הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ב והשרירים סינתזה של ממברנות פפטיד הפרה עבור הצמיחה שלפוחית אוטונומית

5.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59831

⸱

28 ביוני 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Physics of Synthetic Systems - E14, Physics-Department and ZNN, Technische Universität München, 2Departmant of Chemistry, Center for Integrated Protein Science (CIPSM), Technische Universität München, 3Nanosystems Initiative Munich

במאמר זה

סיכום

הציגו כאן הם פרוטוקולים ליצירת פפטיד מבוסס unilamellar שלפוחיות קטנות מסוגל לצמיחה. כדי להקל על ייצור vesiculo של פפטיד הממברנה, אלה שלפוחיות מצוידות עם תמלול-תרגום מערכת ו-פפטיד קידוד פלמיד.

תקציר

מידור של תגובות ביוכימית הוא היבט מרכזי של תאים סינתטיים. למטרה זו, פפטיד מבוססי תאים התגובה לשמש חלופה אטרקטיבית ליפוזומים או חומצת שומן מבוססי שלפוחיות. מבחוץ או בתוך שלפוחיות, פפטידים יכולים להתבטא בקלות ולפשט את הסינתזה של ממברנה מקדים. בתנאי זה הוא פרוטוקול ליצירת ושלפוחיות עם קטרים של ~ 200 ננומטר מבוסס על לאלסטין האמפיפיפילית כמו פוליפפטידים (למשל) ניצול התייבשות-לחות מחרוזי זכוכית. כמו כן מוצגים פרוטוקולים לביטוי וטיהור בקטריאלי באמצעות הטמפרטורה ההופכית רכיבה על אופניים, כמו גם הפונקציונליזציה שלהם עם צבעי פלורסנט. יתר על כן, דו ח זה מתאר פרוטוקול כדי לאפשר את שעתוק ה-RNA aptamer אלף dBroccoli רוקולי בתוך שלפוחית הצער כדוגמה מורכבת פחות עבור תגובה ביוכימית. לבסוף, פרוטוקול מסופק, אשר מאפשר vesiculo ביטוי של חלבונים פלורסנט ואת פפטיד ממברנה, בעוד סינתזה של התוצאות האחרונות צמיחת veלפוחית.

מבוא

בדרך כלל מתקרבים ליצירת מערכות סלולריות מהחי הסינתטי משני כיוונים שונים. בשיטה מלמעלה למטה, הגנום של חיידק מופחת לרכיבים החיוניים שלו, בסופו של דבר מוביל לתא מינימלי. בגישה מלמטה-למעלה, תאים מלאכותיים מורכבים דה נובו מרכיבים מולקולריים או מערכות משנה סלולרית, אשר צריך להיות משולבים באופן פונקציונלי לתוך מערכת עקבית כמו תא.

בגישה דה נובו, מידור של הרכיבים הביוכימיים הנחוצים מושגת בדרך כלל באמצעות ממברנות העשויים פוספוליפידים או חומצות שומן1,2,3,4. הסיבה לכך היא "מודרני" ממברנות תא מורכב בעיקר פוספוליפידים, בעוד חומצות שומן נחשבים מועמדים סביר של מארזים ממברנה preביוטית5,6. עבור היווצרות של ממברנות חדשים או כדי להקל על גידול ממברנה, אבני בניין אמפיפילי חייב להיות מסופק מן החיצוני7 או אידיאלי באמצעות ייצור בתוך תא קרומי באמצעות תהליכים אנבוליים המקביל4 ,8.

בעוד סינתזה השומנים הוא תהליך מטבולית יחסית מורכב, פפטידים יכולים להיות מיוצר בקלות באמצעות תא-חינם ביטוי גנים תגובות9,10. מכאן, ממברנות פפטיד הנוצר על ידי פפטידים אמפיפילי מייצגים חלופה מעניינת לממברנות שומנים כמו מארזים עבור מחקה תא מלאכותי כי הם מסוגלים לצמוח11.

אלסטין (ELPs) בצורת בלוק-בלוקים (אלפס) הם מעמד אטרקטיבי של פפטידים, אשר יכולים לשמש כאבן בניין לקרומים כגון12. המוטיב הבסיסי של חומצה אמינית של elps הוא (gagvp)n, שם "a" יכול להיות כל חומצה אמינית למעט פרולין ו-"n" הוא מספר המוטיב חוזר13,14,15,16,17 . ELPs נוצרו עם בלוק הידרופובי המכיל בעיקר פנילאלנין עבור בלוק הידרופילי מורכב בעיקר של חומצה גלוטמית11. בהתאם לפרמטרים פתרון, כגון הריכוז pH ו מלח, ELPs התערוכה שנקרא טמפרטורה הופכי מעבר בטמפרטורה Tt, שבו הפפטידים עוברים מעבר שלב הפיך לחלוטין מן הידרופילי כדי הידרופובי מדינה. סינתזה של פפטידים ניתן ליישם בקלות בתוך שלפוחיות באמצעות "TX-TL" תא חיידקי לחלץ11,18,19,20,21, אשר מספק כל הרכיבים הנחוצים לשילוב תגובות שעתוק ותרגום.

מערכת ה-TX-TL הייתה מחולקת יחד, כאשר הקידוד של תבנית ה-DNA מגיע לתוך שלפוחית הידיים באמצעות התייבשות-מחדש מחרוזי זכוכית כתמיכה מוצקה. היווצרות של שלפוחיות מתרחשת באמצעות הסבה של הפפטידים היבשים מן המשטח חרוז11. שיטות נוספות22 עבור היווצרות שלפוחית לפוחית ניתן להשתמש, אשר עשוי להראות בגודל נמוך יותר וגדלים שלפוחית גדולה יותר (למשל, אלקטרו היווצרות, אמולסיה שלב העברת, או מיקרופלואידיקה שיטות מבוססות). כדי לבדוק את הכדאיות של שיטת עטיפת הגוף, שעתוק ברוקולי הפלואורוגנטי של ה-23 ניתן לחילופין להשתמש ב-11, שהוא מורכב פחות מביטוי גנטי עם מערכת TX-TL.

בשל ביטוי של ממברנה אבני בניין ב vesiculo ואת ההתאגדות הבאים שלהם לתוך קרום, שלפוחיות להתחיל לגדול11. התאגדות ממברנה של ELPs ניתן להדגים באמצעות שיטת הסריג. לשם כך, ELPs המשמש להקמת האוכלוסייה הראשונה שלפוחית השמש מצויישים עם צבעי פלורסנט במניות שוות המהווים זוג מסוג סריג. עם ההבעה של ELPs לא מתויג ב vesiculo התאגדות שלהם לתוך הקרום, ELPs מתויג בקרום מדולל וכתוצאה מכך האות הסריג מקטין11. כשיטה מגוונת ומשותפת לקוניוגציה, משתמשים בתוספת שימוש בנחושת מזרז לשימוש. עם השימוש בליגמים ייצוב וכגון טריס (בנזיל)-אמין, התגובה יכולה להתבצע בתמיסה מימית ב-pH פיזיולוגי ללא הידרוליזה של המגיבים11, אשר מתאים לתגובות בניינים מעורבים בפפטידים

הפרוטוקול הבא מציג תיאור מפורט של ההכנות לגידול peptidosomes המבוססים על. הביטוי של פפטידים ושלפוחית היווצרות באמצעות שיטת חרוזי זכוכית מתוארים. כמו-כן, הוא מתאר כיצד ליישם שעתוק של הברוקולי הפלואורוגנטי ותגובת התרגום לביטוי חלבון בתוך שלפוחית הדיבור. לבסוף, בתנאי הוא הליך עבור הקוניוגציה של ELPs עם fluorophores, אשר ניתן להשתמש בהם כדי להוכיח צמיחה שלפוחית באמצעות שיטת סריג11.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. ביטוי של אלסטין כמו פוליפפטידים

  1. יום 1: הכנת תרבות ואספקה ראשונית לביטוי פפטיד
    1. הכנה ואוטוקלב ביטוי התרבות מבחנות (4 x 2.5 L) ו 3 L של LB מדיום. עבור 1 L של LB בינונית, להוסיף 25 גרם של אבקת LB ל 1 ליטר של מים באולטרטהורים.
    2. הכנת תרבות המתחיל עם 100 mL של LB מדיום, 50 μl של סטרילי-מסוננים (0.22 יקרומטר מסנן) הפתרון כלוראמאנקול (25 מ"ג/mL ב-אטוח), ו-ה50 μl של סטרילי-מסונן (0.22 יקרומטר מסנן) carbenicillin פתרון (100 mg/mL ב 50% אטוח ו-50%
    3. להוסיף פס קטן מתוך מלאי בקטריאלי מתוצרת מראש המכיל E. coli זן BL21 (DE3) באמצעות pET20b (+) ביטוי קידוד וקטורי רצף פוליפפטיד ((gegvp) 4 (הגבול)) 4 ((gfgvp) (הגבול)3 (Gfgvp)4gwp (מקוצר כמו EF) כדי לקדם את מחמם 100 mL התרבות המתנע ו דגירה ב 37 ° צ' עבור 16 h עם 250 rpm באינקובטור רועד (E. coli זנים וקטורים זמינים על פי בקשה).
    4. חמם מראש את מבחנות תרבות הביטוי ואת מדיית LB ב 37 ° c לילה, כך שהם מוכנים למחרת.
  2. יום 2: ביטוי החלבון
    1. הוסף 750 mL של LB מדיום לכל ביטוי תרבות בקבוקון, 375 μl של סטרילי-מסוננים (0.22 יקרומטר מסנן) מלאי כלוראמאנקול (25 מ"ג/mL ב-אטוח), ו375 μl של סטרילי-מסוננים (0.22 יקרומטר מסנן) carbenicillin stock (100 mg/mL ב 50% אטוח ו-50%
    2. לאחר עצבנות כדי להפיץ את האנטיביוטיקה, לקחת 2 מ ל של המדיה כדוגמת התייחסות למדידת צפיפות אופטית ב 600 ננומטר (OD600).
    3. הוסף 7.5 mL של התרבות ההתחלתית כדי ביטוי בקבוקון ו דגירה עבור 1 h ב 37 ° צ' עם 250 rpm.
    4. לאחר שלב זה ה-OD600 של כל בקבוקון ייבדק כל 20 דקות.
    5. כאשר הצפיפות האופטית מגיעה כ 0.8 להפחית את הטמפרטורה 16 ° c ולגרום לביטוי פפטיד על ידי הוספת 750 μL של 1 M סטרילי מסוננים β-איזופרופיל התאיוגלטוסייד (IPTG) במים באולטרטהורים לתוך כל ביטוי בקבוקון.
    6. דגירה הביטוי בקבוקון עם חיידקים המושרה ב 16 ° צ' עבור 16 h עם 250 סל ד.
  3. יום 3: הפקת הפוליפפטיד המבוטאת
    1. שוקלים מראש את צנטריפוגה בקבוקון כדי לאפשר נחישות של מסה של הגלולה התא לאחר הקציר.
    2. לקצור את כל החיידקים מצלוחיות הביטוי על ידי צנטריפוגה עבור 20 דקות באמצעות צנטריפוגה טרום מקורר ב 4,000 x g ו 4 ° c.
    3. שופכים את הסופרנטאנט ומזלים את בקבוקי הצנטריפוגה על מגבת נייר סטרילית.
    4. שוקלים את מבחנות צנטריפוגה ולחשב את מסת הגלולה התא.
    5. השהה מחדש את התאים, אשר למטה מ 750 מ ל של תרבות התא המקורי, ב 15 מ ל של מלוחים פוספט באגירה (PBS, pH 7.4) על ידי ליטוף, ו צנטריפוגה ב 4,000 x g עבור 20 דקות ב 4 ° c. שופכים את הסופרנטאנט ומזלים את בקבוקי הצנטריפוגה על מגבת נייר סטרילית.
    6. השהה מחדש את הגלולה לתא עבור שלב הליזה 2 מ ל של מאגר עבור 1 גרם של גלולה תא באמצעות PBS (pH 7.4) שיושלם עם ליזוזים (1 מ"ג/mL), 1 מ"מ פנילימתיל פלווליל פלואור (pmsf), 1 מ"מ בנזיל, ו 0.5 U של dnase I.
    7. Sonicate התאים עבור הליזה נוספת על הקרח עם sonicator ב 8 W עבור 9 דקות עם מתחלפים 10 s sonication ו 20 s משהה שלבים, ואחריו 9 דקות הפסקה במהלכו המדגם צריך להיות מקורר על הקרח. חזור על הצעד 9 דקות sonication פעם נוספת.
    8. הוסף 2 מ ל 10% (w/v) פוליאתילן (פיי) לכל 1 L של תרבות התא המקורי עבור משקעים חומצות גרעין.
    9. הפץ את המדגם לתוך 2 מנורות צנטריפוגה mL ו-דגירה ב 60 ° c עבור 10 דקות ואחריו דגירה עבור 10 דקות ב 4 ° c.
    10. צנטריפוגה את הפתרון ב-16,000 x g עבור 10 דקות ב 4 ° צ' ולאסוף את הסופרנטנט המכיל את הטוב ביותר.
  4. טיהור חלבון באמצעות הטמפרטורה ההופכית אופניים:
    1. התאימו את הסופרנטאנט ל-pH של 2 כדי להחליף את החלק ההידרופילי של הפפטיד להידרופובי ולגרום לצבירה. כדי לכוונן את החומציות, חומצה זרחתית נתרן הידרוקסידי משמשים. פסים pH מספיקים כדי לקבוע את רמת ה-pH.
    2. כדי לשפר את התשואה של טיהור המדגם, לחמם את המדגם ל 60 ° c ולהוסיף נתרן כלוריד עד 2 M.
    3. לאחר מכן, צנטריפוגה את המדגם ב 16,000 x g עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
    4. השמט את הסופרנטאנט ופזר מחדש את הגלולה ב-PBS (אך רק חצי מאמצעי האחסון ההתחלתי משמש לעומת השלב הקודם).
    5. כוונן את ה-pH ל -7 עם חומצה זרחתית ונתרן הידרוקסידי. פסים pH מדויקים מספיק כדי לקבוע את ה-pH.
    6. צנטריפוגה את המדגם לאחר מכן ב 16,000 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c.
    7. לאסוף את supernatant ולחזור על שלבים 1.4.1 – 1.4.6 עד כולל 3x, פרט לכך בחזרה האחרונה של שלב 1.4.4, רק מים מתווסף במקום PBS.
    8. למדוד את הריכוז של הפפטידים עם ספקטרומטר ספיגה. השתמש במקדם השמדה של 5500/M/cm בשעה 280 nm.
    9. להתאים את ריכוז של הטוב ביותר כדי 700 μM.

2. שלפוחית הייצור בשיטת חרוזי זכוכית

  1. התמקד בפתרון המענה ל1.1 מ"מ באמצעות מרכז ואקום צנטריפוגלי.
  2. מערבבים 200 μL של הפתרון המרוכז מרוכז עם 1,250 μL של 2:1 כלורופורם/מתנול תערובת ואחריו vortexing.
  3. הוסף 1.5 גרם של חרוזי זכוכית כדורית (212 – 300 יקרומטר בגודל) עד 10 מ"ל בקבוקון התחתון עגול.
  4. הוסף את הפתרון המכיל את התמיסה והכלורופורם/מתנול לבקבוק התחתון העגול וערבב על ידי טלטול עדין.
  5. . חבר את הבקבוקון למאאייד רוטרי להתאים את המהירות כדי 150 rpm ו לווסת את הלחץ על-0.2 x 105 Pa (-200 mbar) במשך כ 4 דקות עד נוזל מתאדה בטמפרטורת החדר.
  6. מניחים את הבקבוקון העגול לתוך desiccator לפחות 1 h כדי לוודא שנותרים כלורופורם ו מתנול התאדו. כדי למנוע אובדן של חרוזי זכוכית, רדיד אלומיניום מוצמד באופן רופף צריך להיות עטוף סביב בקבוקון התחתון עגול פתוח.
  7. לניסוי בודד, מערבבים 100 מ"ג של חרוזי זכוכית מכוסים פפטיד עם 60 μL של פתרון נפיחות, כגון PBS. מודאת הדגימה הזאת ב -25 ° צלזיוס במשך 5 דקות.
  8. צנטריפוגה את המדגם במהירות עם צנטריפוגה העליון השולחן כדי לשקע את חרוזי זכוכית.
  9. השתמשו בפיפטה כדי לאסוף את הסופרנטאנט שמכיל את השלפוחיות.

3. תמלול של רנ א ברוקולי בתוך הוולפוחית

  1. נקה את ספסל המעבדה עם מגבונים המכילים פתרון טיהור RNase כדי ליצור סביבה חופשית RNase-עבודה.
  2. מערבבים את ssDNA (5 μM) הכוללת את T7 מקדם וברוקולי רצף (GAGACGGTCGGGTCCATCTGAGACGGTCGGGTCCAGATATTCGTATCTGTCGAGTAGAGTGTGGGCTCAGATGTCGAGTAGAGTGTGGGCTC), כמו גם את סטרנד שאינו קידוד (5 μM) ב nuclease-מים ללא תשלום שיושלם עם Rנפוליאון התגובה מאגר [40 mM טריס-HCl (pH = 7.9), 6 מ"מ MgCl2, 1 מילימטר dithioitol (dtt), ו 2 מ"מ spermidine], כדי להכין את תבנית ה-DNA עבור תגובת תמלול.
  3. מודיית את הפתרון ב 90 ° c עבור 5 דקות ואחריו בטמפרטורה איטית ירידה עד 20 ° צ' עבור 30 דקות.
  4. הכינו 1 מ"מ (5Z)-5-(3, 5-difluoro-4-הידרוקסיבבנז'ה)-2, 3-דימתיל-3, 5-דיהידרו-4H-4-הנסרנול -4-1 (Dבמבי) פתרון על ידי המסת 1.26 מ ג של D, בתוך 5 מ ל
  5. להכין את תגובת תמלול ידי ערבוב מאגר התגובה Rנפוליאון [40 mM טריס-HCl (pH = 7.9), 6 מ"מ MgCl2, 1 מילימטר dithiool (dtt), ו 2 מ"מ spermidine] עם 125 Mm kcl, 15 מ"מ MgCl2, 4 מ"מ Rntp, 10 Μm dmmsb, 200 תבנית DNA ננומטר, 0.5 U/Μl rnapol מדכא ומים.
  6. בדיוק לפני התגובה מתחיל, להוסיף 4 U/μL T7 פולימראז.
  7. השתמש תערובת תגובה זו כפתרון נפיחות בשלב 2.7 ו-דגירה ב 37 ° צ' למשך הניסוי, שהוא בדרך כלל 1 h.

4. תמלול-תרגום (TX-TL)

הערה: עבור התגובה שעתוק תרגום, תמצית תא גולמי נדרש, כמו גם מאגר התגובה DNA. תמצית התא הגולמי מוכנה כמתואר ביום ראשון ואח '.18. עבור תגובת TX-TL, השתמש בפעולות הבאות: 33% (v/v) של התמצית הגסה של E. coli , 42% (v/v) מאגר התגובות, ו -25% (v/v) פנול-כלורופורם מטוהרים DNA פלוס תוספים. ריכוזי הסופי הם כ 9 מ"ג/mL חלבון, 50 mm hepes (pH = 8), 1.5 mm ATP, 1.5 mm gtp, 0.9 mm ctp, 0.9 mm utp, 0.2 mg/mL trna, 26 מ"מ co, 0.33 מ מ נאד, 0.75 מ"מ מחנה, 68 מ"מ חומצה פולינית, 1 mm spermidine , 30 מ"מ פפ, 1 מ"מ DTT, 2% יתד-8000, 13.3 mM המלז, 1 U של T7 RNA פולימראז, ו 50 nM-DNA באמצע המים באולטרטהורים.

  1. פנול-כלורופורם טיהור של תבנית ה-DNA
    1. הכינו שש תרבויות לילה עם 5 מ ל של LB בינונית ו 5 μl של סטרילי-מסוננים (0.22 יקרומטר פילטר) carbenicillin פתרון (100 mg/mL ב 50% אטוח ו 50% באולטרטהור מים).
    2. הוסף פס קטן מתוך מלאי בקטריאלי מתוצרת מראש המכיל DH5α E. coli עם pET20b (+) ביטוי וקטור כל לפני מחומם 5 mL תרבות לילה ו דגירה ב 37 ° c עבור 16 h עם 250 rpm. בהתאם פפטיד (EF) או חלבון (YPet או mVenus) יש להתבטא, במרכז הקידוד הספציפי משמש.
    3. לחלץ את הפלמיד עם ערכת הכנה מיני כמתואר במדריך למשתמש או על ידי ביצוע הפרוטוקול שסופקו על ידי ג'אנג ואח '24.
    4. להכין 100 μL של ה-DNA הטרום מטוהרים פלמיד (ריכוז יכול לנוע בין 200-600 ng/μL) ולערבב עם 100 μL של Roti-פנול/כלורופורם/isoamyl אלכוהול (pH = 7.5 – 8.0) בצינור מיקרוצנטריפוגה כדי לאפשר הפרדת פאזה טובה יותר.
    5. בעדינות להפוך את הצינור עד 6x ו צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 16,000 x g ב RT.
    6. הוסף 200 μL של כלורופורם לשלב העליון של הצינור ולהפוך את הצינור עד 6x.
    7. צנטריפוגה את המדגם ב 16,000 x g עבור 5 דקות ב-RT.
    8. ללטף את supernatant לצינור נפרד ולהוסיף 10 μL של 3 M של סודיום אצטט עבור משקעים אתנול.
    9. הוסף 1 מ ל-80 מעלות צלזיוס האתנול הקרה ולאחסן את המדגם ב-80 ° צ' עבור 1 h.
    10. צנטריפוגה את המדגם ב 16,000 x g עבור 15 דקות ב 4 ° c.
    11. Decant הסופרנטאנט ולהוסיף 1 מ ל-20 ° c קר 70% (v/v) אתנול.
    12. צנטריפוגה ב 16,000 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c.
    13. מסירים את הנוזל באמצעות ליטוף. להיזהר לא להפריע את הגלולה DNA.
    14. לאחסן את המדגם ב-RT במשך כ 15 דקות כדי לאדות את האתנול שנותר.
    15. הוסיפו מים אולטרה-טהורים למדגם כדי לכוונן את הריכוז לדוגמה ל-300 ננומטר, שנמדד על-ידי ספיגת ב 260 ננומטר.
  2. הכנת תגובת TX-TL
    1. הפשרת התמצית המוכנה של התא הגולמי ומאגר התגובות על הקרח.
    2. עבור 60 μL לערבב התגובה, להוסיף את ה-DNA הפלמיד (פנול-כלורופורם מטוהרים) כדי 37.5 μL של מאגר התגובות [50 מ"מ HEPES (pH = 8), 1.5 mM ATP, 1.5 mM GTP, 0.9 mM CTP, 0.9 mM UTP, 0.2 mg/mL tRNA, 26 מ"מ co, ב0.33. , 0.75 מ"מ מחנה, 68 mm פולינית חומצה, 1 מ"מ spermidine, 30 מ"מ פפ, 1 מ"מ dtt, 2% יתד-8000, ו 13.3 מלז mm), ואחריו תוספת של 28.7 מטרים לחלץ תא גולמי. למלא את הנפח הסופי עם מים באולטרטהור כדי 58.8 μL.
    3. ממש לפני התגובה מתחיל, להוסיף 1.2 μL של הפתרון T7 RNA פולימראז ולערבב את המדגם על ידי ליטוף למעלה ולמטה.
    4. השתמש תערובת תגובה זו כפתרון נפיחות בשלב 2.7 ו-דגירה ב -29 ° c למשך הניסוי, אשר בדרך כלל 4 – 8 h.

5. הקוניוגציה של אלסטין כמו פוליפפטידים עם Fluorophores באמצעות נחושת מזרז עזידה-אלקין היסגן הפוליטכני

  1. הכינו 20 מ"מ-מקשר של מγ-אזימוט (חומצה בוטירית) ב-DMSO.
  2. מערבבים 250 μL של הפתרון (600 μM) עם PBS (8 g/L נרוג, 0.2 g/L KCl, 1.42 g/L Na2hpo4, 0.27 g/l K2hpo4, pH = 7.2) ו-מיטאוצידה (1.2 מ"מ) ו דגירה של 12 h ב RT.
  3. לטעון את המדגם בקסטה 10 kDa דיאליזה ולאחסן אותו ב 4 ° c עבור 12 h ב 1 L של המים באולטרסאונד כדי להסיר את המלחים ושרידי משיורי-עזידה.
  4. מערבבים את ההפעלה (500 μM) עם הצבע האלמני-מצוב (500 μM), Cy5-אלקין, או Cy3-אלקין.
  5. לערבב את המדגם עם 1 מ"מ TBTA (טריס (בנזיל) אמין), 10 מ"מ TCEP (טריס (2-carboxyethyl)-פוספלין הידרוכלוריד) ו 10 מ"מ CuSO4 ו-מקרין ב 4 ° c עבור 12 h.
  6. לטעון את המדגם בקסטה 10 kDa דיאליזה ולאחסן אותו ב 4 ° c עבור 12 h ב 1 L של המים באולטרסאונד, כדי להסיר את המלחים ושאריות הצבעים המצולים.
  7. אלה לצבוע שונה ELPs משמשים בתערובת 1:1 של ELPs Cy3 המסומנים Cy5 ELPs המסומנים באנלוגי ל פפטידים בחלק 2.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הפקת שלפוחית
איור 1 מציג שידור אלקטרוני מיקרוסקופ (TEM) תמונות של שלפוחיות מוכנות עם פתרונות נפיחות שונים ושיטת חרוזי זכוכית (גם לראות Vogele et al.11). עבור המדגם באיור 1A, רק PBS שימש כפתרון נפיחות כדי להוכיח את היווצרות של שלפוחיות ולקבוע את גודלם. כאשר TX-TL שימש כפתרון נפיחות (איור 1B), גם השלפוחיות יצרו. פיזור אור דינמי (DLS) מדידות בוצעו כדי להראות כי שיטת חרוזים זכוכית יש השפעה על ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

חידוש הסרט הוא הליך נפוץ ליצירת unilamellar שלפוחיות קטנות. המקור העיקרי לכישלון הוא טיפול שגוי של החומרים המשמשים בהליך.

בתחילה, the ELPs מיוצרים על ידי E. coli תאים. התשואה לאחר טיהור שלום יכולה להשתנות באופן משמעותי בהתאם לאופן הפעולה הקפדני של הפרוטוקול במהלך הצעדים הקריטיים שלו. אלו הם הצעדים ההפוכים לרכיבת הטמפרטורה וההשעיה של ה-ELPs לאחר משקעים. עבור טיהור, אנו הפעילו את התמוטטות הידרופובי של פפטיד באמצעות תוספ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים לא מצהירים על אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

אנו מכירים את התמיכה הפיננסית באמצעות DFG TRR 235 (הופעתה של החיים, פרויקט P15), מועצת המחקר האירופית (הסכם הענקת no. 694410 AEDNA), ואת הספר הבינלאומי של טום בוגרת למדעים והנדסה IGSSE (פרויקט מס ' 9.05) . אנו מודים לא פאלגנאואר על עזרתה בהכנה לדוגמא. אנו מודים לגבי א. דבין ו-M. שוורץ-שילינג על עזרתם עם מערכת TX-TL ודיונים שימושיים. אנו מודים לנ. ב. הולנד על דיונים שימושיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2xYTMP ביומדיקל3012-032
3-PGAסיגמא-אולדריץ'P8877
5PRIME פאזה נעילת ג'לTM צינורVWR733-2478
מצומד אלקין Cy3סיגמא-אולדריץ'777331
מצומד אלקין Cy5סיגמא-אולדריץ'777358
ATPסיגמא-אולדריץ'A8937
בנזמידיןקארל רות'CN38.2
BL21 רוזטה 2 E. coli זןNovagen71402
Bradford BSA ערכת בדיקת חלבוןBio-rad500-0201
cAMPSigma-AldrichA9501
קרבניציליןקרל רוט6344.2
כלורמפניקולסיגמא-אולדריץ'C1919
כלורמפניקולקארל רוט3886.3
כלורופורםקארל רוט4432.1
CoAסיגמא-אולדריץ'C4282
CTPUSB14121
CuSO4Carl RothP024.1
DFHBILucerna Technologies410
DMSOCarl RothA994.1
DNase INEBM0303S
DTTSigma-AldrichD0632
אתנולקארל רוט9065.2
חומצה פוליניתSigma-AldrichF7878
סיגמא-אולדריץ'G1277GTP שטופים בחומצה
USB16800
HEPESסיגמא-אולדריץ'H6147
IPTG (&בטא;-איזופרופיל תיוגלקטוזיד)סיגמא-אולדריץ'I6758
KClקארל רוטP017.1
K-גלוטמטסיגמא-אולדריץ'G1149
LB מרקקארל רוטX968.2
ליזוזיםSigma-AldrichL6876
מתנולקארל רוט82.2
MgCl2Carl RothKK36.3
Mg-glutamateSigma-Aldrich49605
עמודות כרומטוגרפיה מיקרו ביו-ספיןBio-Rad732-6204
NADSigma-AldrichN6522
NHS-azide linker (חומצה אזידובוטירית oxysuccinimide ester)BaseclickBCL-033-5
PEG-8000Carl Roth263.2
פסי pHקארל רות'549.2
פנילמתיל-סולפוניל פלואורידקארל רוט6367.2
תמיסת מלח חוצצת פוספטVWR76180-684
חומצהזרחתיתסיגמא-אולדריץW290017
פוליאתילןסיגמא-אולדריץ'408727
אשלגן פוספט תמיסה דו-בסיסיתסיגמא-אולדריץP8584
אשלגן פוספט תמיסה חד-בסיסיתסיגמא-אולדריץ'P8709
Qiagen Miniprep KitQiagen27106
RNAPol מאגר תגובהNEBB9012
מעכב RNase עכברניNEBM0314S
RNaseZap מגבוניםThermoFisherAM9788
rNTPNEBN0466S
רוטי-פנול/כלורופורם/איזואמיל אלכוהולCarlrothA156.1
RTS דוגם חומצות אמינו5 Prime2401530
קלטות דיאליזה Slide-A-Lyzer, 10k MWCO (ערכה)Thermo-Scientific66382
נתרן כלוריקארל רוט9265.1
נתרן הידרוקסידקארל רוט8655.1
ספרמידיןסיגמא-אולדריץ'85558
מסונן סטרילי (0.22 ומיקרו; מסנן m)קארל רות'XH76.1
T7 פולימראזNEBM0251S
TBTA (טריס (בנזיל טריאזולילמתיל) אמין)סיגמא-אולדריץ'678937
TCEP (טריס (2-קרבוקסיאתיל)-פוספין הידרוכלוריד)סיגמא-אולדריץ'C4706
טריס בסיספישרBP1521
tRNA (מ- E. coli)רוש מיושם מדעMRE600
UTPUSB23160
חרוזי זכוכית, ' '

מקורות

  1. Chen, I. A., Szostak, J. W. A kinetic study of the growth of fatty acid vesicles. Biophysical Journal. 87 (2), 988-998 (2004).
  2. Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane. Angewandte Chemie International Edition. 51 (13), 3114-3118 (2012).
  3. Hardy, M. D., et al. Self-reproducing catalyst drives repeated phospholipid synthesis and membrane growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8187-8192 (2015).
  4. Scott, A., et al. Cell-Free Phospholipid Biosynthesis by Gene-Encoded Enzymes Reconstituted in Liposomes. PLoS ONE. 11 (10), e0163058(2016).
  5. Deamer, D. W., Barchfeld, G. L. Encapsulation of macromolecules by lipid vesicles under simulated prebiotic conditions. Journal of Molecular Evolution. 18 (3), 203-206 (1982).
  6. Adamala, K., Szostak, J. W. Nonenzymatic Template-Directed RNA Synthesis Inside Model Protocells. Science. 342 (6162), 1098-1100 (2013).
  7. Zhu, T. F., Szostak, J. W. Coupled growth and division of model protocell membranes. Journal of the American Chemical Society. 131 (15), 5705-5713 (2009).
  8. Kurihara, K., et al. Self-reproduction of supramolecular giant vesicles combined with the amplification of encapsulated DNA. Nature Chemistry. 3 (10), 775-781 (2011).
  9. Chu, H. -S., et al. Expression analysis of an elastin-like polypeptide (ELP) in a cell-free protein synthesis system. Enzyme and Microbial Technology. 46 (2), 87-91 (2010).
  10. Martino, C., et al. Protein Expression, Aggregation, and Triggered Release from Polymersomes as Artificial Cell-like Structures. Angewandte Chemie International Edition. 51 (26), 6416-6420 (2012).
  11. Vogele, K., et al. Towards synthetic cells using peptide-based reaction compartments. Nature Communications. 9 (1), 3862(2018).
  12. Huber, M. C., et al. Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments. Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2014).
  13. McPherson, D. T., Xu, J., Urry, D. W. Product purification by reversible phase transition following Escherichia coli expression of genes encoding up to 251 repeats of the elastomeric pentapeptide GVGVP. Protein Expression and Purification. 7 (1), 51-57 (1996).
  14. Urry, D. W. Physical chemistry of biological free energy transduction as demonstrated by elastic protein-based polymers. The Journal of Physical Chemistry B. 101 (51), 11007-11028 (1997).
  15. Urry, D. W., et al. Elastin: a representative ideal protein elastomer. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 357 (1418), 169-184 (2002).
  16. Meyer, D. E., Chilkoti, A. Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides. Nature Biotechnology. 17 (11), 1112-1115 (1999).
  17. Meyer, D. E., Chilkoti, A. Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system. Biomacromolecules. 3 (2), 357-367 (2002).
  18. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762(2013).
  19. Caschera, F., Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie. 99, 162-168 (2014).
  20. Schwarz-Schilling, M., Aufinger, L., Mückl, A., Simmel, F. C. Chemical communication between bacteria and cell-free gene expression systems within linear chains of emulsion droplets. Integrative Biology. 8 (4), 564-570 (2016).
  21. Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synthetic Biology. 5 (4), 344-355 (2016).
  22. Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking. Chemical Society Reviews. 47 (23), 8572-8610 (2018).
  23. Filonov, G. S., Moon, J. D., Svensen, N., Broccoli Jaffrey, S. R. Broccoli: Rapid Selection of an RNA Mimic of Green Fluorescent Protein by Fluorescence-Based Selection and Directed Evolution. Journal of the American Chemical Society. 136 (46), 16299-16308 (2014).
  24. Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiments. (6), 247(2007).
  25. Stetefeld, J., McKenna, S. A., Patel, T. R. Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences. Biophysical Reviews. 8 (4), 409-427 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ELPziFRETRNA
ב והשרירים סינתזה של ממברנות פפטיד הפרה עבור הצמיחה שלפוחית אוטונומית
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.