אינטראקציות חלבון-חלבון (PPI) הן בסיסיות ליצירת השפעות ביולוגיות. רבים מהם קשורים קשר הדוק למחלות, והם מוכרים יותר ויותר כמציעים מטרות חשובות לפעולה תרופתית1. קיימות טכניקות רבות לחקר אינטראקציות חלבון אלה, שחלקן נדונות באוסף זה או במאמרים אחרים של JoVE. לכל טכניקה יתרונות ומגבלות משלה2; עם זאת, אין טכניקה אחת מושלמת לכל ה-PPIs בשל המגוון העצום של אינטראקציות אלה המתרחשות בתאים תת-תאיים שונים, עם מגוון רחב של זיקות (פיקומולריות עד מילי-מולריות), ועשויות להיות רק חולפות באופיין.
מבחני קינאז במבחנה הם גישה עקיפה לחקר PPIs שניתן להשתמש בהם כדי לנתח כיצד קינאזות ממלאות את תפקידן הפונקציונלי בהעברת קבוצת פוספט מ-ATP למצע. Cui et al.3 משתמשים בטכניקה זו, יחד עם עיכול טריפטי וספקטרומטריית מסה, כדי לזהות את אתרי הזרחן הספציפיים לקינאז-1 התלויים בציקלין על שבר של חלבון הצנטרומר האנושי F (CENP-F). לצורך אימות פונקציונלי של אתרי זרחון חדשים, המחברים משתמשים במבחן מחייב, המשלב CENP-F המכיל מוטציה פוספומטית וקריופרין α, קולטן הובלה גרעינית, ובכך מספק אימות צולב.
קו-אימונו-משקעים היא שיטה בשימוש נרחב לחקר PPIs שבה נעשה שימוש בנוגדנים כדי ללכוד מטרה ספציפית יחד עם כל מולקולות חלבון אחרות הקשורות אליה. ג'נג ועמיתיו4 מיישמים טכניקה זו כדי לחקור גורמים המעוררים היפוקסיה (HIFs) המתפקדים כהטרודימרים המורכבים מתת-יחידת α מווסתת חמצן ותת-יחידה β המתבטאת באופן מכונן הידועה גם בשם ARNT3. הערה מעניינת לגבי הפרוטוקול שלהם היא שהתאים מושרים ונקצרים בתנאים היפוקסיים, וחלבונים אנדוגניים משברים גרעיניים עוברים משקעים אימונוגרפיים. כפי שמציינים המחברים, מגבלה אחת של השיטה היא שהיא אינה יכולה לקבוע אם PPIs הם ישירים או עקיפים.
Nolan et al.5 מציגים פרוטוקול למדידת מספר המולקולות ובהירותן בתמונות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית 'מספר ובהירות' (N&B), שניתן ליישם לזיהוי הומו-אוליגומריזציה של חלבונים. ניתן להשתמש בטכניקה הן במבחנה והן ב-vivo והיא יושמה כדי לכמת במדויק את המצב האוליגומרי של FKBP12F36V המסומנים ב-mVenus לפני ואחרי הוספת תרופה דימריזציה. המחברים דנים ביתרונות הטכניקה ביחס לטכנולוגיות קשורות ומדגישים את החשיבות של תיקון להלבנה ותנודות עוצמה ארוכות טווח. מיקרוסקופים קונפוקליים המצוידים בגלאים דיגיטליים מקלים על הכמות, אך N&B אפשרי גם עם גלאים אנלוגיים.
טיהור זיקה של קומפלקסים מרובי חלבונים, יחד עם זיהוי מרכיביהם, היה טכניקה בשימוש נרחב להבנת הפונקציות של חלבונים מורכבים כאלה. בפרוטוקול של Luzarowski et al.6, טכניקה זו נלקחת צעד קדימה על ידי אפיון בו-זמנית הן PPIs והן אינטראקציות חלבון-מטבוליט (PMIs) בתאי צמח Arabidopsis טרנסגניים. נוקלאוזידים דיפוספט קינאזות מתויגים מטוהרים על ידי הליך התגית של טיהור זיקה טנדם (TAP) עם חלבונים שנלכדו ומולקולות קטנות שזוהו לאחר מכן על ידי ספקטרומטריית מסה. הייחודיות של פרוטוקול זה היא היכולת לזהות ליגנדים הידרופוביים והידרופיליים כאחד; זהו פרוטוקול מיצוי שלושה באחד המאפשר לחקור הן PPIs והן PMIs ומיישם טיהור זיקה לשתילת תאים.
לבדיקת קשירת הקרבה יש יתרון בכך שהיא משמשת לאיתור אינטראקציות בין חלבונים אנדוגניים בתאים וברקמות. קרצ'וגינה וצ'רנוף7 משתמשים בטכניקה כדי להראות את נוכחותם של הטרודימרים של הקינאזות MST1 ו-MST2 בתאי שוואן אנושיים (HSCs) ותאי כליה עובריים אנושיים (HEK-293). במאמר שלהם יש כמה עצות חשובות כיצד לבצע את הטכניקה בהצלחה. נדרשים נוגדנים ראשוניים מתאימים הגדלים במינים שונים כנגד כל חלבון המקיים אינטראקציה, ומכיוון שהספציפיות והרגישות של הנוגדנים הם המפתח, יש לכוונן היטב את ריכוזי הנוגדנים. המחברים מצאו שקופיות תא זכוכית נוחות לניתוח קווי תאים מרובים ושילובי נוגדנים, אך ציינו כי הכרחי להסיר את כל תוספת הסיליקון בין הבארות כדי למנוע הבדלים במרחק הקונפוקלי במהלך המיקרוסקופיה. בנוסף, בקרות חיוביות ושליליות שונות משמשות לאימות התוצאות.
ספקטרוסקופיה של תהודה מגנטית גרעינית (NMR) היא בדיקה רגישה שניתן להשתמש בה כדי לספק רזולוציה ברמה האטומית ומידע כמותי על אינטראקציות חלבון ואינטראקציות חלבון-ליגנד. וינקלאר ועמיתיו8 משתמשים בטכניקה כדי לחקור את האינטראקציה בין שני חלבונים (וימנטין ואנוופלאקין) המצויים בדסמוזומים, מבני תאים המעורבים בהידבקות תא לתא הנמצאים בדרך כלל ברקמות החוות לחץ מכני עז. המחברים משתמשים בתחום וימנטין 15עם תווית N ורוכשים ספקטרום דו-ממדי באמצעות מתאם קוונטי יחיד הטרו-גרעיני (HSQC). בנוכחות תחום מ-envoplakin, נצפית התרחבות קו נרחבת והיעלמות שיא, בהתאם לאינטראקציה עם חלבון. המחברים חוקרים עוד את בסיס האינטראקציה באמצעות מוטגנזה ותרמופורזיס בקנה מידה מיקרו (MST) כדי לספק מידע כמותי.
פיזור קרני רנטגן בזווית קטנה (SAXS) היא טכניקה שניתן להשתמש בה כדי לספק מידע על הגודל והקונפורמציות של מקרומולקולה בתמיסה וליצור מעטפת מולקולרית של קומפלקסים גדולים, רב-תחומיים או חלבונים ברזולוציה נמוכה. בפרוטוקול של Mrozowich et al.9, הטכניקה משמשת ליצירת מבנה ברזולוציה נמוכה של נידוגן-1 ולמינין γ-1 בקומפלקס. הטכניקה עשויה לעניין חוקרים החוקרים PPIs בחלבונים גדולים עם תחומים כדוריים מרובים שהם גדולים מדי עבור ספקטרוסקופיה של NMR ומאתגרים להתגבש עבור קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן.
ההערכה היא שיש כ-650,000 אינטראקציות באינטראקטום האנושי10 - מספיק כדי להעסיק את החוקרים בתחום לזמן מה. התפתחות אחרונה, שהתאפשרה הודות להתקדמות במיקרוסקופיה, ספקטרומטריית מסה ולמידת מכונה, היא פרוטאומיקה מרחבית שעשויה לספק תובנה רבה בתחום זה בעתיד11. אוסף זה של שיטות PPI יעזור לחוקרים להתמודד עם אתגר חשוב זה תוך הימנעות ממלכודות פוטנציאליות.