הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הטיפוח-תרגול של החיל הימי ( uljanin 1884) למחקרים ניסיוניים

12.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59832

⸱

9 באוגוסט 2019

 ,  , 
1Skidaway Institute of Oceanography, University of Georgia, 2Hampton University

במאמר זה

סיכום

Doliolids, כולל את המינים דולילטה gegenbauri, הם קטנים זואופלנקטון הג ימית של משמעות אקולוגית המצויים על מערכות משנה יצרנית המדף ברחבי העולם. הקושי של התקשות האורגניזמים העדינים האלה מגביל את החקירה שלהם. במחקר זה אנו מתארים גישות טיפוח לאיסוף, גידול ושמירה על הdoliolid דולילטה gegenbauri.

תקציר

לגטין זואופלנקקלס משחקים תפקיד מכריע בתוך מערכות אקולוגיות של האוקיינוס. עם זאת, קשה בדרך כלל לחקור את הפיזיולוגיה, הצמיחה, הפוריות והאינטראקציות ההזנה בעיקר עקב אתגרים מתודולוגיים, כולל היכולת להתרבות. הדבר נכון במיוחד לגבי הdoliolid, דולילטה גגנבאורי. ד. gegenbauri בדרך כלל מתרחשת במערכות המדף סובטרופי continental פרודוקטיבי ברחבי העולם, לעתים קרובות בריכוזים פורחים מסוגל לצרוך חלק גדול של הייצור הראשוני היומי. במחקר זה אנו מתארים גישות טיפוח לאיסוף, גידול ואחזקה של ד. gegenbauri לצורך ביצוע מחקרים מבוססי מעבדה. ד. gegenbauri ומינים doliolid אחרים ניתן ללכוד לחיות באמצעות שכאוכלי מאוד נגרר 202 יקרומטר שינוי כילות פלנקטון של הספינה נסחף. תרבויות הן הוקמה באופן אמין ביותר כאשר טמפרטורות המים הן מתחת ל -21 ° c והם התחילו מגונזוסואידים בלתי-מפותחים, התבגרות ואחיות גדולות. תרבויות ניתן לשמור על כלי תרבות מעוגל על גלגל פלנקטון מסתובבת לאט ומתמשכת על דיאטה של אצות תרבותית במי ים טבעיים במשך דורות רבים. בנוסף ליכולת להקים תרביות מעבדה של D. gegenbauri, אנו מדגימים כי מצב האיסוף, ריכוז אצות, טמפרטורה, וחשיפה למי ים ממוזג באופן טבעי כולם קריטיים לתרבות הקמה, צמיחה, הישרדות ורבייה של D. gegenbauri.

מבוא

זואופלנקטון חשבון עבור ביומסה בעלי חיים הגדול ביותר באוקיינוס, הם רכיבי מפתח באתרי מזון ימיים, ולשחק תפקידים חשובים בתוך מחזורי אושן ביוגיאוכימיים1,2. זואופלנקטון, למרות מורכב של מגוון עצום של אורגניזמים, ניתן להבדיל בגסות לשתי קטגוריות: ז'לטין ולא ז'לטין עם מספר ביניים מטקא3,4. לעומת זואופלנקטון שאינם ז'לטין, זואופלנקטון ז'לטין קשים במיוחד ללמידה בשל ההיסטוריה המורכבת שלהם מהחיים5, והרקמות העדינות שלהם ניזוקו בקלות במהלך לכידת וטיפול. מינים זואופלנקטון ז'לטין הם, ולכן, קשה לשמצה התרבות במעבדה ובדרך כלל למדו פחות לעומת מינים שאינם ז'לטין6.

בין קבוצות זואופלנקטון ז'לטין, אחת שופעת ובעלת חשיבות אקולוגית באוקיינוס העולמי הם התאליאכאנים. התאליסים הם מחלקה של מטונפלאים הכוללים את ההוראות סאלפידה, פירוסואידה ודוליאולידה7. Doliolida, באופן קולקטיבי המכונה doliolida, הם קטנים בצורת חבית בריכת שחייה בחינם האורגניזמים שיכולים להגיע הגבוה מחולות שחיה באזורים neritic פורה של אוקיינוסים סובטרופי. Doliolids הם בין הנפוצים ביותר של כל זואופלנקטון קבוצות4,8. כמו מזינים ההשעיה, doliolids לאסוף חלקיקי מזון מעמודת המים על ידי יצירת זרמים מסנן לכידת אותם על רשתות ריר9. באופן מטקאני, doliolids מסווגים ב-מערכה שאורונתונים10. אב קדמון לבני הזוג, ובנוסף למשמעות האקולוגית שלהם כמרכיבים מרכזיים של מערכות מרכזיות ימיות, הם משמעותיות להבנת מקורותיה של תולדות החיים הקולוניאליים10,11 והאבולוציה , מהדמית הרוח5,7,10.12,13,14

ההיסטוריה החיים של doliolids הוא מורכב תורם את הקושי של culturing ולקיים אותם באמצעות מחזור החיים שלהם. ניתן למצוא סקירה של מחזור החיים הdoliolid והאנטומיה בגובדו אל15. מחזור החיים הdoliolid, הכרוך בשלבי התעללות מיניים והיסטוריה מינית, מוצג באיור 1. ביצים וזרע מיוצרים על ידי זיבה, השלב הבודד היחיד במחזור החיים. גונזואידים משחררים זרע לעמודת המים וביצים מופרות ומשתחררים להתפתח לזחלים. הזחלים לבקוע ומהפך לתוך האוזואידים שיכולים להגיע 1-2 מ"מ. בהנחה לטיפול בתנאי הסביבה ובתזונה, הפכו האחים המוקדמים לאחיות בתוך 1-2 ימים ב-20 ° c ומפעילים את השלבים הקולוניאליים של מחזור החיים. בעלי החיים מייצרים בלוטות. מיניות על התחת שלהם ניצנים אלה להשאיר את הסטעל ולהגר למטה המאמצים האחרונים שבו הם בשורה בשלוש שורות מזווג. השורות המרכזיות הופכות לפלואוזואידים ולשתי השורות החיצוניות הופכות לטרוזואידים. האחרון מספק מזון הן לאחות והן לבני הפאורוזואידים16,17. בזמן שהיא מאבדת. את כל האיברים הפנימיים ככל ששפע של הטרופואידים גדל, גודל האחות יכול להגיע 15 מ"מ במעבדה. כמו phorozooids לצמוח, הם יותר ויותר לבלוע טרף פלנקטון ולהגיע ~ 1.5 מ"מ בגודל לפני שוחרר כמו יחידים17. אחות בודדת עשויה לשחרר את > 100 phorozooids במהלך תוחלת החיים שלה18. לאחר שחרור הפאורוזואידים מהפתבים, הם ממשיכים לצמוח והם השלב הקולוניאלי השני של מחזור החיים. ברגע שהם מגיעים ~ 5 מ"מ בגודל, כל phoroבאיד מפתחת מקבץ של גונדוזואידים על הדוד שלהם מדווש. הגונזואידים האלה יכולים לבלוע חלקיקים כשהם מגיעים ~ 1 מ"מ באורך. לאחר שהגונזואידים הגיעו ~ 2 עד 3 מ"מ בגודלם הם שוחררו מן phorozooid ולהיות השלב הבודד היחיד של מחזור החיים. ברגע שהם מגיעים ~ 6 מ"מ בגודל, הגונזואידים להפוך בוגרת מינית17. הגונזואידים יכולים להגיע לאורך 9 מ"מ או יותר. גונסוזואידים הם מרמוניסטיים, זרע משוחרר לסירוגין בעוד הפריה הביצים מתרחשת באופן פנימי16,17. כאשר ה≥ בגודל של 6 מ"מ, הוא משחרר עד 6 ביצים מופרות. Culturing מוצלחת דורש תמיכה בצרכים הספציפיים של כל אחד משלבי ההיסטוריה הייחודיים האלה של החיים.

בשל המשמעות האקולוגית והאבולוציונית של התאליסים, כולל doliolids, קיים צורך במתודולוגיות הטיפוח לקדם את ההבנה של הביולוגיה הייחודית, הפיזיולוגיה, האקולוגיה וההיסטוריה האבולוציונית של האורגניזם הזה19 . Doliolids יש הבטחה ניכרת כמו אורגניזמים מודל ניסיוני בביולוגיה התפתחותית גנומיקה תפקודית משום שהם שקופים וכנראה יש גנום יעיל20,21. לעומת זאת, חוסר שיטות הטיפוח האמינות מעכבת את התועלת שלהם כמודלים מעבדתיים. למרות קומץ של מעבדות פרסמו תוצאות המבוססות על doliolids תרבותי, לגישות הידע שלנו ופרוטוקולים מפורטים לא פורסמו בעבר. בהתבסס על שנות ניסיון, ניסיון וטיפוח שגיאה, מטרת מחקר זה הייתה לסקור חוויות ולשתף פרוטוקולים לאוסף ולטיפוח של doliolids, במיוחד את המין המיני דולילטה gegenbauri.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת מתקני מינון לגידול מתקנים

הערה: כל החומרים והציוד הנדרשים מפורטים בטבלת החומרים.

  1. הכינו 1 M נתרן הידרוקסיד (NaOH), 0.06 M אשלגן פרמנגנט (KMnO4) פתרון. כדי להכין את הפתרון הזה, לפזר 400 g של NaOH ל 10 המים האלה מימי. הוסף 100 g של KMnO4 לפתרון naoh ולערבב היטב.
  2. הכינו את התמיסה 0.1 M ביסולפיט (נחכ3) על-ידי המסת 100 g של נחסו3 ל -10 מים מיוהים ומערבבים היטב.
    התראה: ריאגנטים אלה הם גירויים שעלולים לגרום לבעיות בדרכי הנשימה אם נשאף. מקום באזור מאוורר היטב, כגון ברדס. . הימנע ממגע עם העור לובשים כפפות מגן, ביגוד מגן, הגנת עיניים והגנה על הפנים בעת טיפול.
  3. לפני הקמת והגידול של תרבויות doliolid במעבדה, לנקות ולעקר את צנצנות התרבות.
    1. לשטוף 1.9 L ו 3.8 צנצנות תרבות לפחות 3 פעמים עם מים מלא מימים. אפשר לייבש את כובעי הברגים, מכיוון שהמכסים אינם נכללים בשלבי הניקוי הבאים.
    2. לנקות ולעקר 1.9-ו-3.8 צנצנות זכוכית לויטראז ' על-ידי האישירה בתמיסה של NaOH/KMnO4 . הניחו לצנצנות להשרות בין לילה.
    3. הסירו את הצנצנות מהפתרון הרביעי של naoh/kmno והישאב את הצנצנות לתוך התמיסה של סודיום ביסולפיט (נחכ3). הניחו לצנצנות להשרות בין לילה.
    4. הסירו את הצנצנות מהפתרון נחכ3 ושטפו היטב במים מפוהים. . הניחו לצנצנות להתייבש
  4. מניחים את גלגל הפלנקטון (איור 2) בחלל מבוקר טמפרטורה (חדר סביבתי). הטמפרטורה היא 20 ° c. לקבלת תיאור מפורט יותר של גלגל הפלנקטון המותאם אישית, עיין באיור המשלים 1.

2. תרבות הפיטופלנקטון

  1. להשיג תרבויות פריחת אצות מן המרכז הלאומי לאצות ים microbiota (ncma) או מקורות אחרים כדי לשמש כמזון עבור D. gegenbauri. תערובות של שני מינים הדגל כולל איזוקריזיס galbana (ccmp 1323), rhodomonas sp (ccmp 740), ו Diatom קטן, thalassiosira וייספלוי (ccmp 1051) התקבלו מ-ncma ושימשו במעבדה הקודמת לימודים האחורי doliolids בהצלחה17.
  2. הכינו את מדיית הצמיחה L1 ו-L1-Si22 כפי שמומלץ על ידי ncma.
  3. בצע את ההוראות המסופקות על ידי הספק כדי ליזום את התרבויות החדשות של פריחת אצות.
  4. כדי לשמור על תרבויות המניות, באמצעות טכניקות התרבות הקפדנית axenic, העברת 0.5 mL של תרבות senescing הישן ל 25 מ ל של מדיה צמיחה טריים ב סטרילי 55 mL זכוכית התרבות צינורות מדי שבועיים.
    הערה: לא ניתן לאחסן את התרבויות החיות מבלי להעבירו בקביעות. אם לא נעשה שימוש בתרבויות לפרקי זמן ארוכים, ואין אפשרות לשמור על התרבויות למשך התקופה שאינה שימוש, מומלץ לרכוש מחדש את התרבויות הנפוצות הללו ממקורות המקור שלהם (למשל, NCMA).
  5. הכנת כמויות גדולות יותר של פיטופלנקטון עבור doliolids האכלה בניקוי 500 mL פלסטיק רקמות התרבות המכילה 200 mL של מדיית הצמיחה.
    1. איחסן פיטופלנקטון ממניות axenic (4 מ"ל) לתוך 200 mL של מדיית גדילה (1:50 דילול).
    2. מודטה ב 20 ° c עם אור 12:12 h: מחזור כהה תחת התאורה מגניב אור לבן של 65-85 μE/m2. הניחו מבחנות תרבות שטוח כדי למקסם את התאורה. מערבולת בעדינות את התרבות היומית.
    3. לקבוע את ריכוז התאים באמצעות מונה חלקיקים או מיקרוסקופ כדי לפקח על צמיחת התרבויות.
      הערה: לאחר 7-10 ימים מהחיסונים, התרביות המרצפות יכילו ~ 105-106 תאים/ml והתרבות הדיאטומית תכיל ~ 10-4-10 תאים/ ml. ריכוזים אלה מספיקים כדי לשמור על התרבויות הdoliolid.
    4. ליזום מניות האכלה חדשה במינימום של כל שבועיים כדי לספק מספיק ביומסה פריחת אצות לתמיכה בכל פעילויות התרבות.

3. אוסף של doliolids פראי ו מי ים לתרבות

הערה: סקירה של גישות הגבייה והטיפוח מחולקת באיור 3. תיאור של האוסף המקצועית פלנקטון נטו ו-בקלה מסופק באיור 4.

  1. אתר doliolids על ידי זיהוי אותם באמצעות רשתות פלנקטון או מערכות הדמיה באתרו23.
    הערה: מכיוון doliolids הם לעתים רחוקות נוכח מי השטח ולא ניתן לגילוי על ידי טכנולוגיית חישה מרחוק, מונחה על ידי הידע התנאי של תנאים נוחים doliolids (ראה דיון), נוכחות של doliolids חייב להיקבע לפני הדגימה.
  2. איסוף מי ים עשירים בחלקיקים לפני איסוף doliolids חי לקראת ייזום תרבות D. gegenbauri .
    1. פריסת בקבוקי Niskin רכוב על שושנת העלים CTD או ציוד מקביל כדי לאסוף מים מהאתר שבו doliolids ממוקמים מעומק המכיל את האומדנים הגבוהים ביותר של כלורופיל ריכוז המשוער על ידי באתרו פלואורומטריה.
      הערה: מכלורופיל הריכוז משמש כאינדיקטור לריכוזי חלקיקים. ב דרום האוקיינוס האטלנטי בייט (SAB) באמצע היבשת, משטח המשנה כלורופיל מקסימום הוא בדרך כלל קרוב לתחתית, אבל במקומות אחרים, זה לא יכול להיות.
  3. לאחר doliolids ממוקמים, לשחזר doliolid בעלי חיים שאינם תקינים באמצעות ברשת הפלנקטון המקצועית ו-בקלה סוף. לפני פריסת הרשת, מלא את בקלה עם מי ים.
    1. מתוך הספינה נסחף, נמוך להעלות את הרשת דרך עמודת המים שמירה על זווית גרירה אלכסונית של ~ 15-25 ° ופריסה אנכית מהירות אחזור לא יותר 15 m/min.
  4. לאחר הרשת היא על הסיפון, בעדינות להעביר ולחלק את התוכן של בקלה לתוך 3, 5-ליטר (~ 20 L) דליים פלסטיק כל המכיל ~ 10 L של מי-ים משטח שנאסף מהאתר.
    הערה: דליי פלסטיק חדשים צריכים להיות ממוזגים על ידי הוספת ימי מי ים לפני doliolid החיים אוסף. המטרה היא להפחית את שטיפת כימיקלים מפלסטיק. אם מי-ים אינו זמין, השתמש בטוהר (למשל, מילי Q) או ברז מים ללא מזהמים רעילים כדי לטפל בדליים.
  5. בודד doliolid זואידים. מפלנקטון אחר
    1. בקבוצות קטנות (~ 2 l) העברת לוחיו מעורבים מתוכן הגרירה הנטו (כיום ב -20 דליי פלסטיק ליטר) לגביע מזכוכית בעלת 2 מטרים.
    2. באמצעות שימוש בצנרת זכוכית משעממת (8 מ"מ מזהה x 38 ס"מ אורך), סיפון בזהירות להעביר באופן פעיל שחייה doliolid זואוids מן הגביע לתוך צנצנות אמנות זכוכית נקייה המכיל מי ים עשיר חלקיקים שנאספו באמצעות בקבוקי Niskin מאיפה doliolids היו מוקם.
    3. שחררו בעדינות את מdoliolid הזואואידים מתחת לפני-הים.
      הערה: לאסוף מחלות, שלבים המכילים מפתחים מחוברים, ושלבי האחות המכילים מצורף מטפוטזואידים (איור 1).
  6. לאחר תוספת של doliolids, להוסיף Rhodomonas sp. תרבות לריכוז הסופי של ~ 5 x 103 – 104 תאים/mL (~ 50 mL של תרבות המכילה ~ 5 x 104 – 1 x 105 תאים/mL בצנצנת 3.8 L). זה כדי לקבוע אם doliolids הם האכלה באופן פעיל. כאשר doliolids לבלוע Rhodomonas sp., מערכת העיכול שלהם יופיע אדום בצבע. הסר את הזואואידים שאינם נראים כניזונים.
  7. כדי למנוע doliolids מלהיות לכוד בממשק מים האוויר, למנוע את החלל הקדמי של צנצנות התרבות על ידי מילוי לחלוטין את הצנצנות עם מי ים עשירים חלקיק מסונן והצבת פיסת פלסטיק לעטוף על פתיחת צנצנת (89 מ"מ רחב).
    1. להימנע מיצירת בועות אוויר שיכול גם לפגוע בחיות. בזהירות להרוס את הכובע על הצנצנת ולהפוך בעדינות את הצנצנת כדי לקבוע אם בועות נוכחים. אם קיימים בועות, הסר אותם.
    2. לאחר מילוי הצנצנות, מסירים את המים העודפים מחוץ לצנצנת.
  8. הר כל צנצנת על גלגל הפלנקטון (איור 2) על ידי הצבת הצנצנת על פסי מתכת אנכיים מכוסים אבובים גומי, בין מלחציים צינור נירוסטה.
    1. ודא כי החלק האחורי של הצנצנת מרופד נגד אבובים גומי. הדק את מהדק הצינור מסביב לצנצנת על-ידי כוונון הבורג.
    2. בדוק כי הצנצנת אינה נעה ברגע שהוא מהודק היטב במקום. לאפשר את הצנצנות לסובב ב 0.3 סל ד כדי לשמור את doliolids בהשעיה.
      התראה: חשוב שלא להדק את הצנצנת כדי למנוע סדיקה של הצנצנת.
  9. על הספינה, שמרו על כלי התרבות על גלגל הפלנקטון ב -20 ° c באור עמום עד שניתן יהיה להעבירו למתקן תרבות המעבדה.
  10. לאחר שחזרו למעבדה, העבירו את הצנצנות המכילות דוליולידים לתוך מתקן התרבות המוכן. צנצנות הר על גלגל הפלנקטון (ראה שלב 3.8) ולאפשר לצנצנות להמשיך לסובב ב 0.3 סל ד.
    הערה: כל הגידול של doliolids במחקר זה נערך ב 20 ° c.

4. שמירה על תרביות D. gegenbauri

  1. מהספינה למעבדה, הרשו לבעלי החיים להאקלים בצנצנות המקוריות לתנאי המעבדה במשך 3 ימים.
    1. במהלך תקופת הסתגלות, השתמשו בפיפטה רחב ומשעמם להחלפת 10% מהמים עם מי ים עשירים בחלקיקים ללא פילטר מאתר האוסף מדי יום במשך 3 ימים.
    2. שמרו על מספר שורות בצנצנת אך הסירו את כל הזואופלנקטון האחרות, כדורי בצואה גדולים, וחלקיקים צבורים גדולים שעלולים לסתום את מנגנון הסינון של הdoliolid (רשת ריר). אם התרבות כוללת מהאחיות המוקדמות, שמרו על גונדואיד גדול אחד (≥ 6 מ"מ) בצנצנת.
      הערה: לא חשוב אילו מינים שטרגליים כלולים בתרבות, אבל בניסוי זה, המינים הנפוצים ביותר הנמצאים מהמקום שבו נלכדו doliolids שימש.
  2. בעקבות תקופת הסתגלות, להעביר doliolid בעלי החיים והקותוכים מן הצנצנת המקורית לצנצנת טיפוח נקי המכיל 80% סיבי זכוכית מסנן (GF/F) מי ים מסוננים ו 20% ממי הים מן הצנצנת המקורית. להכין מי ים מסוננים על ידי סינון מי ים דרך GF/F עם גודל נקבובית הנומינלי של נייר מסנן יקרומטר 0.7.
  3. לשמור על התרבות החדשה על ידי החלפת 10% מהמים עם מי ים מסוננים GF/F כל 3 ימים על ידי הסרת אגרגטים וכדורי צואה. שבועי, העברת בעלי חיים לצנצנת חדשה כמתואר בשלב 4.2.
  4. להאכיל doliolids על ידי שמירה על ריכוזי פיטופלנקטון בצנצנות התרבות בין 40-95 μg C/L.
    הערה: ריכוזים אלה מחקים תנאים סביבתיים הידועים לתמוך בתנאי הפריחה עבור D. gegenbauri17. תערובת המינים של אלגל משתנה בהתאם לשלב החיים ולמספר הזואופיאידים בכל צנצנת. במהלך שלבי החיים המוקדמים, יש להוסיף 1:1 תערובת (על-ידי תוכן פחמן) של האצות הקריפטטוונספירה (איזוקריזיס גליאנה ורודומונס sp.) בלבד. מינים טרף גדול יכול בקלות לסתום את מנגנון האכלה של אחיות קטנות ופיתוח trophozooids. הוסיפו את הדיאטום האידיאסיאוטרה לתערובת האלגל, גם בתכולת הפחמן השווה, כאשר מאכילים את האחיות הגדולות, הפלואוזואידים והגונזואואידים.
    1. לעקוב אחר ריכוזי פריחת אצות לפני ואחרי האכלה כדי להנחות את ההחלטה של כמה פעמים וכמה אצות להוסיף לתרבויות. השתמש במונה חלקיקים כדי לקבוע ריכוזים של פריחת אצות, כי ריכוזי פריחת אצות בצנצנות התרבות הם מדלל יחסית.
  5. הסרת מספיק זואוids כדי לשמור על ריכוזי פריחת אצות של 40 – 95 μgc/L כך את doliolids הנותרים יהיה מספיק אוכל כדי לצמוח.
    הערה: השלב הקשה ביותר לקיום בהצלחה בתנאים מעבדתיים הוא הזחלים המתפתחים והאוזואיד (האחות המוקדמת). במהלך שלב זה של התרבות, שמרו על גונדואיד גדול אחד (≥ 6 מ"מ) בנוסף למספר כפרים בצנצנת עם הזחלים המפתחים והאוזאואידים (~ 20 לכל 3.8 L).
  6. העברת לפחות 4 אחיות לתוך צנצנת culturing חדש פעם מינימום של 8 trophozooids גלויים על המאומצים של האחות (איור 1B).
    הערה: הטרוזואידים יוכפל במספר כל 1 – 2 ימים ב-20 ° c. טרוזוזואידים גדולים מספיק כדי. להיות גלויים לעין בלתי
    1. להסיר שתי אחיות פעם אחיות לפתח 20 טרופוטזואידים.
    2. להסיר אחות אחת כאשר האחיות לפתח > 30 טרופוטזואידים על המאמצים שלהם. הרשו לאחות הנותרת לפתח את הפלואוזואידים על מאמצים.
    3. להסיר את האחות ברגע שהאחות משחררת עד 30 פלואורוזואידים.
  7. להקטין את מספר בעלי החיים בצנצנת פעם הפלואורוזואידים להגיע 3 מ"מ בגודל.
    1. להסיר את כל מלבד ארבעה phorozooids כאשר הפלואואידים לגדול (> 5 מ"מ) ופיתחו אשכולות gonozooid.
    2. הפחת את התרבות לשני פלואוזואידים כאשר מספר האשכולות של גונבזואואידים גדל בגודל ומתחיל להיזון.
    3. הסירו את הפלואוזואידים ברגע. שהפלומאידים ישחררו עד 30 גונבזואואידים
  8. הפחת את מספר הזיבה מ -30 בעלי חיים ל -2 לכל צנצנת. הניחו לביצים מופרות להשתחרר לתוך הצנצנת.
    1. . לאחר שהאובזואידים יתפתחו
      הערה: ניתן להשתמש באחיות שנמחקו, בפלואוזואידים, ובגונזואופיקציה כדי לזרוע תרבויות נוספות ולערוך ניסויים נוספים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בעקבות ההליכים המתוארים לאיסוף ולעיבוד הdoliolid, d. gegenbauri המתואר באיור 3, ניתן לשמור על תרבות של d. gegenbauri במהלך ההיסטוריה המורכבת שלה חיים (איור 1) ו קיים אותו במשך דורות רבים. למרות שהטיפוח של D. gegenbauri מתואר כאן, הליכים אלה צריכים גם להיות רלוונטיים לטיפוח של זנים doliolid אחרים.

לכידת doliolid בריאים ולא ניזוק דורש יישום של רשתות מיוחדות והליכי גרירה (איור 4). ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הקיבולת של doliolids התרבות הוקמה במהלך העשורים האחרונים ושימש לתמיכה במחקר במספר תחומים. מחקרים ניסיוניים במעבדות שלנו תמכו בפרסום של לפחות 15 מחקרים מדעיים התמקדו האכלה וצמיחה18,26, רבייה18,28, דיאטה6, 29, פיזיולוגיה30, אקולוגיה31, ו מודל אקולוגי27 של doliolids.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

. למחברים אין מה להצהיר

תודות

אנו אסירי תודה לאנשים רבים שתרמו ידע שנצבר לפרויקט זה במהלך השנים כולל G.-A. Paffenhöfer וד. דימוס שפיתחו את הפרוטוקולים האלה במקור מ. קייסטר, ול' למברלי תרמו גם הם באופן משמעותי לפיתוח ההליכים הללו.  N.B. לופס-פיגרואה ו-האדרגס-סנטיאגו יצרו את האומדנים של doliolid שפע שניתן בטבלה 1. מחקר זה היה נתמך בחלקו על ידי הקרן הלאומית המדע הלאומי פרסים OCE 082599, 1031263 MEF, פרויקטים שיתופיים OCE 1459293 ו OCE 14595010 כדי MEF ו DMG, הלאומית הלאומי והאטמוספירה המינהל פרס NA16SEC4810007 ל DMG. אנו אסירי תודה לצוות החרוץ והמקצועי של סוואנה. לי אן דלאו הכין את הדמויות, צ'ארלס י. רוברטסון הגהה על כתב היד וג (ג'ימי) ויליאמס ייצרה את גלגל הפלנקטון

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינורות תרבית אצות (55 מ"ל צינורות תרבית זכוכית חד פעמיים סטריליים)כלNAלתרביות אצות
חיטויכלNAלעיקור ציוד ומי ים לתרביות אצות
כוסות (זכוכית 2 ליטר)כלNAלמיון תכולת גרירה נטו פלנקטון מדולל
דליים (5 ליטר, ~20 ליטר)כלNAלדילול תכולת גרר רשת פלנטון - יש למזג מי ים לפני השימוש הראשון
Carboys (20 ליטר) כלNAלאחסון
צנצנת תרבות זכוכית Doliolid מי ים (צנצנת זכוכית עם פה צר 1.9 ליטר עם מכסה)QorpakGLC-01882מיכל לתרבית
צנצנת תרבות זכוכית Doliolid (צנצנת זכוכית עם פה צר 3.8 ליטר עם מכסה)QorpakGLC-01858מיכל לתרבית
תא סביבתי (תא סביבתי מבוקר טמפרטורה)כלNAכדי להתאים לתחזוקת גלגל פלנקטון ותרבותית
מכשיר סינון למסנני 47 מ"מכלNAלסינון מי ים לתרבויות
מסנני מיקרופייבר מזכוכית, 47 מ"מWhatman1825-047לסינון מי ים לתרבויות
פיפטת זכוכית (פיפטת זכוכית בורוסיליטית (צינורות זכוכית), OD 10 מ"מ, מזהה 8 מ"מ, עובי דופן 1 מ"מ)חברת המדעNC-10894חיתוך וקצוות מותאמים אישית מהדקי צינור מלוטשים
, נירוסטה, #104 (178 מ"מ)כלNAלהחזקת צנצנות תרבית לגלגל הפלנקטון
Isochrysis galbana זן CCMP1323המרכז הלאומי לאצות ימיות ומיקרוביוטה (NCMA)זן CCMP1323להאכלת תרביות דוליוליד
ערכת מדיה L1, 50 ליטרהמרכז הלאומי לאצות ימיות ומיקרוביוטה (NCMA)MKL150Lלגידול אצות
מנורה (מנורת שולחן פלורסנט עם זרוע מתכווננת)כלNAלהארת דוליולידים בצנצנות ובכוסות
חממה מבוקרת טמפרטורה מוארתכלNAלתרביות אצות
מיקרופיפטות וטיפים סטריליים (0-20 ומיקרו; l, 20-200 ומיקרו; l, 200-1000  ומיקרו; l)כלNAלתרביות אצות
פלנקטון נטו (202 ומיקרו; 0.5 מ', אורך 5:1) עם טבעת קצה בקלה ו  4 L אקווריוםבקלה Sea-Gear Corporation90-50x5-200-4A/BBלאיסוף דוליולידים חיים (ראה איור 4)
גלגל פלנקטוןNANA בנוי בהתאמה אישית (ראה איור 2)
ניילון נצמדכלNAלכיסוי החלק הפנימי של המכסה של צנצנות תרבית דוליוליד
אשלגן פרמנגנטפישר סיינטיפיקP279-500מגיב לניקוי צנצנות וכלי זכוכית
Rhodomonas sp. זן CCMP740המרכז הלאומי לאצות ימיות ומיקרוביוטה (NCMA)זן CCMP740להאכלת תרביות דוליוליד
צינורות גומיNANAלהחזקת צנצנות תרבית לגלגל הפלנקטון (ניתן לייצר מצינורות טיגון)
נתרן ביסולפיטפישר סיינטיפיקS654-500מגיב לניקוי צנצנות וכלי זכוכית
נתרן הידרוקסידפישר ScientificBP359-212מגיב לניקוי צנצנות וכלי זכוכית
פיפטות סרולוגיות סטריליות (1 מ"ל, 5 מ"ל, 10 מ"ל, 25 מ"ל)כלNAלתרביות אצות
Thalassiosira weissflogii זן CCMP1051המרכז הלאומי לאצות ימיות ומיקרוביוטה (NCMA)זן CCMP1051להאכלת תרביות דוליולידים
צלוחיות תרבית רקמות (250 מ"ל)כלNAלתרביות אצות

מקורות

  1. Banse, K. Zooplankton – Pivotal role in the control of ocean production. Ices Journal of Marine Science. 52 (3-4), 265-277 (1995).
  2. Wilson, S. E., Ruhl, H. A., Smith, K. L. Zooplankton fecal pellet flux in the abyssal northeast Pacific: A 15 year time-series study. Limnology and Oceanography. 58 (3), 881-892 (2013).
  3. Bode, A., Álvarez-Ossorio, M. T., Miranda, A., Ruiz-Villarreal, M. Shifts between gelatinous and crustacean plankton in a coastal upwelling region. Ices Journal of Marine Science. 70 (5), 934-942 (2013).
  4. Kiorboe, T. Zooplankton body composition. Limnology and Oceanography. 58 (5), 1843-1850 (2013).
  5. Holland, L. Z. Tunicates. Current Biology. 26 (4), R146-R152 (2016).
  6. Walters, T. L., et al. Diet and trophic interactions of a circumglobally significant gelatinous marine zooplankter, Dolioletta gegenbauri (Uljanin, 1884). Molecular Ecology. , Special Issue: Species Interactions, Ecological Networks and Community Dynamics (2018).
  7. Piette, J., Lemaire, P. Thaliaceans, the neglected pelagic relatives of ascidians: a developmental and evolutionay enigma. Quarterly Review of Biology. 90 (2), 117-145 (2015).
  8. Acuña, J. L. Pelagic tunicates: Why gelatinous? American Naturalist. 158 (1), 100-107 (2001).
  9. Alldredge, A. L., Madin, L. P. Pelagic tunicates – unique herivores in the marine plankton. Bioscience. 32 (8), 655-663 (1982).
  10. Wada, H. Evolutionary history of free-swimming and sessile lifestyles in urochordates as deduced from 18S rDNA molecular phylogeny. Molecular Biology and Evolution. 15 (9), 1189-1194 (1998).
  11. Zeng, L. Y., Jacobs, M. W., Swalla, B. J. Coloniality has evolved once in stolidobranch ascidians. Integrative and Comparative Biology. 46 (3), 255-268 (2006).
  12. Delsuc, F., Brinkmann, H., Chourrout, D., Philippe, H. Tunicates and not cephalochordates are the closest living relatives of vertebrates. Nature. 439 (7079), 965-968 (2006).
  13. Garstang, W. The morphology of the Tunicata, and its bearing on the phylogeny of the chordata. Quarterly Journal of Microscopical Science. 72 (285), 51-187 (1929).
  14. Govindarajan, A. F., Bucklin, A., Madin, L. P. A molecular phylogeny of the Thaliacea. Journal of Plankton Research. 33 (6), 843-853 (2011).
  15. Godeaux, D., Bone, Q., Braconnot, J. C. The Biology of Pelagic Tunicates. Bone, Q. , Oxford University Press. 1-24 (1998).
  16. Deibel, D., Lowen, B. A review of the life cycles and life-history adaptations of pelagic tunicates to environmental conditions). Ices Journal of Marine Science. 69 (3), 358369(2012).
  17. Paffenhöfer, G., Köster, M. From one to many: on the life cycle of Dolioletta gegenbauri Uljanin (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 33 (7), 1139-1145 (2011).
  18. Paffenhöfer, G. A., Gibson, D. M. Determination of generation time and asexual fecundity of doliolids (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 21 (6), 1183-1189 (1999).
  19. Conley, K. R., Lombard, F., Sutherland, K. R. Mammoth grazers on the ocean's minuteness: a review of selective feeding using mucous meshes. Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 285 (1878), (2018).
  20. Bouquet, J. M., et al. Culture optimization for the emergent zooplanktonic model organism Oikopleura dioica. Journal of Plankton Research. 31 (4), 359370(2009).
  21. Denoeud, F., et al. Plasticity of Animal Genome Architecture Unmasked by Rapid Evolution of a Pelagic Tunicate. Science. 330 (6009), 1381-1385 (2010).
  22. Harrison, P. J., Waters, R. E., Taylor, F. J. R. A broad-spectrum artificial seawater medium for coastal and open ocean phytoplankton. Journal of Phycology. 16 (1), 2835(1980).
  23. Ohman, M. D., et al. Zooglider: An autonomous vehicle for optical and acoustic sensing of zooplankton. Limnology and Oceanography-Methods. 17 (1), 69-86 (2019).
  24. Takahashi, K., et al. In situ observations of a doliolid bloom in a warm water filament using a video plankton recorder: Bloom development, fate, and effect on biogeochemical cycles and planktonic food webs. Limnology and Oceanography. 60 (5), 1763-1780 (2015).
  25. Deibel, D. The biology of pelagic tunicates. Bone, Q. , Oxford University Press. 171-186 (1998).
  26. Gibson, D. M., Paffenhöfer, G. A. Feeding and growth rates of the doliolid, Dolioletta gegenbauri Uljanin (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 22 (8), 1485-1500 (2000).
  27. Haskell, A., Hofmann, E., Paffenhöfer, G., Verity, P. Modeling the effects of doliolids on the plankton community structure of the southeastern US continental shelf. Journal of Plankton Research. 21 (9), 1725-1752 (1999).
  28. Gibson, D. M., Paffenhöffer, G. A. Asexual reproduction of the doliolid, Dolioletta gegenbauri Uljanin (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 24 (7), 703-712 (2002).
  29. Frischer, M. E., et al. Reliability of qPCR for quantitative gut content estimation in the circumglobally abundant pelagic tunicate Dolioletta gegenbauri (Tunicata, Thaliacea). Food Webs. 1, 7(2014).
  30. Köster, M., Paffenhöfer, G., Baker, C., Williams, J. Oxygen consumption of doliolids (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 32 (2), 171-180 (2010).
  31. Paffenhöfer, G. A hypothesis on the fate of blooms of doliolids (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 35 (4), 919-924 (2013).
  32. Takahashi, K., et al. Sapphirinid copepods as predators of doliolids: Their role in doliolid mortality and sinking flux. Limnology and Oceanography. 58 (6), 1972-1984 (2013).
  33. Martí-Solans, J., et al. Oikopleura dioica Culturing Made Easy: A Low-Cost Facility for an Emerging Animal Model in EvoDevo. Genesis. 53 (1), 183-193 (2015).
  34. Nishida, H. Development of the appendicularian Oikopleura dioica: Culture, genome, and cell lineages. Development Growth & Differentiation. 50, S239-S256 (2008).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

גידול דוליולידיםגרירת רשת פלנקטוןעיקור צנצנות זכוכיתפרוטוקול האכלה באצותגידול בגלגל פלנקטוןשלבי מחזור חייםבקרת טמפרטורהניטור ריכוז אצותטכניקת טיפול עדין
הטיפוח-תרגול של החיל הימי ( uljanin 1884) למחקרים ניסיוניים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.