הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

פאן-מיאלואיד הבידול של האדם כבל דם נגזר CD34+ המטפאות גזע ותאים מחולל

9.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59836

⸱

9 באוגוסט 2019

 ,  , 
1Department of Basic Medical Sciences, College of Medicine-Phoenix, University of Arizona

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור האפיון האימונוophenic ו ציטוקינים המושרה בידול של דם טבורי הנגזר CD34+ המטפאות גזע ותאים מחולל לארבעה הלישנים מיאלואידים. היישומים של פרוטוקול זה כוללים חקירות על ההשפעה של מוטציות המחלה מיאלואידית או מולקולות קטנות על הבידול מיאלואיד של CD34+ תאים.

תקציר

הvivo לשעבר של תאי גזע אנושיים המטבטיים הוא מודל נפוץ לחקר המטפיאה. הפרוטוקול המתואר כאן הוא עבור ציטוקינים המושרה הבידול של CD34+ המטפאות גזע ובתאי מחולל לארבעה תאים השושלת המייאלואידית. CD34+ תאים מבודדים דם טבורי הטבור האנושי ושיתוף תרבותי עם התאים MS-5 סטרומה בנוכחות של ציטוקינים. האפיון האימונוophenic של התאים גזע ומחולל קדמון, ואת התאים הבדיל מיאלואידית היוחסין מתוארים. באמצעות פרוטוקול זה, CD34+ תאים עשויים להיות מודבטים עם מולקולות קטנות או התמרה עם וירוסים כדי לבטא מוטציות המחלה מיאלואידית לחקור את השפעתם על בידול מיאלואידית.

מבוא

בידול רגיל של תאי גזע המטפאות (HSCs) הוא קריטי עבור תחזוקה של רמות פיזיולוגיות של כל תאי הדם הזמן. במהלך הבידול, בתגובה מתואמת כדי להביא רמזים מתוך כולל גורמי גדילה וציטוקינים, HSCs הראשון להצמיח לתאים רב-עוצמה (MPP) בתאי שיש להם פוטנציאל lympho-מיאלואידית1,2,3 ,4 (איור 1). MPPs להצמיח ושלתי מיאלואידית משותפת (CMPs) ו ושלתי הלימפה הנפוצות (CLPs) כי הם מוגבלים השושלת. CLPs להבדיל לתוך לתאי הלימפה המורכבת B, T, ואת התאים הטבעיים הרוצח. CMPs לייצר את לינאיד מיאלואידית באמצעות שתי אוכלוסיות מוגבלות יותר, מגקריוציט אריתרופואיד ושלתי (MEPs), ו גרנולוציט ושלתי (GMPs). MEPs להצמיח מגקריוציטים ו אריתרופוציטים, ואילו GMPs להצמיח גרנולוציטים ומונוציטים. בנוסף הנובעים דרך cmps, מגקריוציטים דווחו גם להתעורר ישירות מ HSCs או מוקדם mpps דרך שבילים לא קאנוניים5,6.

בתאי גזע ומחולל מצוי (HSPCs) מאופיינים על ידי סמן פני השטח CD34 וחוסר סמנים ספציפיים השושלת (לין-). סמנים פני השטח האחרים המועסקים בדרך כלל כדי להבחין בין אוכלוסיות HSCs ו מיאלואידית כוללות CD38, CD45RA, ו CD1232 (איור 1). HSCs ו-MPPs הם Lin-/cd34+/Cd38- ו-Lin-/cd34+/cd38+, בהתאמה. אוכלוסיית המייאלואיד המחויבת מאופיינת בנוכחות או היעדרות של CD45RA ו-CD123. Cmps הם lin-/cd34+/cd38+/cd45a-/cd123lo, gmps הם לין-/cd34+/cd38+/cd45a+/cd123lo, ו-meps הם לין-/cd34+ /Cd38+/cd45ra-/cd123-.

האוכלוסיה הכוללת של CD34+ גזע ותאים מחולל שיכול להיות מושגת בדם טבורי הטבורי דם (ucb), מח עצם, ו דם היקפי. CD34+ תאים מהווים 0.02% עד 1.46% של התאים הכולל של מונמונומנט (mncs) ב-ucb האנושיים, ואילו האחוזים שלהם משתנה בין 0.5% ל-5.3% במח העצם והוא נמוך בהרבה ב-~ 0.01% בדמו היקפי7,8,9 . היכולת ההתרבות והפוטנציאל לבידול של ucb נגזר CD34+ תאים הוא גבוה באופן משמעותי מזו של מח עצם או בתאי דם היקפיים1,10, ובכך מציע יתרון ייחודי להשגת חומר מספיק עבור ניתוחים מולקולריים בשילוב עם ביצוע האפיון אימונוopotypic ומורפולוגיים של התאים במהלך בידול.

Vivo הבדלה לשעבר של דם טבורי שנגזר CD34+ hspcs הוא מודל נרחב שהוחל לחקירת המטפיאה הרגילה ומנגנוני המחלה המטתית. כאשר מתורבתים עם ציטוקינים המתאים, ucb CD34+ hspcs יכול להיות המושרה להבדיל לאורך הלאואיד מיאלואידית או הלימפה11,12, 13,14,15 , 16. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים לבידוד האפיון החיסונית של CD34+ hspcs מן האדם ucb, ועל הבידול שלהם לתאי השושלת המייאלואידית. מערכת זו של התרבות מבוססת על הבידול cy, המושרה על ידי HSPCs בנוכחות של התאים מסטרומה MS-5 לחקות את מיקרוסביבה במח העצם. תנאי התרבות לגרום התרחבות ראשונית של CD34+ תאים, ואחריו בידול שלהם לתאים המבטאים סמנים עבור ארבעה תאים השושלת מיאלואידית, כלומר גרנולוציטים (CD66b), מונוציטים (CD14), מגה קריוציטים (CD41), ו אריתרופוציטים (CD235a). יישומים של CD34+ תא בידול הפרוטוקול כוללים מחקרים על מנגנונים מולקולריים הוויסות המטטוזיס, וחקירות של ההשפעה של מחלות מיאלואידית הקשורים מוטציות ומולקולות קטנות על התחדשות עצמית ו בידול של HSPCs.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

דם טבורי אנושי לניסויים נתרם על-ידי אנשים בריאים לאחר הסכמה מושכלת לחקלאות משולבת מערכות בריאות (MIHS), פיניקס. היחידות המזוהות הושגו באמצעות הסכם העברת חומרים בין MIHS לבין אוניברסיטת אריזונה.

1. ריאגנטים ומאגרים

הערה: הכינו את כל הריאגנטים והמאגרים בתנאים סטריליים בארון בטיחות ביולוגי.

  1. הכינו מאגר של PBS-BSA-EDTA (PBE) על-ידי הוספת 7.2 מ"ל של סטרילי 35% סרום מדיום (BSA; השתמש בתרבית רקמה סטרילית כיתה 35% BSA) ו 5 מ ל סטרילי 0.5 M אתילן diamine חומצה אצטית (EDTA) ל-487.8 mL של פוספט באגירה של דולסין סטרילי תמיסת מלח (DPBS). המסנן מחטא את המאגר באמצעות השארת הפילטר המצורף לוואקום בארון בטיחות ביולוגי לפחות 2 שעות. מאגר הדלק הממגז בנפחים קטנים יותר (250 mL) ומאחסן ב -4 ° c.
  2. הכינו 1 x הנקס פתרון מאוזן (1x HBSS). לדלל 100 mL של מלאי 10x HBSS ב 900 mL של מים מזוקקים סטרילי לעשות 1 L של 1x HBSS ולהתאים את ה-pH ל 7.2. המסנן מחטא את ה-1x HBSS לפני השימוש.
  3. הכינו 2% חומצה אצטית תמיסה על ידי הוספת 2 מ ל של חומצה אצטית קרחוני כדי 98 mL של מים מזוקקים.
  4. הכן 20 ng/mL רקומביננטי פתרון קטע האדם fibronectin ב 1x PBS. הפוך את 10 mL לכל 48-צלחת.
  5. הכן 2% BSA. כדי 100 mL 1x PBS, להוסיף 2 גרם של שבר BSA V. מסנן לעקר לפני השימוש.
  6. הפוך את מדיום הנשר המלא של Dulbecco (DMEM) על-ידי הוספת אבקת DMEM, 3.7 gm נתרן ביקרבונט, 100 מ"ל בשור העוברי (FBS) ו-5 מ ל פניצילין-סטרפטומיצין (PS) כדי 800 mL של מים מזוקקים סטרילי. ערבב וליצור את עוצמת הקול ל 1 L, ומסנן לעקר לפני השימוש.
  7. הכינו בינוני מקפיא על ידי ערבוב 90 מ ל של FBS ו 10 mL של diמתיל סולפוקסיד סטרילי (DMSO).
  8. הכן גירוי בינוני. כדי סרום חינם בינוני, להוסיף L-גלוטמין כדי 2 מ"מ, ו ציטוקינים לריכוז הסופי של 50 ng/mL עבור מקדם תא גזע (scf), התרובפיאה (tpo), ו-fms-כמו טירוצין קינאז 3 ליגנד (Flt3L), ו 20 ng/mL עבור interleukin-3 (IL3) (ראה לוח חומרים להכנת פתרונות מניות ציטוקין. מבצע 5 מ"ל לכל 48-צלחת.
  9. הכינו מדיום בידול מיאלואיד 1x. כדי להשלים DMEM, להוסיף ציטוקינים לריכוז הסופי של 5 ng/mL עבור SCF, Flt3L, ו IL3, 50 ng/mL עבור TPO, ו 4 יחידות/mL עבור אריתרופויאטין (אריתרופואיטין). מבצע 5 מ"ל לכל 48-צלחת.
  10. הכינו מדיום לבידול 2x מיאלואיד. כדי להשלים DMEM להוסיף ציטוקינים לריכוז סופי 10 ng/mL עבור SCF, Flt3L, ו IL3, 100 ng/mL עבור TPO, ו-8 יחידות/mL עבור אריתרופואיטין. מבצע 5 מ"ל לכל 48-צלחת.
  11. הכינו את מאגר הזרימה. עד 1 ליטר של 1 x PBS, להוסיף 10 גרם של שבר BSA שבריר V.
  12. הכן 1% פאראפורמלדהיד ב-1x PBS (ראה טבלת חומרים לפרטים).
  13. הכנת פתרון פולי-L-ליזין על-ידי הוספת 500 μL של 10 מ"ג/mL פולי-L-ליזין כדי 49.5 mL של 1x PBS.

2. בידוד תאים מונמונומנט מחבל הטבור

הערה: עבור הפרוטוקול המתואר להלן, כמויות דם טבורי של 90 כדי 100 mL שימשו. הבידוד של CD34+ תאים יש לבצע בתנאים סטרילי בארון בטיחות ביולוגית.

  1. רסס את התיק המכיל UCB עם 70% אתנול לעקר את המשטח החיצוני לפני החדרת אותו לתוך הארון בטיחות ביולוגית. העברת UCB לתוך בקבוק פלסטיק סטרילי 250 mL ולדלל אותו 1:1 על ידי הוספת נפח שווה של טמפרטורת החדר (RT) 1x HBSS.
  2. מחלק 15 מ ל של מחקר בינוני MNC (MNC; ראה טבלת חומרים) לצינור לתוך שישה כשישה שפופרות חרוט 50 mL. הטה את השפופרת עם MFM, ובעדינות למזוג 30 מ ל של UCB מדולל על שכבת MFM מבלי להפריע לו.
  3. צנטריפוגה את הצינורות ב 400 x g עבור 30 דקות ב-RT עם האצת איטי ללא בלם.
  4. לאחר צנטריפוגה, מאספירין בין 15-20 mL של פלזמה מעל שכבת MNC. בעדינות לאסוף את MNCs עם פיפטה ולהעביר לצינור חדש 50 mL חרוט.
    הערה: MNCs הפקדה כשכבת באפי לבן בממשק של פלזמה ו-MFM, ואת כדוריות הדם האדומות (RBCs) משקע בתחתית הצינור החרוט.
  5. בריכת MNCs שנאספו מ 2-3 צינורות ביחד. הפוך את הנפח של כל צינור ל 50 mL עם מאגר PBE קר.
  6. צנטריפוגה את הצינורות ב 300 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c, עם בלם על נמוך.
  7. ומקיש בעדינות על הצינורית. כדי לשחרר את הגלולה הסלולרית
  8. השהה מחדש את תאי ההחלקה ב-5 מ ל של מאגר הקירור הקר. השתמש באותו 5 mL של תאים מחדש הושעה כדי לאסוף תאים מצינורות אחרים. לשלב תאים מ 3 עד 4 צינורות יחד בצינור 1 50 mL.
  9. כדי לאסוף את כל התאים הנותרים, לשטוף את כל הצינורות עם 5 מ ל של מאגר PBE קר ולהוסיף את צינור 50 mL חרוט.
  10. לספור את MNCs על ידי דילול 10 μL של השעיית התא לתוך הפתרון חומצה אצטית 490 μL.
    הערה: חומצה אצטית למטה כל RBCs מזהם כדי לאפשר ספירה קלה יותר של MNCs.
  11. הפוך את נפח ההשעיה של התא ל 50 mL עם מאגר PBE קר קרח. צנטריפוגה את התאים ב 300 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c, עם בלם על נמוך.
    הערה: ההשעיה MNC עשוי להיות מעובד מיד עבור בידוד של CD34+ תאים או קפואים עבור יישומים מאוחרים יותר.
  12. כדי להקפיא את MNCs, להסיר את supernatant ולהשעות מחדש בצפיפות של 2 x 107 תאים/mL בהקפאה בינונית ב RT.
  13. הקפא את התאים ב-80 ° c לילה בתא הקפאה מיכל ולאחר מכן העבר אותם לחנקן נוזלי.

3. בידוד CD34+ תאים מתאי מונמונומנט

  1. אם השימוש המבודד MNCs טרי להמשיך ישירות לשלב 3.3.
  2. אם באמצעות MNCs קפואים, במהירות להפשיר את התאים הקפואים באמבט מים 37 ° c ולהעביר לצינור מ50 mL חרוט. לאסוף את כל התאים הנותרים בבקבוקונים עם 1 מ ל של מאגר PBE קר קרח ולהעביר לצינור 50 mL.
  3. הפוך את הנפח של ההשעיה MNC ל 50 mL עם מאגר PBE קר וצנטריפוגה ב 600 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c.
  4. הסר את הסופרנטנט והקש על השפופרת בעדינות כדי לשחרר את הגלולה הסלולרית. להשעות מחדש את MNCs ל 1 x 108 תאים ב 300 μl של מאגר pbe קר קרח.
  5. הוסף 100 μL של FcR חסימה מגיב מיון תא מגנטי המופעל (מקינטוש) האנושית ערכת CD34 מיקרוחרוז לכל 1 x 108 mncs ולערבב בעדינות.
    הערה: זה חוסם מחייב לא ספציפי CD34 מיקרוחרוזי.
  6. הוסף 100 μL של CD34 מיקרוחרוזים לכל 1 x 108 תאים. מערבבים בעדינות ומודגרות ב -4 ° c עבור 30 דקות במקרר. . אל תירק על הקרח
  7. בעוד התאים מודונים, מניחים עמודת LS ומסנן טרום הפרדה בשדה המגנטי מפריד מקינטוש. באופן שולי את העמודה עם מאגר PBE קר קרח על ידי הוספת 2 מ"ל ישירות לתוך העמודה 1 מ ל במסנן טרום ההפרדה. אפשר לעמודה להתרוקן לתוך צינורית חרוט של 15 מ ל ולהשליך את הזרימה.
  8. הסר את MNCs מ 4 ° c, להוסיף מאגר PBE קר קרח כדי ליצור את הנפח ל 15 מ"ל, ו צנטריפוגה את התאים ב 300 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c, עם הבלם על נמוך.
  9. ולהשעות מחדש את התאים. ב-100 מ ל של מאגר הקרח הקר
  10. הוסף את השעיית התא למסנן טרום הפרדות הצבע הממוקם בעמודה LS.
    הערה: מסנן טרום הפרדה מסיר את כל אגרגטים התאים הגדולים שעלולים לחסום את העמודה.
  11. שטוף את השפופרת עם 3 מ ל של מאגר PBE קר קרח ולהוסיף אותו מסנן טרום הפרדה ממוקם על העמודה LS. לאחר מכן, מחק את מסנן טרום ההפרדה.
  12. לשטוף את עמודת LS ארבע פעמים על ידי הוספת 3 מ ל של מאגר PBE קר קרח, המאפשר לעמוד לנקז בכל פעם.
    הערה: התאים CD34+ יישארו מאוגדים לעמודה והתאים שאינם מתויגים יזרמו דרך העמודה.
  13. לאחר השטיפה הסופית, הסר את העמודה מהשדה המגנטי של מקינטוש ומניחים אותו בשפופרת חרוט חדשה של 15 מ"ל, הרחק מהמגנט.
  14. הוסף 5 מ"ל קרח קר מאגר PBE לעמודה ולגרש CD34+ תאים מאוגדים על ידי דוחף בחוזקה את הבוכנה.
  15. באופן אופציונלי, עבור CD34+ תאים מבודדים מהעמודה הראשונה בעמודת LS אחרת עם מסנן טרום הפרדה כמתואר לעיל (שלבים 3.10-3.13).
  16. לספור את CD34+ תאים מבודדים עם טרימין כחול (10 μl של תאים ו 10 μl של טרימין כחול) כדי לקבוע את המספר הכולל של תאים חיים.
    הערה: בשלב זה, CD34 מבודדים+ תאים עלולים להיות קפואים לשימוש מאוחר יותר או עשוי להיות מעובד ישירות לניתוח של HSPCs על ידי הזרמת cy, בסעיף 4) או לבידול תאים השושלת המייאלואידית (סעיף 5).
  17. צנטריפוגה את ההשעיה התא ב 600 x g עבור 5 דקות ב-RT, עם בלם על נמוך.
  18. כדי להקפיא את התאים CD34+ , מאחד את הסופרנטאנט ולהשעות מחדש עד 5 x 106 תאים ב 1 מ ל של הקפאת בינונית להקפיא כמתואר לעיל (שלב 2.13). . אחרת, המשך למחלקה 4 או 5

4. קביעת אוכלוסיות הגבעול והגזע על ידי הזרמת החוליות

  1. כדי לקבוע את השברים של אוכלוסיות גזע ומזרע ב-CD34 מבודדים טריים+ hspcs, צנטריפוגה אותם ב 600 x g עבור 5 דקות ו-להשעות מחדש 1 x 106 תאים ב 50 μl של זרם cy, לנסות מאגר.
  2. כדי 1 x 106 CD34+ תאים, להוסיף נוגדנים (לראות את הטבלה של חומרים לדילול) כדי סמני השושלת (CD3, CD7, CD10, CD11b, CD19 ו-CD235A — כל שמסומנת FITC), CD34 (APC-Cy7), CD38 (pe), CD45RA (pe-), Cy7 (apc) ו-7- aminoactinomycin D (7-עמ מ; ככתם חי/מת) ולפצות על הנפח הכולל כדי 100 μL. מודטה על קרח בחשיכה במשך 20 דקות.
    הערה: פחות מ-1 x 106 CD34+ תאים עשוי להיות מועסק לניתוח. אם מכתים פחות תאים, הנפח הכולל וכמות הנוגדנים שנוספו יש לצמצם בהתאם. עבור הניתוח cy, בלתי מוכתם ומוכתם בודד MNCs יש להשתמש כפקדים עבור הגדרת שערים חיוביים ושליליים עבור כל fluorophore.
  3. לאחר הדגירה, לשטוף את התאים עם 1 מ ל של זרם cy, מאגר צילנסה וצנטריפוגה ב 600 x g עבור 5 דקות.
  4. באופן אופציונלי, לתקן את התאים ויטראז ב 0.5 mL של 1% הפתרון פאראמפורמלדהיד עבור 10 דקות בחושך ב-RT.
  5. צנטריפוגה ב 600 x g עבור 5 דקות ומכה את הסופרנטאנט.
  6. לשטוף את התאים קבוע/מוכתם עם 1 מ ל של זרימה cy, לנסות מאגר וצנטריפוגה ב 600 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c.
  7. משפל את supernatant, להשעות מחדש את התאים ב-500 μL של זרימה cytometry מאגר, ולנתח על ידי הזרמת הזרימה (טבלת חומרים).

5. בידול מיאלואיד של CD34+ המטפאות גזע ותאים מחולל

הערה: כדי להבדיל את CD34+ hspcs לתאי השושלת המייאלואידית, הם הגירוי הראשון של רקומביננטי האדם fibronectin מצופה לוחיות ולאחר מכן הופרה על שכבה של MS-5 מסטרומה תאים בתוך מדיום בידול מיאלואידית. בידול עשוי להיות מפוקח בכל שבוע במשך 3 שבועות מבוסס על ביטוי של סמנים משטח התאים ספציפיים לארבעת הדורות המייאלואידים. במהלך הגירוי והבידול, כל הincubations מתבצעים ב-37 ° c ו-5% CO2 בחדר מחולל לחות. יש לבצע את כל השלבים בארון בטיחות ביולוגי.

  1. מעיל את הבארות של רקומביננטי סטרילי מ48 צופה לוחית-באר על-ידי הוספת 200 μL/טוב של הפתרון האנושי של fibronectin ב-1x PBS עבור 2 h ב RT.
  2. לאחר 2 h, בזהירות להסיר את הפתרון רקומביננטי האדם האנושי ולהשליך.
  3. לחסום את הבארות עם 200 μL/טוב של 2% BSA עבור 30 דקות at RT.
  4. מטפי את הפתרון BSA ולשטוף את הבארות פעמיים עם 500 μL של סטרילי 1x PBS.
    הערה: לוחות מצופים בחלק fibronectin עשויים להיות מאוחסנים ב -4 ° צ' עד 2 שבועות.
  5. כדי לעורר את CD34+ hspcs, להשעות מחדש את התאים הבודדים הטריים (משלב 3.17) בצפיפות של 1 x 105 תאים/200 μl או 5 x 105 תאים/mL של מדיום הגירוי 1x חם.
  6. אם באמצעות CD34+ תאים קפואים, במהירות להפשיר ולהעביר את התאים כדי 15 מ"ל שפופרת חרוט המכיל dmem חם להשלים. צנטריפוגה ב 600 x g עבור 5 דקות ולהשעות מחדש את התאים כמתואר בשלב 5.5.
  7. צלחת 200 μL של CD34+ תא ההשעיה לכל טוב של הקטע fibronectin מצופה 48-ובכן צלחת ו דגירה עבור 48 h.
  8. ביום למחרת, זרע 15,000 MS-5 מסטרומה תאים ב 200 μL של DMEM מלאה לגמרי לאורך של 48-ובכן התרבות רקמה מטופלת לוחית ו דגירה ב 37 ° c עבור 24 h.
  9. לאחר 48 h של גירוי, לאסוף את התאים CD34+ ידי ליטוף עדין. לשטוף את הבארות עם 500 μL של DMEM חם ובריכה עם השעיית תא.
  10. . תספור את התאים עם טרי, כחול צנטריפוגה את ההשעיה ב 600 x g עבור 5 דקות ו-להשעות מחדש בצפיפות של 5,000 תאים/200 μl של בינוני מיאלואידית 1x בידול.
  11. מן 48-ובכן לוחית התרבות רקמה הנזרע עם התאים MS-5 סטרומה, בעדינות לחות את המדיום מבלי להפריע את התאים. שכבה 200 μL (5,000 תאים) של CD34+ תא ההשעיה לכל טוב של הצלחת ו-הדגירה ב 37 ° c.
    הערה: התרבות של התאים MS-5 יכול להישמר DMEM מלאה. ביום התאים CD34+ הם נזרע, התאים MS-5 חייב להיות בשכבה אחידה (80-90% המפגש). מומלץ כי התאים MS-5 מצופים לפחות 24 שעות לפני זריעה של CD34+ תאים.  אם MS-5 התאים הם להיות מצופה 48 h או 72 h לפני זריעת CD34+ תאים, צפיפות התא צריך להיות מותאם בהתאם. מומלץ גם כי הבארות ההיקפית של הצלחת 48-באר להיות ריק או מלא עם 200 μL של מים סטריליים כדי למנוע תופעות הקצה.
  12. ביצוע חצי בינוני שינוי כל 3 על 4 ימים על ידי הסרת בעדינות 100 μL של המדיום מלמעלה של כל באר והחלפתו עם 100 μL של מדיום 2x בידול מיאלואיד בנוסף לכל.
  13. ביום 21, לקצור את התאים לניתוח של ביטוי סמן השושלת המייאלואידית ידי הזרימה cytometry. מבלי להפריע את שכבת MS-5, בעדינות לנקז את התאים בינונית ולהעביר לצינור 5 מ ל.
    הערה: עבור כתמים וזרימה הניתוח cy, תאים מ 1-2 בארות מספיקים. ניתן גם לפקח על הבידול בימים 1, 7 ו -14. אם ביצוע הקלדה חיסונית במספר ימים, יש לחשב בהתאם את מספרי הבארות הדרושים לניתוח.
  14. כתם 5 x 105 תאים עם נוגדנים כדי CD34 (APC-Cy7), CD66B (PE-Cy7), CD14 (pe), CD41 (percp-cy 5.5), ו CD235A (APC) בנפח כולל של 50 Μl. דגירה בקרח בחושך עבור 20 דקות. כלול מוכתם ויטראז בודד מתוך הגדרה ושליטה שערים חיוביים ושליליים עבור כל fluorophore ו 7-עמ ככתם חי/מת לחסל תאים מתים מהניתוח.
  15. שטוף ותקן (אופציונלי) התאים המוכתמים כמתואר לעיל (שלבים 4.3-4.6).
  16. מחדש להשעות את התאים ב-500 μL של זרימה cy, לנסות מאגר ולנתח ידי cytometry זרימה.

6. הערכת מורפולוגיה סלולרית

  1. ניקוי שקופיות מיקרוסקופ על ידי התזת אתנול וניגוב עד סקוויקי.
  2. לטבול שקופיות נקיות בפתרון פולי-L-ליזין עבור 5 דקות ב-RT ויבש עבור 1 h ב RT.
  3. השהה מחדש את HSPCs משלב 3.14 ותאים מובחנים משלב 5.13 ב -10 μL של מאגר cy, הזורם.
  4. להעביר את ההשעיה התא לשקופיות מצופה ולהשאיר אותם להתייבש באוויר.
    הערה: ניתן לאחסן שקופיות מיום 1 ו -21 ביום ב-RT ומוכתמות בו.
  5. יוצקים 0.5 mL של הכתם רייט-Giemsa על השקופית ולתת לעמוד 3 דקות ב RT.
  6. להוסיף נפח שווה של מים מיולים ולתת לעמוד נוסף 10 דקות ב RT.
  7. שטוף את המגלשה. במים מוכי מלים
  8. הדמיה של תאים מוכתמים בהגדלה של 60x או 100x על ידי מיקרוסקופ.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

היישום של הפרוטוקולים הנ ל תשואות 5.6 (± 0.5) x 108 mncs ו 1 (± 0.3) x 106 CD34+ תאים מיחידת דם טבורי של ~ 100 mL. האחוז של סך CD34+ תאים נע בין 80-90% (איור 2א, ב). ניתוח אימונוophenic באמצעות הערכה המתוארת על ידי Manz ואח '5 ממחיש כי התאים CD34+ בדרך כלל מכילים של ~ 20% HSCs ו ~ 72% Mpps כי הם lin-/cd34+/cd38- ו-lin-/cd34+ /Cd38+,...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרוטוקול המתואר כאן מתאים הבידול vivo לשעבר של UCB נגזר CD34+ hspcs לארבע לינאיד מיאלואידית. הדגירה הראשונית עם תערובת cy, המורכב SCF, TPO, Flt3L ו IL3 מעוררת CD34+ תאים. לאחר מכן, הבידול מושגת עם קוקטייל של SCF, IL3, Flt3L, אריתרופואיטין ו TPO. בתמהיל זה, SCF, IL3, ו-Flt3L חשובים להישרדות והתפשטות של CD34+ HSCS. אריתרופואיטין ו tpo לקדם הבדלה לקראת אריתרופוציטים ו-מגקריוציטים, בהתאמה, ו-IL3 מקדמת הבדלה של גרנולוציט מוקדם מונוציט סמנים מוקדמים ותאים בוגרים13,...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

המחברים רוצים להודות וונדי בארט, רחל Caballero, וגבריאלה רואיז מחקלאות מערכות בריאות משולבות ליחידות דם טבורי מזוהה ותרם, Mrinalini קאלה לסיוע עם הזרימה cy, ו נוכלים גיי וכריסטופר Seet עבור עצה על בידול vivo מיאלואידית לשעבר. עבודה זו היתה נתמכת על ידי כספים כדי אס מ המכונים הלאומיים לבריאות (R21CA170786 ו R01GM127464) והחברה האמריקנית לסרטן (מענק המחקר המוסדי 74-001-34-IRG). התוכן הינו באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את ההשקפות הרשמיות של המכון הלאומי לבריאות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.4% תמיסה כחולה טריפאןThermo Fisher Scientific15250-061לדלל מלאי עבודה ל-0.2% בחומצה סטרילית 1x PBS
0.5 M UltraPure אתילן דיאמין טטרה חומצה אצטית, pH 8.0Gibco 15575-038
10x Hanks תמיסת מלח מאוזנת (HBSS)Invitrogen14185052לדלל ל-1x עם מים מזוקקים סטריליים ו-pH ל-7.2
2.5% טריפסין, ללא פנול אדוםThermo Fisher Scientific15090046לדלל מלאי עבודה ל-1x עם סטרילי 1x PBS
30 ומיקרו; m מסנני הפרדה מוקדמתMiltenyi biotech130-041-407
35% אלבומין סרום בקר סטריליSigma-AldrichA7979
7-AADBiolegend420404משמש ככתם חי/מת לחיסול תאים מתים מניתוח FACS
נוגדן CD10-FITC אנטי אנושי (Clone HI10a)Biolegend312207השתמש בדילול
1:20נוגדן CD11b-FITC אנטי אנושי (מופעל) (Clone CBRM1/5)Biolegend301403השתמש בדילול 1:5
נוגדן CD123-APC אנטי אנושי (Clone 6H6)Biolegend306012השתמש בדילול 1:20
נוגדן CD14-PE אנטי אנושי (Clone M5E2)Biolegend301806השתמש בדילול 1:20
נוגדן CD19-FITC אנטי אנושי (Clone 4G7)BD Biosciences347543השתמש בדילול 1:5
נוגדן CD235a-APC אנטי אנושי (Clone GA-R2 (HIR2))BDBiosciences551336השתמש בדילול 1:20
נוגדן CD235a-FITC אנטי אנושי (Clone HIR2)Biolegend306609השתמש בדילול 1:50
נוגדן CD34-APC-Cy7 אנטי אנושי (Clone 581)Biolegend343514השתמש בדילול 1:20
נוגדן CD38-PE אנטי אנושי (Clone HIT2)Biolegend303506השתמש בדילול של 1:20
נוגדן CD3-FITC אנטי אנושי (Clone UCHT1)Biolegend300405 השתמש בדילול 1:20
נוגדן CD41a-PerCP-Cy5.5 אנטי אנושי (Clone HIP8)Biolegend303720השתמש בדילול 1:20
נוגדן CD45Ra-PE-Cy7 אנטי אנושי (Clone HI100)Biolegend304126השתמש בדילול 1:20
נוגדן CD66b-PE-Cy7 אנטי אנושי (Clone G10F5)Biolegend305116שימוש דילול 1:20
נוגדן CD7-FITC אנטי אנושי (Clone CD7-6B7)Biolegend343103השתמש בדילול 1:20
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)Fisher ScientificBP231-100מסנן עיקור לפני השימוש
Dulbecco' s אבקת Modified Eagle Medium (DMEM) עם L-גלוטמין Gibco12100046Reconstruct שקיק 1 לייצור 1 ליטר של מדיה DMEM  עם נתרן ביקרבונט, 10% FBS ו-1% פניצילין וסטרפטומיצין 
סרום בקר עוברי, ממקור אוסטרלי, מומת בחוםOmega ScientificFB-22 Lot #609716
ערכת מיקרו-חרוזים CD34 אנושית Miltenyi biotech130-046-702
תרומבופויטין אנושי (TPO), דרגת מחקרMiltenyi biotech130-094-011הכינו מלאי של 100 ומיקרו; גרם/מ"ל ב-1x PBS + 0.1% BSA. השתמש ב-50 ננוגרם/מ"ל הן להתמיינות מיאלואידית והן גירוי בינוני
L-גלוטמיןאומגה מדעיGS-602 מ"מ ריכוז במדיום גירוי
LS עמודותMiltenyi ביוטק130-042-401
MACS Multi standMiltenyi biotech130-042-303
MidiMACS מפריד מגנטיMiltenyi biotech130-042-302
MNC מדיית פיצול (Ficol-Paque PLUS)GE Healthcare Biosciences17-1440-03
תאימתנה מהמעבדה של נוכלים הומוסקסואלים, UCLA
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148חום 800 מ"ל של 1x PBS בכוס זכוכית על צלחת ערבוב במכסה כימי ל ~ 65 & מעלות צלזיוס. כדי להמיס לחלוטין את הפרפורמלדהיד, העלו את ה-pH על ידי הוספת 1 N NaOH. מצננים ומסננים את התמיסה ומרכיבים את הנפח ל -1 ליטר עם 1x PBS. התאם את ה-pH ל-7.2. 
פניצילין & סטרפטומיציןסיגמא-אולדריץ'P4458-100 מ"ל
פולי-L ליזיןסיגמא-אולדריץ'P2636הכינו מלאי של 10 מ"ג/מ"ל ב-1x PBS
אריתרופואטין-אלפא אנושי רקומביננטי (rHu EPO-α)BioBasicRC213-15הכינו מלאי של 2,000 יחידות/מ"ל ב-1x PBS + 0.1% BSA. השתמש ב-4 יחידות/מ"ל להתמיינות מיאלואידית
שבר פיברונקטין אנושי רקומביננטי (RetroNectin)Takara T100Bהשתמש ב-20 ומיקרו; g/mL מדולל ב-PBS סטרילי 1x לציפוי בארות לפני גירוי של CD34+ HSCs.
ליגנד Flt-3 אנושי רקומביננטי (rHu Flt-3L)BioBasicRC214-16הכינו מלאי של 100 ומיקרו; גרם/מ"ל ב-1x PBS + 0.1% BSA. השתמש ב-5 ננוגרם/מ"ל להתמיינות מיאלואידית & 50 ננוגרם/מ"ל במדיום גירוי
אינטרלוקין אנושי רקומביננטי-3 (rHu IL-3)BioBasicRC212-14הכינו מלאי של 100 ומיקרו; גרם/מ"ל ב-1x PBS + 0.1% BSA. השתמש ב-5 ננוגרם/מ"ל להתמיינות מיאלואידית & 20 ננוגרם/מ"ל במדיום גירוי
גורם תאי גזע אנושי רקומביננטי (rHu SCF)BioBasicRC213-12הכינו מלאי של 100 ומיקרו; גרם/מ"ל ב-1x PBS + 0.1% BSA. השתמש ב-5 ננוגרם/מ"ל להתמיינות מיאלואידית & 50 ננוגרם/מ"ל במדיום גירוי
מדיום ללא סרום (X-Vivo-15)Lonza 04-418Q
נתרן ביקרבונטפישר סיינטיפיקBP328-500
כתם רייט-גימסה, שונהSigma-AldrichWG16-500השתמש בהתאם להוראות היצרן
<חזק>ציוד 
BD LSR II זרימה ציטומטרBD Biosciences
Sorvall Legend RT
אור מיקרוסקופאולימפוס
MS-5 צנטריפוגה

מקורות

  1. Hao, Q. L., Shah, A. J., Thiemann, F. T., Smogorzewska, E. M., Crooks, G. M. A functional comparison of CD34 + CD38- cells in cord blood and bone marrow. Blood. 86 (10), 3745-3753 (1995).
  2. Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11872-11877 (2002).
  3. Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 91 (5), 661-672 (1997).
  4. Seita, J., Weissman, I. L. Hematopoietic stem cell: self-renewal versus differentiation. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. 2 (6), 640-653 (2010).
  5. Haas, S., et al. Inflammation-Induced Emergency Megakaryopoiesis Driven by Hematopoietic Stem Cell-like Megakaryocyte Progenitors. Cell Stem Cell. 17 (4), 422-434 (2015).
  6. Sanjuan-Pla, A., et al. Platelet-biased stem cells reside at the apex of the haematopoietic stem-cell hierarchy. Nature. 502 (7470), 232-236 (2013).
  7. Bender, J. G., et al. Phenotypic analysis and characterization of CD34+ cells from normal human bone marrow, cord blood, peripheral blood, and mobilized peripheral blood from patients undergoing autologous stem cell transplantation. Clinical Immunology and Immunopathology. 70 (1), 10-18 (1994).
  8. Fritsch, G., et al. The composition of CD34 subpopulations differs between bone marrow, blood and cord blood. Bone Marrow Transplantation. 17 (2), 169-178 (1996).
  9. Nimgaonkar, M. T., et al. A unique population of CD34+ cells in cord blood. Stem Cells. 13 (2), 158-166 (1995).
  10. Hordyjewska, A., Popiolek, L., Horecka, A. Characteristics of hematopoietic stem cells of umbilical cord blood. Cytotechnology. 67 (3), 387-396 (2015).
  11. Bapat, A., et al. Myeloid Disease Mutations of Splicing Factor SRSF2 Cause G2-M Arrest and Skewed Differentiation of Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells. Stem Cells. 36, 1-13 (2018).
  12. Yip, B. H., et al. The U2AF1S34F mutation induces lineage-specific splicing alterations in myelodysplastic syndromes. Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2206-2221 (2017).
  13. Yoo, E. S., et al. Myeloid differentiation of human cord blood CD34+ cells during ex vivo expansion using thrombopoietin, flt3-ligand and/or granulocyte-colony stimulating factor. British Journal of Haematology. 105 (4), 1034-1040 (1999).
  14. Hao, Q. L., Smogorzewska, E. M., Barsky, L. W., Crooks, G. M. In vitro identification of single CD34+CD38- cells with both lymphoid and myeloid potential. Blood. 91 (11), 4145-4151 (1998).
  15. Moretta, F., et al. The generation of human innate lymphoid cells is influenced by the source of hematopoietic stem cells and by the use of G-CSF. European Journal of Immunology. 46 (5), 1271-1278 (2016).
  16. Sanz, E., et al. Ordering human CD34+CD10-CD19+ pre/pro-B-cell and CD19- common lymphoid progenitor stages in two pro-B-cell development pathways. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5925-5930 (2010).
  17. Egeland, T., et al. Myeloid differentiation of purified CD34+ cells after stimulation with recombinant human granulocyte-monocyte colony-stimulating factor (CSF), granulocyte-CSF, and interleukin-3. Blood. 78 (12), 3192-3199 (1991).
  18. Ogawa, M. Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells. Blood. 81 (11), 2844-2853 (1993).
  19. Perdomo, J., Yan, F., Leung, H. H. L., Chong, B. H. Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells. Journal of Visualized Experiments. (130), e56420(2017).
  20. Palii, C. G., Pasha, R., Brand, M. Lentiviral-mediated knockdown during ex vivo erythropoiesis of human hematopoietic stem cells. Journal of Visualized Experiments. (53), e2813(2011).
  21. Davies, C., et al. Silencing of ASXL1 impairs the granulomonocytic lineage potential of human CD34(+) progenitor cells. British Journal of Haematology. 160 (6), 842-850 (2013).
  22. Caceres, G., et al. TP53 suppression promotes erythropoiesis in del(5q) MDS, suggesting a targeted therapeutic strategy in lenalidomide-resistant patients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16127-16132 (2013).
  23. Shi, H., et al. ASXL1 plays an important role in erythropoiesis. Scientific Reports. 6, 28789(2016).
  24. Mazumdar, C., et al. Leukemia-Associated Cohesin Mutants Dominantly Enforce Stem Cell Programs and Impair Human Hematopoietic Progenitor Differentiation. Cell Stem Cell. 17 (6), 675-688 (2015).
  25. Chung, K. Y., et al. Enforced expression of an Flt3 internal tandem duplication in human CD34+ cells confers properties of self-renewal and enhanced erythropoiesis. Blood. 105 (1), 77-84 (2005).
  26. Ambrosini, P., et al. IL-1beta inhibits ILC3 while favoring NK-cell maturation of umbilical cord blood CD34(+) precursors. European Journal of Immunology. 45 (7), 2061-2071 (2015).
  27. Batard, P., et al. TGF-(beta)1 maintains hematopoietic immaturity by a reversible negative control of cell cycle and induces CD34 antigen up-modulation. Journal of Cell Science. 113, Pt 3 383-390 (2000).
  28. Huang, N., Lou, M., Liu, H., Avila, C., Ma, Y. Identification of a potent small molecule capable of regulating polyploidization, megakaryocyte maturation, and platelet production. Journal of Hematology & Oncology. 9 (1), 136(2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

CD34MACS
פאן-מיאלואיד הבידול של האדם כבל דם נגזר CD34+ המטפאות גזע ותאים מחולל
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.