מאמר שיטה

הומוגניים אנדותל בידול מתאי גזע האדם Pluriפוטנטי במזין-ו-Xeno-תנאי מוגדר חינם

DOI:

10.3791/59823

⸱

16 ביוני 2019

 ,  ,  , 
1Center for iPS cell research and application (CiRA)

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מתאי הגזע האנושיים החזקים ביותר. במצב מזינה-ונטול-כאלה שיטה זו יהיו בעלי יישומים נרחבים במידול מחלות והקרנה לתרכובות טיפוליות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הנובעות גזע תפקודי המטופאות ומחולל קדמון (HSPCs) מתאי גזע האדם pluriפוטנטי (PSCs) היו מטרה חמקנית עבור השתלות אוטולוגיים לטיפול הפרעות המטולוגית וממאיר. אנדותל הומוגניים (הוא) היא פלטפורמה קלה לייצר HSPCs פונקציונלי על ידי שעתוק גורמים או כדי לגרום לימפוציטים בצורה איתנה. עם זאת, שיטות נוכחיות להפיק הוא יקר או משתנה בתשואה. בפרוטוקול זה, הקמנו שיטה חסכונית ומדויקת להפיק אותו בתוך 4 ימים במצב מזינה-ונטול xeno-מוגדר. התוצאה שהוא עבר המעבר אנדותל-אל-המטפי והופק CD34+CD45+ כclonogenic ושלתי. הקיבולת הפוטנציאלית של הפלטפורמה שלנו ליצירת HSPCs פונקציונלי יהיו יישומים נרחבים מידול מחלות והקרנה עבור תרכובות טיפוליות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפיתוח של therapeutics חדש עבור הפרעות המטולוגית והחיסונית כבר הושפע מהעדר פלטפורמות חזקות עבור דוגמנות מחלות והקרנות תפוקה גבוהה ההקרנה עם תאי גזע המטולוגיים אוטולוגיים (HSCs) נגזר מהמטופל תאי גזע פלוריפוטנטי (PSCs). פריצת הדרך של המושרה (i) PSC הטכנולוגיה מחזיקה הבטחה למודל מחלות מתאי המטופלים, אבל הקמתה של HSCs פונקציונלי מiPSCs החולה היה חמקמק. על מנת להפיק HSCs מן האדם PSCs, האינדוקציה הנכונה של החשיבה העובריים ותוכניות הטרנססקריפט הוא מפתח1,2,3,4,5,6, 7,8. ההתקדמות האחרונה בהתפתחות המטתית הוכיחה את תפקידה של הומוגניים (הוא) בפיתוח HSC9. הוא יכול להיגרם מPSCs והוא נוטה להתערבות במורד הזרם כגון העברת גנים10,11,12,13. באמצעות הוא כפלטפורמה, את השילוב של 5 גורמי שעתוק (Erg, HOXA5, HOXA9, LCOR, RUNX1) המושרה בהצלחה HSCs פונקציונלי כי חרט לטווח ארוך ולהבדיל לתוך מספר הגילאים14. עם זאת, הדור המשתנה והלא יעיל של הוא מ PSCs יש לבטח את מניפולציה שיטתית ניתוח של תאים יחד עם הייצור מחוץ למדף, אינדוקציה בקנה מידה גדול של תאים המטבטיים לשימוש קליני.

כאן, אנו מתארים שיטה חסכונית ומדויקת להפיק אותו ב 4 ימים עם מצב מזינה-ו-xeno-חינם מוגדר. בשיטה זו, היווצרות כספרואיד וספונטנית מחדש שיטוח ב iMarix-511 מבטיח צפיפות עקבית של מושבות PSC, אשר חיוני האינדוקציה יעיל של תאים הוא.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ריאגנטים

  1. קווי תא (אדם PSCs): להשיג תאים גזע עובריים (ESCs) או הקווים iPSC 409B2 ו 201B7 (317-9)) ו CBA11.
  2. הכנה מגיב
    1. ציפוי PSC בינוני: לערבב PSC תחזוקה בינונית עם 10 μM Y-27632 ולאחסן ב 4 ° c.
    2. PSC ספרואיד ריצוף בינוני: לערבב PSC תחזוקה בינונית עם 625 – 1250 ng/mL אדם רקומביננטי למינציה-511 E8 קטע (LM511-E8) (בהתאם לקו התא) רק לפני השימוש.
      הערה: LM511-E8 ניתן לערבב ב-media15. מטריצה אחרת כגון באורך מלא-511 צריך להיות מצופה מראש, ואף עשה זאת, הם אינם מקיימים עיבוד מזונואידים בתהליך הבידול.
    3. יום 0 בידול בינוני: לערבב בינונית בסיס מזועורי עם 2 μM CHIR99021, 80 ng/mL העצם מורמורגנטית חלבון 4 (BMP4) ו 80 Ng/ml כלי הגידול האנדותל (מנשא).
    4. יום 2 בידול בינוני: לערבב מדיום בסיס הומוגניים עם 1 μM SB431542, 80 ng/mL ו100 ng/mL תא גזע גורם (SCF).
    5. הכנת תמיסת מלח (PBS) ללא סידן או מגנזיום (ראה טבלת חומרים).
    6. 1 מ"מ (EDTA) מאגר החומצה של התרופה: להוסיף 1 מ ל של 0.5 M EDTA כדי 500 mL של PBS.
    7. Eht בינוני: לערבב המטפיאה מדיום בסיס עם 50 ng/mL scf, 20 ng/ml (tpo), 50 ng/ml fms-הקשורים טירולך קינאז 3 ליגנד (טיסה-3l), 20 ng/mL interleukin-6/אינטרלוקין-6 הקולטן אלפא (il-6/il-6rα), אינסולין-מועבר-סלניום-אתיאנאמין, L-גלוטמין ו פניצילין/סטרפטומיצין/אמפוריטיצין B.
    8. מאגר FACS: מערבבים PBS עם סרום עגל עוברי 2% ו 1 מ"מ EDTA.
    9. הכן מאגר הפרדה מגנטית (ראה טבלת חומרים).
    10. הכנת מתילצלולוזה מדיה מבוססת (ראה טבלת חומרים).

2. מבנה המושבה PSC

  1. לגדול hPSCs 70 – 80% שליטה על 0.5 μg ס"מ-2 LM511-E8 מצופה צלחת 6-באר ב mTeSR1 בחממה 37 ° c עם 5% CO2.
  2. PSC דיסוציאציה (יום-4)
    1. מטפי את המדיום ושוטף. את התאים בערוץ הPBS פעמיים שטפו את התאים באמצעות פתרון הדיסוציאציה. דגירה ב 37 ° צ' עבור 15 דקות (התאים לא להתייבש בזמן הזה).
    2. להשעות את התאים במדיום תחזוקה PSC, להעביר את ההשעיה שפופרת בגודל מתאים וצנטריפוגה את התאים ב 200 x g עבור 3 דקות. לבשל את הסופרנטאנט ולהשעות את התאים במדיום ציפוי PSC.
  3. צלחת ההשעיה PSC בצפיפות של 48,000 – 70,000 תאים cm-2 (בהתאם לקו התא) אל כלי פלסטיק מיקרו מפוברק ו דגירה לילה בחממה 37 ° c עם 5% CO2.
    הערה: אנו ממליצים 100 μL היטב1 של השעיית תא בכלי פלסטיק 96-היטב מיקרו מפוברק. אתה בדרך כלל זרע 20,000 תאים היטב-1 בצלחת 96-באר כדי להניב כ 100 spheroids.
  4. ריצוף PSC הרואידים ב LM511-E8 (יום-3)
    1. לאסוף את PSC spheroids ב 15 מ"ל שפופרת חרוט על ידי ליטוף בעדינות באמצעות P1000 microפיפיטר ולהשאיר את spheroids לעמוד בטמפרטורת החדר עבור 2 דקות כדי לזרז על ידי כוח הכבידה. . ומכה את הסופרנטאנט
    2. השהה במדיום ציפוי ספרואיד, לוותר על ההשעיה לתוך הלוח מצופה 6-היטב התרבות בצפיפות של 4-spheroids ס"מ-2 ותרבות בחממה 37 ° c עם 5% CO2 במשך שלושה ימים.

3. מעבר הומוגניים (יום 0)

  1. מDay0 את המדיום, להוסיף בינוני ותרבות ב37 ° c בחממה עם 5% O2 ו 5% CO2 (חממה ארוי).
  2. לאחר יומיים של תרבות ב Day0 בידול בינוני, מרוב המדיום, לאחר מכן להוסיף Day2 בידול בינוני ותרבות בחממה ארוי.

4. בידוד הומוגניים אנדותל (יום 4)

  1. יומיים לאחר מכן, מטפי את המדיום. ושוטף את התאים בערוץ הPBS פעמיים שטפו את התאים באמצעות פתרון הדיסוציאציה. מודטה בחממה 37 ° c עם 5% CO2 עבור 30 דקות.
  2. בעדינות להשעות את התאים ב 1 מ"מ EDTA כדי לנתק את הרמה תא בודד, להעביר את ההשעיה לתוך שפופרת 50 mL ו צנטריפוגה את התאים ב 200 x g עבור 3 דקות. ומתה את supernatant ולהשעות את הגלולה תא עם 300 μl של הפרדה מגנטית אגר.
  3. הוסף 100 μL של CD34+ מיקרוחרוזי ובעדינות pipet. המשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. ניתן להשתמש עד 20,000,000 תאים לכל 100 μL CD34+ חרוזים.
  4. לסנן את ההשעיה דרך מסננת תא 40 יקרומטר.
  5. הפרד את התאים CD34+ באמצעות מפריד מגנטי.

5. אינדוקציה של מעבר אנדותל (EHT)

  1. ציפוי פיברוטין
    1. הכן את הנפח הנדרש של 5 μg/mL fibronectin פתרון ציפוי על ידי דילול 1 מ"ג/mL fibronectin ב PBS.
    2. מדבקות 0.5 mL של פתרון הציפוי לתוך כל טוב של לוחית של 24 היטב תרבות. מודקת את הצלחת בטמפרטורת החדר עבור 30 דקות.
  2. צנטריפוגה את CD34+ תאים ממוינים ב 200 x g עבור 3 דקות. השהה מחדש את התא גלולה ב 1 מ ל של מדיום eht.
  3. קבע את צפיפות התא הקיימא עם מונה התא. כוונן את צפיפות התא ל-200,000 תאים mL-1 על-ידי הוספת מדיום eht.
  4. מפחית ומפחית את הפתרון ציפוי מתוך הבאר מצופה fibronectin. מדבקות 0.5 mL של CD34+ תא הבולם לתוך כל fibronectin מצופה היטב.
  5. מודטה בחממה הארוי. לשבוע אחד

6. הזרמת כדוריות התאים

  1. אוסף תאים צף: העבר את מדיום התרבות לצינורית חרוטית בגודל 15 מ"ל. צנטריפוגה את המדיום ב 200 x g עבור 3 דקות.. ומכה את הסופרנטאנט
  2. אוסף תאים מחסיד
    1. שטוף את התאים עם 0.5 מ ל של PBS פעמיים.
    2. לשטוף את התאים עם פתרון הנתק ומכה את הנוזל העודף.
    3. מודקת את הצלחת בחממה 37 ° c עבור 5 דקות.
    4. השהה מחדש את התאים ב-1 mL של מאגר FACS.
  3. לערבב את התאים צף תאים חסיד.
  4. צנטריפוגה את התאים ב 200 x g עבור 3 דקות.. והוא מבשל את הסופרנטאנט השהה מחדש ב-50 μL של מאגר FACS. דגירה את התאים עם אנטי CD34 ואנטי CD45 נוגדנים עבור 1 h בטמפרטורת החדר בחושך.
  5. לשטוף את התאים עם PBS פעמיים ו צנטריפוגה ב 200 x g עבור 3 דקות. מרוב הסופרנטאנט ולהשעות מחדש ב 0.5 mL של מאגר facs עם 0.5 μg/mL 4 ', 6-diamidino-2-פניינילידול.
  6. מדידת CD34 ו-CD45 ביטוי על ידי cytometer זרימה.

7. המושבה היחידה (CFU) שיטת היווצרות תאים מהמטפאות

  1. מתחת לאוסף התאי המטכיפת: העבירו את המדיום מהתרבות לצינור החרוט בגודל 15 מ"ל. שטוף בעדינות את הבאר פעמיים עם PBS.
  2. צנטריפוגה את התאים ב 200 x g עבור 3 דקות.. והוא מבשל את הסופרנטאנט השהה מחדש ב 1 מ ל של מדיום EHT. קבע מספר תא עם מונה התא.
  3. הוסף נפח השעיה המקבילה של 10,000 תאים 3 מ ל של מתילתאית מדיה מבוססת בתוספת אנטיביוטיקה ומערבבים היטב 5 פעמים עם 16 G או 18 גרם מזרק.
  4. לוותר על כל מתילתאית מבוססי התקשורת מושעה לתוך כל טוב של צלחת 6-היטב.
  5. מודטה בחממה 37 ° c עם 5% CO2 במשך שבועיים תוך שמירה על לח. . אל תפריע לצלחת . המושבות רגישות לתנועה
  6. אחרי שבועיים, תספור את. המושבות מתחת למיקרוסקופ

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סכמטית של יצירת מושבות PSC מתוארת באיור 1A. PSC spheroids נוצרות על כלי פלסטיק מיקרו מפוברק ליום אחד. כתוצאה מייצגת, 20,000 409B2 תאים יכול להיות מטופל לכל 96-גם של כלי פלסטיק מיקרו מפוברק, למרות קווי תאים אחרים עשויים לדרוש צפיפות גבוהה יותר (30000-40000 תאים לכל 96-טוב של כלי פלסטיק מיקרו מפוברק). התחומים הללו משוטחים באופן ספונטני לתרבות כמעט דו-ממדית כאשר הם מצופים בתבשיל תרבות בנוכחות LM511-E8.

תרשים של אינדוקציה הומוגניים מומחש באיור 1B. כאשר PSC מושבות לגדול בקוטר של 750 μm, המדיום שונה ברציפות כדי לגרום לאורגנואידים מזועורי. מושבות PSC יהיה בהדרגה להיות בצד שטוף שמש למעלה מבנה במהלך הבידול כדי מזונואידים הגוף על ידי שינוי בינוני רציפה עד יום 4. ביום 4, הומוגניים אנדותאליה מצוינים באמצעות מיון מגנטי ומצופה לאחר מכן על fibronectin במדיום EHT. 5-10 מיליון CD34+CD45- תאים צפויים מפני spheroids המכיל 1,000,000 PSCs (איור 1c).

הוא ציין כי התאים מורפולוגית לשנות מאנדותל לתאים המטבטיים (וידאו משלים 1). דמות ייצוגית בעלת ניגודיות מלאה של התאים המטבטיים על גירוי בקוקטייל המטפאות ביום 7 מוצג באיור 2A. מושבות התא המטפאות. הופיעו בתרבות

זרם מייצג cy, התוויה העלילה מוצג באיור 2B. התרבות כולה מגורה עם קוקטייל המטופאות וביום 7 מנותח עבור הביטוי של CD34 ו-CD45 על ידי הזרמת cy try. . CD34 וCD45

שיטת CFU הראה את הדור של גרנולוציטים/מקרופאג מושבות מתוך CD34+ CD45+ המטפאות בתאי קדמון (איור 2c). מספר המושבה המשוערת הוא 38 CFU-G/M לתאים 10,000 (איור 2D)

figure-results-1
איור 1: סכמטית של ריצוף מושבות PSC ובידול המטפאות הבאים באמצעות הומוגניים אנדותאליה. (א) תהליך סכמטי של יצירת מושבות PSC. PSCs מתוחזקים על צלחת מצופה מLM511 בגודל 6-E8 במדיום תחזוקה PSC. ביום-4, תאים מנותקים מתנתק לרמה בודדת תא באמצעות פתרון הניתוק, מצופה לאחר מכן על כלי פלסטיק מיקרו מפוברק ב PSC בינוני תחזוקה עם Y-27632 ומתורבת לילה כדי spheroids טופס. ביום -3, spheroids מצופים במדיום תחזוקה PSC עם LM511-E8 ומתורבת למשך שלושה ימים. לפי יום 0, הספרואידים משוטחים באופן ספונטני לתרבות כמעט דו-ממדית. קנה מידה ברים = 200 μm. (ב) ביום 0, המדיום מוחלף Day0 בידול בינוני ותרבותי בחממה ארוי. ביום השני של הבידול, המדיום מוחלף בDay2 בידול. ביום 4 של העשרה הומוגניים אנדותל, CD34+ תאים הם מיון מגנטית ומתורבת על fibronectin מצופה בצלחת 12-באר ב eht בינונית במשך 6 ימים. (ג) הנציג flowcyCD45 try העלילה של ביטוי CD34 של יום 4 תאים מיון על ידי CD34. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: ניתוח של רכוש המטפי. (א) דמות ייצוגית מייצגת בתאי מחולל מצוי לאחר גירוי בקוקטייל המטופאות ביום 7. סרגל בקנה מידה = 200 μm. (ב) זרם מייצג cy, לנסות העלילה של CD45 ו CD34 ביטוי של תרבות שלמה על גירוי עם קוקטייל המטופאות ביום 7. (ג) דמות מייצגת של מושבה של גרנולוציט/מקרופאג שנוצרו מיום 11 בתאי מחולל המטפאות. סרגל קנה מידה = 500 μm. (D) מספר התאים של cfus לכל 10,000. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
וידאו משלימים 1: וידאו EHT. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטת האינדוקציה שלנו מזינה-ו-xeno-חינם מציעה פלטפורמה מדויקת וחסכונית כדי לגרום לתאים באופן מדרגי. היווצרות נאמן של הומוגניים אנדותל בפרוטוקולים קונבנציונליים10,11,12,13,14 כבר הושפע על ידי חוסר שליטה מדויקת של PSC מושבת צפיפות וגודל, אשר משפיע על היעילות של המורפולדור/cytokine מבוססי בידול מונחה. . בכל אצווה עצמאית מפרוטוקולים קונבנציונליים הפרוטוקול החדש מאפשר רגולציה הדוקה של צפיפות וגודל המושבה של PSC, וכך מתגבר על חוסר העקביות של האינדוקציה האנדוגנית.

אנחנו לנצל את היווצרות במדים של spheroids ולאחר מכן הועברו מזינה-ו-xeno מוגדר תנאי הגדרה לטופס הוא בסך הכל 4 ימים. שהמערך הספרואיד מבטיח. את היווצרות התאים העקביים כתוצאה מייצגת, קווי התא 409B2 הניבו 20.5%-23.6% CD34+ תא יעילות על בסיס שלושה ניסויים עצמאיים. הגורם הקריטי לאריח PSC spheroids הוא LM511-E8. אנחנו לא ממליצים להחליף את זה עם מטריקס אחרים, כגון מטריצות או באורך מלא של מוצרים בחוויות שלנו. הצלחנו להתנתק בקלות ממטג. ולאיבוד בתהליך הבידול וגם לא מטריצות או באורך מלא למינציה לא עוגן תאים ללא ציפוי מראש.

המגבלה הפוטנציאלית של פרוטוקול זה היא שאנחנו תלויים במדיום תחזוקה PSC כדי לשמור על PSCs. , בדקנו מדיה אחרת כגון סטפי. אבל סיכנת השראה כנראה תאים היו עמידים ליציאה ממצב pluripotent בזמן הקצר שלנו (4 ימים) הפרוטוקול האינדוקציה. אם אדם שומר PSCs במדיה אחרת, אנו ממליצים על התאמת תאים במדיום תחזוקה PSC ולנהל כמה מעברים לפני בידול. פלטפורמה זו תאפשר מניפולציה שיטתית וניתוח של תאים, ואת ייצור מחוץ למדף, אינדוקציה בקנה מידה גדול של תאים המטפאות לשימוש קליני פוטנציאלי. מטרה ארוכת טווח של מערכת זו היא לדגמן מחלות כשל חיסוני בדגמי עכבר הומניזציה כדי לחקור את המנגנון הסלולר והמולקולרי האחראי ולבצע הקרנות סמים.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אינם מצהירים על ניגודי אינטרסים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנחנו אסירי תודה לאלינה לי ו Seiko Benno על הסיוע הטכני שלהם. אנחנו גם רוצים להודות לגברת הרמי וואטאנאבה על מתן סיוע מינהלי וד ר פיטר קארגיאניס על עריכת העיתון. עבודה זו היתה נתמכת על ידי מרכז ליבה של iPS מחקר התא של רשת מרכז המחקר למימוש של רפואה רגנרטיבית מהסוכנות יפן למחקר ופיתוח רפואי (M.K.S.), התוכנית לחקר מחלות סורר ניצול. מחלות ספציפיות כדוריות ה-iPS של M.K.S. (17935423) [] ו המרכז לחדשנות תוכנית של יפן מדע וטכנולוגיה הסוכנות (JST) [R.O. ו M.K.S.].

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.5 מ' EDTAThermo Fisher Scientific155750.5 מ' EDTA
40 μ מסננת תאים mקורנינג35234040μ מסננת תאים
M צלחת 6 באר צלחתקורנינג3530466 באר צלחת
אנטיביוטיקה-אנטי-פטרייקטיתתרמו פישר סיינטיפיק15240-112פניצילין/סטרפטומיצין/אמפוטריצין B
נוגדן נגד CD34בקמן קולטרA07776נוגדן נגד CD34
נוגדן נגד CD45 נוגדןBiolegend304012נוגדן נגד CD45
BMP4מו"פ D Systems314-BP-010BMP4
CD34 מיקרו-חרוזיםMiltenyi130-046-703CD34 מיקרו-חרוזים
CHIR99021Wako038-23101CHIR99021
Essential 6Thermo Fisher ScientificA15165-01מדיום בסיסי המומוגני
Essential 8Thermo Fisher ScientificA15169-01Mesodermal Basal
medium Ezsphere SP Microplate 96wellAGC4860-900SPכלי פלסטיק מיקרו-מפוברק 
FCSBioseraFB-1365/500FCS
פיברונקטיןMilliporeFC010-100MGפיברונקטין
Flt-3LR& D Systems308-FK-005Flt-3L
GlutamaxThermo Fisher Scientific35050-061L-גלוטמין
IL-6/IL-6Rαמו"פ D Systems8954-SRIL-6/IL-6Rα
iMatrix-511Matrixome892 001LM511-E8
ITS-XThermo Fisher Scientific51500-056אינסולין-טרנספרין-סלניום-אתנולמין
MACS bufferMiltenyi130-091-221מאגר הפרדה מגנטי
Methocult 4435MethoCult™ H4435 EnrichedSTEMCELL TECHNOLOGIES04435מדיה מבוססת מתיל צלולוז
mTeSR1STEMCELL TECHNOLOGIES85850מדיום תחזוקה
PSC PBSnacalai tesque14249-24PBS
SB431542Wako031-24291SB431542
SCFR& D Systems255-SC-010SCF
Stemline II מדיום הרחבת תאי גזע המטופויאטייםסיגמא אולדריץ'S0192-500MLמדיום בסיס המטופויאטי
TPOR& D Systems288-TPNTPO
TrypLE ExpressThermo Fisher Scientific12604-021פתרון דיסוציאציה
VEGFR& D Systems293-VE-010VEGF
Y-27632Wako253-00513Y-27632

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pereira, C. F., et al. Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts. Cell Stem Cell. 13, 205-218 (2013).
  2. Lancrin, C., et al. The haemangioblast generates haematopoietic cells through a haemogenic endothelium stage. Nature. 457, 892-895 (2009).
  3. Loh, K. M., et al. Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types. Cell. , 451-467 (2016).
  4. Ng, E. S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to HOXA+ hemogenic vasculature that resembles the aorta-gonad-mesonephros. Nature Biotechnology. 34, 1168-1179 (2016).
  5. Batta, K., et al. Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells. Cell Reports. 9, 1871-1884 (2014).
  6. Sturgeon, C. M., et al. Defining the path to hematopoietic stem cells. Nature Biotechnology. 31, 416-418 (2013).
  7. Ivanovs, A., et al. Human haematopoietic stem cell development: from the embryo to the dish. Development. 144, 2323-2337 (2017).
  8. Blaser, B. W., Zon, L. I. Making HSCs in vitro: don't forget the hemogenic endothelium. Blood. , (2018).
  9. Speck, N., Dzierzak, E. Of lineage and legacy: the development of mammalian hematopoietic stem cells. Nature imunology. , (2008).
  10. Niwa, A., et al. A novel serum-free monolayer culture for orderly hematopoietic differentiation of human pluripotent cells via mesodermal progenitors. PLoS One. 6, e22261(2011).
  11. Sturgeon, C. M., et al. Wnt signaling controls the specification of definitive and primitive hematopoiesis from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32, 554-561 (2014).
  12. Ditadi, A., et al. Human definitive haemogenic endothelium and arterial vascular endothelium represent distinct lineages. Nature Cell Biology. 17, 580-591 (2015).
  13. Kennedy, M., et al. T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Reports. 2, 1722-1735 (2012).
  14. Sugimura, R., et al. Haematopoietic stem and progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature. 545, 432-438 (2017).
  15. Miyazaki, T., et al. Efficient Adhesion Culture of Human Pluripotent Stem Cells Using Laminin Fragments in an Uncoated Manner. Scientific Reports. 7, 41165(2017).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

CD34LM511 E8EHT

מאמרים קשורים