שיטות.

תקציר

נוגדנים חד-שבטיים (mAbs) הם כלים חשובים בזיהוי סרטן, אבחון וטיפול. הם משמשים כדי לפענח את התפקיד של חלבונים בטווריגנזה, ניתן להפנות בסמנים סרטניים המאפשרים איתור ואפיון הגידול, והוא יכול לשמש לטיפול בסרטן כמו mAbs או נוגדן תרופות המעלה להפעיל את התאים החיסונית החיסון, כדי לעכב איתות מסלולים, או ישירות להרוג תאים הנושאים את האנטיגן המסוים. למרות החידושים הקליניים בפיתוח וייצור של הרומן מאוד ספציפי mAbs, אבחון ויישומים טיפולית יכול להיות לקוי על ידי המורכבות והטרוגניות של מיקרוסביבה הגידול. כך, לפיתוח של טיפולים יעילים נוגדן מבוססי ודיאגנוסטיקה, זה חיוני כדי להעריך את ההתפלגות הביומלית ואינטראקציה של המשלים מבוסס נוגדן עם מיקרוסביבה הגידול החיים. כאן, אנו מתארים ב Vivo Immunofluorescence לוקליזציה (IVIL) כגישה חדשה ללמוד אינטראקציות של therapeutics מבוססי נוגדן ואבחון בתנאים פיסיולוגיים Vivo ופתולוגיים. בטכניקה זו, נוגדן טיפולי או אבחון ספציפי של אנטיגן הוא מוזרק באופן מvivo ומקומי לשעבר vivo עם נוגדן משני בגידולים מבודדים. לכן, לפיכך, משקף את vivo biodistribution של תרופות מבוססות נוגדן וסוכני מיקוד. שני יישומים IVIL מתוארים הערכת ביוהפצה ונגישות של סוכני ניגודיות מבוססי נוגדן עבור דימות מולקולרי של סרטן השד. פרוטוקול זה יאפשר למשתמשים עתידיים להתאים את שיטת ה-IVIL עבור יישומי מחקר מבוססי נוגדן שלהם.

מבוא

נוגדנים חד-שבטיים (mAb) הם גליקורופנים גדולים (כ 150 kDa) של משפחת האימונוגלובולין המופרש על ידי תאי B ויש להם תפקיד עיקרי במערכת החיסונית כדי לזהות ולעכב את הפונקציה הביולוגית של, או לסמן עבור הרס, חיידקי או נגיפי פתוגנים, והוא יכול לזהות ביטוי חלבון חריג על תאים סרטניים1. נוגדנים יכולים להיות אהדה גבוהה מאוד האפיסקופים הספציפיים שלהם למטה בריכוזים של הנשים הללו הופכים אותם כלים מבטיחים ביותר ביודיקטנין2. עם פיתוח הטכנולוגיה היפידים על ידי מילשטיין ו Köהלר (הוענק פרס נובל ב 1984), הייצור של mAbs הפכה אפשרית3. מאוחר יותר, mabs האדם נוצרו באמצעות טכנולוגיית התצוגה phage או זנים העכבר הטרנסגניים מהפכה שלהם לשימוש ככלי מחקר הרומן therapeutics4,5.

סרטן הוא נושא בריאות ברחבי העולם והגורם העיקרי של המוות יצירת הצורך גישות הרומן למניעת, זיהוי, וטיפול6. עד כה, mAbs אפשרו extrication של התפקיד של גנים והחלבונים שלהם בטומגנזה וכאשר מכוונים נגד בדיקות סרטן, יכול לאפשר זיהוי גידולים ואפיון עבור המטופל ריבוד. עבור טיפול בסרטן, mAbs מיוחד, נוגדן סמים שערי מעלה, ושברי נוגדנים קטנים מפותחים כמו therapeutics, ועל מסירת התרופה ממוקד כדי לשפר את היעילות הטיפולית7. בנוסף, נוגדנים לשרת מיקוד הסמנים של סוכני ניגודיות עבור הדמיה מולקולרית שיטות כגון כירורגיה פלואורסצנטית מונחה, פוטואקוסטית (PA) הדמיה, אולטרסאונד (ארה ב) הדמיה מולקולרית, ו קלינית פליטת פוזיטרון טומוגרפיה ממוחשבת (PET) או טומוגרפיה ממוחשבת של פליטת פוטון (מחשב)8. לבסוף, נוגדנים יכולים לשמש גם כסוכני theranostic המאפשרים ריבוד של חולים וניטור תגובה עבור טיפולים ייעודיים9. לכן, mAbs הרומן מתחילים לשחק תפקיד קריטי באיתור סרטן, אבחון, וטיפול.

למרות החידושים הקריטיים בפיתוח וייצור של הרומן מאוד ספציפי mAbs, אבחון ויישומים טיפולית יכול להיות מעובד בלתי יעיל בשל המורכבות של סביבת הגידול. אינטראקציות הנוגדן תלויות על סוג האפירופה, כלומר, בין אםהוא ליניאריאו בקונפורמציה10. בנוסף להכרה של אנטיגנים, נוגדנים צריכים להתגבר על מחסומים טבעיים כגון קירות כלי, קרום בסיס, ואת משתית הגידול כדי להגיע לתאי היעד לבטא את האנטיגן. נוגדנים לקיים אינטראקציה עם הרקמה לא רק באמצעות משתנה כריכה אנטיגן המקטע (Fab) התחום אלא גם דרך השבר הגבישי הקבוע (Fc) אשר מוביל עוד יותר מחוץ לאתר אינטראקציות11. המיקוד הוא גם מסובך על ידי הביטוי הטרוגנית של סמנים הגידול לאורך הגידול בצובר וטרוגניות בגידול vascularization ומערכת lymphatics12,13. בנוסף, מיקרוסביבה הגידול מורכב סרטן הקשורים פיברותקיעות אשר תומכים בתאי הגידול, הגידול תאים חיסוניים לדכא את התגובות החיסונית נגד הגידול, ואת אנדותל הגידול התומך הובלה של חמצן וחומרים מזינים, כל אשר מפריעים לחדירה, להפצה ולזמינות של therapeutics או אבחון מבוססי נוגדן. בסך הכל, שיקולים אלה יכולים להגביל את היעילות הטיפולית או אבחון, להפחית את תגובת הטיפול, ועלול לגרום להתנגדות לגידול.

לכן, לפיתוח של טיפולים יעילים נוגדן מבוססי ודיאגנוסטיקה, זה חיוני כדי להעריך את ההתפלגות הביומלית ואינטראקציה של המשלים מבוססי נוגדן בתוך מיקרוסביבה הגידול. כיום, במחקרים פרה-קליניים, ביטוי סמן מודלים מחקר הגידול מנותח ex vivo על ידי immunofluorescence (IF) כתמים של סעיפים הגידול14. תקן IF כתמים מבוצע עם נוגדנים ספציפיים סמן העיקרי אשר מודגשים אז על ידי נוגדנים משני התווית על הרקמה לשעבר vivo רקמות הגידול שהיו מבודדים מהחיה. טכניקה זו מדגיש את המיקום הסטטי של הסמן בזמן קיבוע רקמות אינו מספק תובנה כיצד therapeutics מבוסס נוגדן או אבחון עשוי להפיץ או אינטראקציה בתנאים פיזיולוגיים. הדמיה מולקולרית על ידי PET, הזהיר, ארה ב, ו-PA יכול לספק מידע על התפלגות נוגדן הסוכן בניגוד מצומדת בחיים מודלים פרה8,15. כמו אלה שיטות הדמיה הם לא פולשנית, מחקרים האורך ניתן לבצע ונתונים רגישים לזמן ניתן לאסוף עם מספר מינימלי של בעלי חיים לכל קבוצה. עם זאת, אלה לא פולשני גישות הדמיה מולקולרית אינם רגישים מספיק אין להם מספיק החלטה לוקליזציה של התפלגות נוגדן ברמה התאית. בנוסף, המאפיינים הפיזיים והביולוגיים של הנוגדן העיקרי עשויים להשתנות באופן דרסטי על ידי הקוניוגציה של סוכן ניגודיות16.

על מנת לקחת את התנאים הפיזיולוגיים והפתולוגיים vivo בהתחשב באופן הפעולה המבוסס על נוגדנים therapeutics ואבחון בתוך סביבת הגידול ולהשיג התפלגות תאית ברזולוציה גבוהה ואפילו תת-תאית פרופילים של נוגדנים שאינם מצוהרים, אנו מציעים גישה IF, הנחשבים לוקליזציה Vivo Immunofluorescence (IVIL), שבו הנוגדן הספציפי אנטיגן מוזרק באופן מידי בVivo. נוגדן מבוססי טיפול או אבחון, מתנהג כנוגדן העיקרי, מסתובב כלי דם פונקציונלי נקשר החלבון היעד שלה בסביבת הגידול מדויק מאוד, חיים בסביבה. לאחר בידוד של גידולים vivo עם הנוגדן העיקרי, נוגדן משני משמש לוקליזציה מצטבר ונשמר שערים נוגדן. גישה זו דומה לזו שתוארה בעבר אם גישה היסטולוגיה הזרקת נוגדנים מתויג באופן שכותרתו17. למרות שכאן, השימוש בנוגדנים שאינם מצופנים מונע שינוי פוטנציאלי במאפייני ההתפלגות הביומלית הנגרמת על ידי שינוי נוגדנים. יתר על כן, היישום vivo ex של נוגדן משני פלורסנט מונע אובדן אפשרי של אות פלואורסצנטית במהלך איסוף רקמות ועיבוד ומספק הגברה של עוצמת אות פלואורסצנטית. הגישה שלנו תיוג משקף vivo biodistribution של תרופות מבוססות נוגדן סוכנים ייעודיים והוא יכול לספק תובנות חשובות לפיתוח של סוכני אבחון וריפוי הרומן.

כאן, אנו מתארים שני יישומים של שיטת IVIL כפי שהוחלו במחקרים קודמים בחקירת ביוהפצה ונגישות של סוכני הניגודיות מבוססי נוגדן עבור גישות הדמיה מולקולרית לאיתור סרטן השד. ראשון, התפלגות biodistribution נוגדן-ליד צבע אינפרא אדום המשלים (anti-B7-H3 נוגדן מאוגד לצבוע בסמוך אינפרא אדום, indocyanine ירוק, B7-H3-ICG) ואת הסוכן בקרת isotype (Iso-ICG) עבור הקרינה הפלואורסצנטית ו-photoacoustic מולקולרית הדמיה מחקר18. שיטת יישום זו מתוארת בפרוטוקול. לאחר מכן, תוצאות ההתפלגות הביומלית של נוגדנים רגישים מבחינה מבצעית לנטרין -1, בדרך כלל לא לזיהוי עם הדמיה IF מסורתית, בשימוש עם דימות מולקולרי אולטרסאונד, הוא כימות והציג בתוצאות הנציג19. בסיום זה נייר פרוטוקול, הקוראים צריכים להרגיש בנוח לאמץ את שיטת ה-IVIL עבור יישומי מחקר מבוססי נוגדן שלהם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הפאנל המינהלי המוסדי על טיפול בעלי חיים מעבדה (APLAC) של אוניברסיטת סטנפורד.

1. מודל העכבר הטרנסגניים של התפתחות סרטן השד

  1. להתבונן עכברים ממודל הסרטן הרצוי לצמיחת הגידול המתאים באמצעות מישוש או קליבר מדידה לפני שתמשיך.
    הערה: כאן, המודל הטרנסגניים מורגנית של התפתחות סרטן השד (FVB/N-Tg (MMTV-PyMT) 634Mul ולטימול/J) (MMTV-PyMT) שימש. בעלי חיים אלה לפתח באופן ספונטני קרצינומה של השד פולשני בין 6 ו 12 שבועות של גיל בכל בלוטת החלב20. בלוטות החלב הרגילות שימשו כפקדים מן הטרנסגנים-שליליים, הגילאים התואמים התאומות.

2. הזרקה של גורמי נוגדן ספציפיים ולא ספציפיים

  1. לטהר את הארנב נגד עכבר B7-H3 ו ארנבת IgG שליטה נוגדנים על עמודה התפלה (g., PD-10) כדי להסיר חומרים משמרים ומאגרי אחסון בעקבות הוראות היצרן.
    הערה: נוגדנים מסוימים עשויים להזדקק לטיהור נוסף עם חלבון-מחרוזת agarose מבוסס פרוטוקול21.
  2. Aliquot המינונים של 33 μg של כל המשלים נוגדנים בצינורות מיקרוצנטריפוגה בודדים.
    הערה: המינון של הסוכן המנוהל עשוי להשתנות בהתאם ליישום ומתאים למינונים שבהם משתמש הנוגדן משמש באופן שגרתי. הריכוז של פתרונות הנוגדן נדרש אם אמצעי האחסון הוא יותר מ-100 μL עבור בטיחות בעלי חיים.
  3. בזמן הרצוי לפני איסוף הרקמה, כאן 96 h, מורדם הגידול הנושאת את בעל החיים עם 2% isof, הזורם בחמצן ב 2 L/min, ומקום על 37 ° c בשלב מחומם. לעשות צביטה הבוהן כדי לוודא את הרמה הנכונה של anesthsia הגיע לפני ההליך.
  4. כדי להתכונן לווריד הזנב של פתרונות הנוגדן, לחטא את זנב החיה על ידי ניגוב שלוש פעמים עם מנגב אלכוהול. מתרחבים ורידי הזנב על ידי התחממות עם משטח חום של כ -30 ס מ. הימנע מחימום החיה כולה. לנגב את הזנב פעם נוספת עם מחיקת אלכוהול לאחר הסרת משטח החום.
  5. באמצעות קטטר וריד הזנב 27G, להכניס את המחט פרפר לתוך אחד שני ורידים הזנב לרוחב בזהירות לתקן את הזנב עם המחט שנוספה לבמה עם פיסת קלטת כירורגית.
    הערה: זרימת הדם הנראית לעין לתוך הקטטר מציין את המיקום הנכון של המחט בתוך הווריד הזנב.
  6. ריקון קטטר עם 25 μL של מלוחים סטרילי מתכלה באגירה (PBS), ואז להזריק את פתרון הנוגדן לתוך הקטטר באמצעות מזרקים אינסולין. רוקן את הקטטר שוב עם 25 μL של PBS סטרילי.
  7. להסיר את המחט מהזנב ולהפעיל לחץ כדי לעצור דימום.
  8. לכבות את ההרדמה ולהתבונן בחיה עד שתתעורר במלואו לכל סימן של מצוקה.

3. איסוף והכנת רקמות הגידול היעד

  1. בנקודת הזמן הרצויה, המתת הומאנית החיה על פי הנוהל המוסדי המקובל, כאן, על ידי שאיפת הדרגתית של 100% CO2 מ מיכל גז דחוס עם שיעור זרם העקירה הקאמרית של 10-30% אמצעי אחסון/דקה.
    הערה: יישומים מסוימים של טכניקת ivil דורשים המתת חסד על ידי זלוף לב עם PBS כדי להסיר את הנוגדן במחזור חופשי19,22.
  2. לאחר אישור של המתת חסד הומאני באמצעות הפסקת תנועת הנשימה והלב, חוסר התגובה צביטה הבוהן, ומאפיר של קרום רירי, רקמות גידול בלו באמצעות מספריים כירורגי מלקחיים כדלקמן:
    1. הנח את העכבר בתנוחה פרקדן ואוחז רק את השכבה החיצונית של העור בין הקבוצה של בלוטות החלב הקרובה ביותר לזנב (5ה) עם מלקחיים, לעשות חתך קטן עם זוג של מספריים כירורגית.
    2. הציגו את המספריים הסגורות בתוך החתך ופתחו באיטיות את הקצה כדי להפריד בזהירות את העור מקרום הבטן המשמש כבסיס לשמירה על שלמות.
    3. ליצור חתך אנכי בבטן, המשך להפריד את העור מן הקרום הפנימי. בין בלוטות החלב3 ו -4 , לעשות חתך אופקי על פני הבטן כדי לאפשר נסיגה של העור והדמיה של בלוטותהחלב.
      הערה: גידולים ובלוטות הפטמות ממוקמים בשטחי מתחת לעור.
    4. אוחז כל גידול או בלוטה נורמלית עם מלקחיים, לקצץ בזהירות את העור המצורפת באמצעות מספריים כירורגי.
  3. מניחים רקמות מחעלות לתוך בסיס לרקמות חד פעמיות, מסומנים ומלאים בטמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) הטבעה בינונית והקפאת התבניות במהירות על-ידי הצבת על קרח יבש. כדי ללמוד את מסירת היעד, בבלו רקמות אחרות או איברי עניין (למשל,הכבד או הריאות).
    הערה: כדי להשהות את הפרוטוקול בשלב זה, אחסן בלוקים של רקמות קפואות ב-80 ° צ' עד שמוכן להמשיך.
  4. באמצעות קריוסטט, מקטע בלוקים רקמות קפואות ב 10 יקרומטר עובי ומקום מקטעים סמוכים על שקופיות הדבקה מראש זכוכית.
    הערה: כדי להשהות את הפרוטוקול בנקודה זו, אחסן שקופיות ב--80 ° צ' עד שמוכן להמשיך.

4. הפרוטוקול vivo צביעת לשעבר

הערה: עבור השוואה כמותית בין תמונות מיקרוסקופ קרינה, כל השקופיות מוכתמות באותו הזמן עם אותם פתרונות מוכנים.

  1. לשטוף שקופיות רקמה קפואה עם טמפרטורת החדר PBS עבור 5 דקות כדי להסיר OCT.
  2. דדקייט מחתכי רקמה עם עט מחסום הידרופובי כדי להקטין את נפח הפתרונות הדרושים במהלך כתמים.
    הערה: היזהרו לא לאפשר לעט לרוץ על דגימות רקמות כפי שהוא יכול להסיר את הרקמה מהשקופית או למנוע כתמים מתאימים על החלק הרקמה המושפעת. אל תאפשר לפרקי הרקמה להתייבש בכל נקודה.
  3. תקן את מקטעי הרקמה עם פתרון פאראפורמלדהיד 4% עבור 5 דקות.
  4. לשטוף שקופיות ב-PBS עבור 5 דקות.
  5. החדירות סעיפים עם 0.5% טריטון-X 100 ב PBS עבור 15 דקות.
  6. לשטוף שקופיות ב-PBS עבור 5 דקות.
  7. לחסום את הרקמות עם 3% w/v סרום שור (BSA) ו 5% v/v סרום עז, הן ב-PBS (פתרון חסימת) עבור 1 h בטמפרטורת החדר.
    הערה: התאם את סרום הפתרון לחסימה לבעל החיים המשני של הנוגדן.
  8. לשטוף שקופיות ב-PBS עבור 5 דקות.
  9. מקטעים מבית הכלא עם שמירה על נוגדנים ראשוניים כרצונכם, אולי גרעין נפוץ (g., DAPI), כלי דם (g., CD31), או סמן cytoplasmic (למשל, actin). כאן, עכברוש נגד עכבר CD31 (סמן כלי דם) ב 1:100 דילול שימש על פי הוראות היצרן בפתרון חסימת לילה ב 4 ° c מוגן מהתייבשות על מגש השקופית.
    הערה: אין להוסיף נוגדן ראשי או מקשור נוגדן נוסף. המשלים שהוזרק ומותר לצבור ברקמות בvivo לפעול כמו הנוגדן העיקרי.
  10. לשטוף את השקופיות ב-PBS במשך 5 דקות שלוש פעמים, ולשנות את ה-PBS בכל פעם.
  11. המדגירה שקופיות עם נוגדנים משניים כדי לתייג נוגדנים ראשוניים. עבור יישום זה, המחש anti-B7-H3 הנוגדן באמצעות AlexaFluor-546 עז מצודת אנטי ארנבת נוגדן (1:200 דילול, אופטימיזציה על פי הוראות היצרן) ו CD31 עם AlexaFluor-488 עז אנטי עכברוש נוגדן משני (1:200 דילול, ממוטב לפי הוראות היצרן) בפתרון חסימה, מוגן מפני אור והתייבשות על מגש השקופית, עבור 1 h בטמפרטורת החדר.
    הערה: נוגדנים משניים הם מאותו בעל חיים מארח אבל להתאים את הזיקה של הנוגדנים המשני למינים המארחים של הנוגדן העיקרי המתאים. השקופיות מוגנות מאור מנקודה זו ואילך.
  12. לשטוף את השקופיות ב-PBS במשך 5 דקות שלוש פעמים, ולשנות את ה-PBS בכל פעם.
  13. להחיל טיפה אחת של מדיום ההרכבה לתוך מרכז פרוסת הרקמה ובזהירות המקום coverslip הימנעות מלכודת של בועות אוויר.
  14. לאטום את קצות שמיכות עם לק ציפורניים ברור ולאפשר ייבוש.
    הערה: כדי להשהות את הפרוטוקול של עד שבוע בנקודה זו, אחסן שקופיות ב-20 ° c עד שתהיה מוכן להמשיך.

5. הדמיה מיקרוסקופית הקונפוקלית וניתוח תמונה כמותי

הערה: הכנת מיקרוסקופ הקונמוקד ופרמטרי הדמיה יהיו תלויים במערכת החיבור המשמשת. המיקרוסקופ המשמש כאן נרכש מסחרית (למשל, Zeiss LSM 510 Meta system) ואת תוכנת הרכישה המשויכת שימש (למשל, זן 2009). עם זאת, רבים מהצעדים הללו יחולו על כל מיקרוסקופ קונמיוקדי ומניחים ידע בסיסי במיקרוסקופיה.

  1. לאחר הפעלת המערכת והתחמם, בחר את המטרה הרצויה; כאן 20x (הצמצם המספרי = 0.8) המטרה היתה בשימוש.
  2. טען שקופית בקרה חיובית, כיסוי למטה, כדי לאפשר הגדרת אופטימיזציה עבור האות הבהיר ביותר. הדמיה בערוץ האדום, למקד את המערכת על המדגם במצב הדמיה חיה .
  3. עבור כל ערוץ לייזר המשמש, למטב את עוצמת הלייזר, הרווח הראשי, וגודל הנקב כדלקמן:
    1. מעבר למצב רציף עבור דימות.
    2. מטב את עוצמת הלייזר (השולטת בעוצמת הלייזר) והרווח (המאסטר) (השולט במתח של שפופרת פוטוטיפייר) תוך כדי ניטור ההיסטוגרמה של הצגת הטבלה (lut). כוונן שתי הגדרות אלה עד שהטווח הדינאמי של ההיסטוגרמה יתמלא ללא הפחתה בפיקסלים.
      הערה: אם עוצמת הלייזר גבוהה מדי הלבנת התמונות תתרחש. אם הרווח (מאסטר) גבוה מדי, התמונה תהיה רועשת. באופן אידיאלי, הרווח (Master) יהיה באמצע הטווח שלו.
    3. הגדר את היחידה האוורירית ליחידת המאוורר (AU), המספקת את הרזולוציה הגבוהה ביותר ואת החלק הדק ביותר של z-slice.
    4. החלק את פס ההסטה הדיגיטלית כדי למזער את רצפת הרעש בהיסטוגרמה lut לרקע שחור אמיתי.
      הערה: לאחר שהגדרות המיקרוסקופיה ממוטבות לכל ערוץ לייזר ולמטרה, השאר אותם קבועים במהלך הפעלת ההדמיה ועבור הדמיה של כל השקופיות, כדי לאפשר השוואה כמותית בין שקופיות.
  4. תחת הכרטיסיה מצב רכישה , תחת ממוצע בממוצע, בחר את המספר ועומק הסיביותהרצויים. לחצו על הלחצן ' אופטימלי ' לקביעת גודל הפיקסל האופטימלי.
  5. השתמש בלחצן הצמד רכישה כדי לאסוף תמונה באיכות גבוהה. כאן, שדות השקפה אקראיים נבחרו מתוך הגידול, אבל תחומי עניין אחרים עשויים לחול על יישומים שונים (כלי, שולי הגידול, עומק החדירה, וכו ')
  6. שמור קבצי תמונה בתבנית המשמשת את התוכנה הקונמוקד (כאן, ". lsm") לעיבוד וכימות לא מקוונים.
    הערה: אם לא כל השקופיות מתתמונות במהלך אותה הפעלה, שמור את ההגדרות וטען אותם מחדש בביקורים הבאים, למרות שהדימות מחדש של אותה שקופית אינה מומלצת עקב הלבנת התמונות.
  7. לבצע את מדידות כמותית בעוצמה פלואורסצנטית. פתח את פיג'י (פיג'י Is בדיוק תוכנת imagej)19,23 וטען קובץ תמונה. lsm על-ידי גרירה אל שורת המצב.
  8. פצל את נתוני ערוץ הצבע. עבור לתמונה ≫ ערימות ≫ ערוצים מפוצלים.
  9. הליך מקדים של תמונות הזריחה לפי הצורך, כלומר, הפחת את אות הרקע (תהליך ≫ חיסור רקע) או הפחת את הרעש באמצעות שיטת סינון.
  10. פלח את ערוץ הצבע המתאים לחלבון הייחוס (כלי דם, גרעיני, כתם תאי) על-ידי הגדרת סף בעוצמת האות (תמונה > התאם ≫ הסף).
    הערה: סף ידני מציג סובייקטיביות לתוך ניתוח תמונה, לכן, באמצעות אלגוריתם סף אוטומטי או התייחסות היסטגרמות התמונה עושה תוצאות ניתוח התמונה מוטה פחות.
  11. השתמש במסף זה כדי ליצור מסיכה בינארית (תהליך > בינארי ≫ המר למסיכה).
  12. מדידת ותווית ROIs בתוך המסיכה (לנתח את ≫ נתח חלקיקים > בדוק הוסף למנהל > אישור).
  13. החל ROIs על ערוץ הצבע המתאים לנוגדן העניין (לחץ על תמונת ערוץ, לנתח ≫ כלים > ROI Manager > מדידה). פעולה זו תחיל את ROIs של המסיכה לתמונת הנוגדן ותספק מדידות תמונה עבור מקטעי תוויות בחלון התוצאות. שמור חלון תוצאות (קובץ > שמור).
  14. חשב את הסטטיסטיקה הרצויה של ריבית, כגון עוצמת הזריחה הממוצע כפי שמתואר כאן24.
  15. בצע את כל שלבי העיבוד הזהים לכל תמונה בתוך קבוצה של שקופיות. צור מאקרו שיעשה זאת באופן אוטומטי עבור אצוות תמונה גדולה23.
  16. לתצוגת תמונה רק לאחר מדידות כמותית, החילו התאמות של תמונה איכותית כדי למטב את ההדמיה של תבניות biodistribution פצה על-ידי התאמת מינימום, מקסימום, בהירות וניגודיות לאותן רמות בכל השקופיות (תמונה > התאם > בהירות/ניגודיות).
  17. המר את סוג התמונה (תמונה ≫ סוג ≫ צבע RGB) ושמור קבצים בסוג תמונה ללא אובדן נתונים, כגון. Tiff (קובץ ≫ שמירה כ> tiff...) לשימוש במצגות ובפרסומים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

השיטה IVIL שימש כאן כדי לבחון את האינטראקציה vivo biodistribution תפלגות ורקמות של B7-H3-ICG ו-Iso-ICG, על ידי מתן אפשרות לסוכנים, לאחר הזרקה והזרקת לתוך בעל חיים, כדי אינטראקציה עם רקמת היעד עבור 96 h, ולאחר מכן ברגע הרקמות הן שנקטפו, כדי לשמש את הנוגדנים העיקריים במהלך vivo חיסוני ex. שיטת ה-IVIL גם הושווה התקן לשעבר vivo IF כתמים של הרקמות עבור B7-H3 סמן. בלוטות החלב של murine נורמלי לא לבטא את הסמן B7-H3, אישר vivo ex, תקן IF כתמים, ואין לצבור נוגדנים דרך מנגנונים פסיביים אחרים, ולכן,...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

שיטה זו כוללת מספר שלבים קריטיים ומחייבת שינויים פוטנציאליים כדי להבטיח יישום מוצלח. ראשית, את המינון ואת העיתוי של הנוגדן/הנוגדן המשלים ולאחר ההזרקה חייב להיות מותאם ליישום ספציפי. באופן כללי, המינונים צריך לשמש כי הם עקביים עם איך מחייב נוגדן בדרך כלל לשמש, כלומר, התאמת המינונים של הנוגדן הטיפולית או האנטי נוגדן מבוססי סוכן הניגודיות. כמו כן, יש לשקול בזהירות את התזמון של אוסף רקמות היעד. נוגדנים ונוגדן שערים יש פעמים המחזור הארוך יותר מאשר תרופות סטנדרטיות וסוכני ניגודיות, עם זאת, אלה הם משתנים מאוד צריך להיות ממוטב ע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

אנו מודים ד ר אנדרו אולסון (סטנפורד שירות מיקרוסקופ מדעי המוח) עבור דיונים ושימוש בציוד. אנו מודים לד ר ג'ורגן ק. ווילמן למנטוריו. מחקר זה נתמך על ידי NIH R21EB022214 מענק (קיו), NIH R25CA118681 מענק הכשרה (קיו), ו-NIH K99EB023279 (קיו). שירות מיקרוסקופ המוח של סטנפורד נתמך על ידי NIH NS069375.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>מודל בעלי חיים
FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/Jמעבדת ג'קסון002374נקבות, גיל 4-6 שבועות
<חזק>ציוד לטיפול בבעלי חיים
27G קטטרVisualSonicsאנא התקשר להזמנתערכת
קנולציה לגישה לווריד זנב Vevo MicroMarkerמגבוני אלכוהולפישר סיינטיפיק22-246073
ספוגי גזה (4 אינץ' x 4 אינץ' 16 שכבות)Cardinal Health2913
מנורת חוםמורגנוויל סיינטיפיק  HL0100
IsofluraneHenry Schein בריאות בעלי חיים29404
משחת עינייםפישר סרט כירורגי מדעיNC0490117
3M1530-1
<חזק>אוסף רקמות
תבניות בסיס חד פעמיותפישר סיינטיפיק22-363-556
טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) בינוניפישר מדעי23-730-571
מלקחיים כירורגיים בלונדוןכלים מדעיים עדינים11080-02
מספריים כירורגייםכלים מדעיים עדינים14084-08
<חזק>נוגדנים
AlexaFluor-488 עז נגד חולדות IgGLife TechnologiesA-11006
AlexaFluor-546 עיזים נגד ארנב IgGLife TechnologiesA-11010
AlexaFluor-594 עזים אנטי אנושי IgGLife TechnologiesA11014
בקרת איזוטיפ IgG אנושיתNovus BiologicalsNBP1-97043
נוגדן אנטי-נטרין-1 אנושי Netris Pharmacontact@netrispharma.com
ארנב אנטי עכבר CD276 (B7-H3)Abcamab134161EPNCIR122
שיבוט חולדה נגד עכבר CD31BD Biosciences550274MEC 13.3 שיבוט
<חזק>ריאגנטים
בקר סרום אלבומין (BSA)Sigma-AldrichA2153-50G
ציפורן שקופה פולניתכל בית מרקחת מקומי
Indocyanine Green - NHSIntrace MedicalICG-NHS ester
הרכבה בינוניתThermoFisher ScientificTA-006-FM
Normal Goat SerumFisher ScientificICN19135680
Paraformaldehyde (PFA)Fisher ScientificAAJ19943K2
פוספט סטרילי מי מלח חוצצים (PBS)ThermoFisher Scientific14190250
Triton-X 100Sigma-AldrichT8787
<חזק>אספקה
מגלשות זכוכית הידבקותVWR48311-703
עמודי התפלהפישר סיינטיפיק45-000-148
כיסוי זכוכית מחליקפישר Scientific12-544G
עט מחסום הידרופוביטד פלה22311
צינורות מיקרוצנטריפוגהפישר סיינטיפיק05-402-25
מגש צביעת שקופיותVWR87000-136
<חזק>תוכנה
FIJILOCI, UW-MADISON.גירסה 4.0https://fiji.sc/

מקורות

  1. Forthal, D. N. Functions of Antibodies. Microbiology Spectrum. 2 (4), 1-17 (2014).
  2. Boder, E. T., Midelfort, K. S., Wittrup, K. D. Directed evolution of antibody fragments with monovalent femtomolar antigen-binding affinity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (20), 10701-10705 (2000).
  3. Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
  4. Lonberg, N., et al. Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications. Nature. 368 (6474), 856-859 (1994).
  5. McCafferty, J., Griffiths, A. D., Winter, G., Chiswell, D. J. Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains. Nature. 348 (6301), 552-554 (1990).
  6. Ferlay, J., et al. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. International Journal of Cancer. 136 (5), E359-E386 (2015).
  7. Reichert, J. M., Valge-Archer, V. E. Development trends for monoclonal antibody cancer therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 6 (5), 349-356 (2007).
  8. Kircher, M. F., Willmann, J. K. Molecular Body Imaging: MR Imaging, CT, and US. Part I. Principles. Radiology. 263 (3), 633-643 (2012).
  9. Fleuren, E. D. G., et al. Theranostic applications of antibodies in oncology. Molecular Oncology. 8 (4), 799-812 (2014).
  10. Forsström, B., Bisławska Axnäs, B., Rockberg, J., Danielsson, H., Bohlin, A., Uhlen, M. Dissecting Antibodies with Regards to Linear and Conformational Epitopes. PLoS ONE. 10 (3), (2015).
  11. Woof, J. M., Burton, D. R. Human antibody-Fc receptor interactions illuminated by crystal structures. Nature Reviews Immunology. 4 (2), 89-99 (2004).
  12. Brooks, J. D. Translational genomics: The challenge of developing cancer biomarkers. Genome Research. 22 (2), 183-187 (2012).
  13. Tabrizi, M., Bornstein, G. G., Suria, H. Biodistribution Mechanisms of Therapeutic Monoclonal Antibodies in Health and Disease. The AAPS Journal. 12 (1), 33-43 (2009).
  14. Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M. Applications of immunohistochemistry. Journal of Pharmacy & Bioallied Sciences. 4 (Suppl 2), S307-S309 (2012).
  15. Gambhir, S. S. Molecular imaging of cancer with positron emission tomography. Nature Reviews. Cancer. 2 (9), 683-693 (2002).
  16. Freise, A. C., Wu, A. M. In vivo Imaging with Antibodies and Engineered Fragments. Molecular Immunology. 67 (200), 142-152 (2015).
  17. Cilliers, C., Menezes, B., Nessler, I., Linderman, J., Thurber, G. M. Improved Tumor Penetration and Single-Cell Targeting of Antibody-Drug Conjugates Increases Anticancer Efficacy and Host Survival. Cancer Research. 78 (3), 758-768 (2018).
  18. Wilson, K. E., et al. Spectroscopic Photoacoustic Molecular Imaging of Breast Cancer using a B7-H3-targeted ICG Contrast Agent. Theranostics. 7 (6), 1463-1476 (2017).
  19. Wischhusen, J., et al. Ultrasound molecular imaging as a non-invasive companion diagnostic for netrin-1 interference therapy in breast cancer. Theranostics. 8 (18), 5126-5142 (2018).
  20. Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).
  21. Hober, S., Nord, K., Linhult, M. Protein A chromatography for antibody purification. Journal of Chromatography B. 848 (1), 40-47 (2007).
  22. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments JoVE. (65), (2012).
  23. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  24. Bachawal, S. V., et al. Earlier detection of breast cancer with ultrasound molecular imaging in a transgenic mouse model. Cancer Research. 73, 1689-1698 (2013).
  25. Fitamant, J., et al. Netrin-1 expression confers a selective advantage for tumor cell survival in metastatic breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (12), 4850-4855 (2008).
  26. Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78 (3), 425-435 (1994).
  27. Ryman, J. T., Meibohm, B. Pharmacokinetics of Monoclonal Antibodies. CPT: Pharmacometrics & Systems Pharmacology. 6 (9), 576-588 (2017).
  28. Scalia, C. R., et al. Antigen Masking During Fixation and Embedding, Dissected. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (1), 5-20 (2017).
  29. Robertson, R. T., et al. Use of labeled tomato lectin for imaging vasculature structures. Histochemistry and Cell Biology. 143 (2), 225-234 (2015).
  30. Chen, C. Y., et al. Blood flow reprograms lymphatic vessels to blood vessels. The Journal of Clinical Investigation. 122 (6), 2006-2017 (2012).
  31. Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).
  32. de Boer, E., et al. In Vivo Fluorescence Immunohistochemistry: Localization of Fluorescently Labeled Cetuximab in Squamous Cell Carcinomas. Scientific Reports. 5, (2015).
  33. Jenkins, R. W., Barbie, D. A., Flaherty, K. T. Mechanisms of resistance to immune checkpoint inhibitors. British Journal of Cancer. 118 (1), 9-16 (2018).
  34. Rexer, B. N., Arteaga, C. L. Intrinsic and acquired resistance to HER2-targeted therapies in HER2 gene-amplified breast cancer: mechanisms and clinical implications. Critical Reviews in Oncogenesis. 17 (1), 1-16 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

נוגדנים טיפולייםנוגדנים דיאגנוסטייםמיקרוסקופיה קונפוקליתחיתוך רקמותצביעה בנוגדן משניכלי דם גידולייםאספקה שאינה למטרה המקורית
ב Vivo אימונוofor, לוקליזציה להערכת הטיפול הרפואי והאבחון ביופצת התרופות בחקר הסרטן
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.