הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

גן ישיר לנקוש-החוצה של חוט השדרה בתאי גזע עצביים באמצעות אלקטרופורציה של CAS9 חלבון-gRNA מכלולי

7.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59850

⸱

9 ביולי 2019

 ,  ,  ,  , 
1School of Life Sciences, South China Normal University, 2The Research Institute of Molecular Pathology (IMP), Vienna Biocenter (VBC), 3Institute for Brain Research and Rehabilitation (IBRR), South China Normal University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

הציג כאן הוא פרוטוקול לבצע זמן, שטח הגן מוגבל להוריד במיתרי השדרה על ידי הזרקת CAS9-gRNA מורכבות לתוך התעלה המרכזית חוט השדרה ואחריו electroporation.

תקציר

האקסון יש את היכולת הייחודית להתחדש באופן מלא בחוט השדרה שלה. זה בעיקר בשל התאים הependymal שנותרו כמו תאי גזע עצביים (NSCs) ברחבי החיים, אשר מתרבים לרפורמה הצינור ependymal ולהבדיל לתוך הנוירונים איבד לאחר פגיעה בחוט השדרה. פענוח כיצד NSCs אלה לשמור על העוצמה לאחר הפיתוח ומתרבים על הפגיעה בחוט השדרה לרפורמה מבנה טרום פציעה המדויק יכול לספק תובנה רבת ערך לגבי האופן שבו מיתרי השדרה יכול להתחדש כמו גם אפשרויות טיפול פוטנציאליות. ביצוע המנקוש גנים בקבוצות מערכות מסוימות של NSCs בתוך פרק זמן מוגבל יאפשר לימוד של מנגנונים מולקולריים מאחורי אלה תהליכי רגנרציה, מבלי להיות מבולבל על ידי פיתוח perturbing אפקטים. מתוארים כאן היא שיטה לבצע גנים מעלף בחוט השדרה NSCs באמצעות מערכת CRISPR-Cas9. על ידי הזרקת את קומפלקס CAS9-gRNA לתוך התעלה המרכזית חוט השדרה ואחריו electroporation, היעד גנים הם הפילו בתוך NSCs באזורים ספציפיים של חוט השדרה בנקודת זמן רצויה, המאפשר מחקרים מולקולריים של חוט השדרה NSCs במהלך תחדשות.

מבוא

חוט השדרה של רוב החוליות אינו מסוגל להתחדש בעקבות פציעה, המוביל נכות קבע. מספר מסלמנדרות, כגון האקאוסול, הם חריגים בולטים. האקסון יכול להתחדש באופן מלא בחוט השדרה זהה מבחינה מבנית ותפקוד שחזור לחלוטין חוט השדרה. הרבה יכולת ההתחדשות של חוט השדרה האקאולית היא בשל תאים ependymal. תאים אלה קו התעלה המרכזית, ובניגוד לאלה יונקים, התאים axoependymal l להישאר כתאי גזע עצביים (NSCs) לאחר ההתפתחות העובריים. לאחר פגיעה בחוט השדרה (למשל, מ קטיעה זנב), אלה NSCs מתרבים לגדול מחדש את צינור ependymal ולהבדיל להחליף נוירונים אבודים1,2,3. חשיפת כיצד axoNSCs חוט השדרה להישאר pluripotent ולהיות מופעל לאחר הפציעה יכול לספק מידע חשוב על פיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות עבור חולים אנושיים.

בשל ההתקדמות ב-crispr-Cas9 gene הטכניקה, ביצוע טוק-אאוט כדי לפענח את הפונקציה גנטית הפכה קלה יותר, הוכח כי יש ישימות רחבה במינים שונים, כולל axo ls4,5, מיכל בן 6 , מיכל סבן , 8. המהדורה האחרונה של הגנום axoלגמרי למלא וטראנסקריפט כעת מאפשר לכל מקום גנומית להיות ממוקד ולהעריך טוב יותר את ההשפעות מחוץ ליעד9,10,11,12 , מיכל בן 13 , 14. ממוטב הפרוטוקולים פותחו עבור לנקוש-out ו-in ב axoCas9 ls באמצעות CRISPR-מערכת15. משלוח של מכונות CRISPR-Cas9 בצורה של חלבון CAS9-gRNA ribonuאופאנפרוטאין (RNP) הוכח להיות יעיל יותר מאשר באמצעות Cas9 ו-gRNA-קידוד פלמידים4. זה סביר בגלל RNP להיות קטן יותר בגודל של וקטורים פלביניים, היכולת שלה ליצור הפסקות DNA מיד, והגנה על gRNA מ-RNA השפלה. בנוסף, באמצעות שימוש עוקף RNPs ותרגום; כך, הוא מונע בעיות כגון כוח היזם ושימוש אופטימלי השימוש כאשר אלמנטים פלביניים נגזרים ממינים שונים.

מחקרים באובדן התפקוד הם אחת הגישות הכלליות לחקירת פונקציות פוטנציאליות של גנים מעניינים. על מנת ללמוד פונקציה גנטית במהלך התחדשות, נוק אאוט צריך להתבצע באופן אידיאלי רק לפני פגיעה כדי למנוע השפעות על פיתוח. בנוסף, הדפיקה החוצה צריכה להיות מוגבלת הן לNSCs והן לאזור ההתחדשות. להפיל את הגן היעד של כל NSCs (כולל אלה במוח, שהוא המקרה במערכות מערכות לloxp), עשוי לייצר אפקטים לא קשור התחדשות שיכול לבלבל את הפרשנות של תוצאות. למרבה המזל, המבנה של חוט השדרה axol מספק הזדמנות ייחודית לזמן ומקום מוגבל לנקוש ב NSCs. רוב חוט השדרה NSCs במגע עם התעלה המרכזית ומהווים את הרוב המכריע של התאים במגע עם תעלת המרכזית16,17. לכן, זריקה של קומפלקס CAS9-grna לתוך התעלה המרכזית, ואחריו electroporation, מאפשר מסירה NSCs חוט השדרה באזור הרצוי בשעה מסוימת4,18,19. פרוטוקול זה מדגים כיצד זה מבוצע, המוביל לתוך חדירה מאוד החוצה בחוט השדרה NSCs. הניתוח שלאחר מכן מבוצעים כדי ללמוד את ההשפעות על התחדשות ועל התנהגות המועצה לבטחון לאומי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ניסויים בבעלי חיים חייבים להתבצע בהתאם לתקנות מקומיות ולאומיות בנושא ניסויים בבעלי חיים ובאישור לוח הסקירה המוסדי הרלוונטי.

1. הכנת התמהיל CAS9-gRNA RNP

  1. עיצוב וסינתזה של gRNAs.
    הערה: עיין בפרסומים אחרים לעיצוב וסינתזה של grnas, כולל אחד באופן בלעדי על axofor15,20,21,22.
  2. השג CAS9-NLS חלבון על ידי הכנת הבית או לרכוש אותו באופן מסחרי.
  3. להכין CAS9-gRNA לערבב על ידי ערבוב 5 μg של CAS9-NLS חלבון, 4 μg של gRNA, 0.9 μL של 10x CAS9 מאגר, ולמלא את עוצמת הקול ל 10 μL עם nuclease-H חינם2O. aliquot את התערובת ואת החנות ב-80 ° צ' אם לא נעשה שימוש מיידי.

2. הכנת לוחות מעלה לאלקטרופורציה

  1. הכינו 200 mL של 2% (wt/vol) פתרון ב 1x DPBS. מתמוסס על ידי חימום הפתרון במיקרוגל ויוצקים אותו על 10 ס מ מנות פטרי לעומק של כ 10 מ"מ (עמוק מספיק כדי לכסות את החיה כולה).
  2. הניחו ללוחות להחזק בטמפרטורת החדר. חנות צלחות ב -4 ° c אם לא בשימוש מיידי.
  3. שימוש באזמל כירורגי, לחתוך את הצלחת agarose לעשות סדק להחזקת הזנב ישר, טוב להתאמת הגוף של בעל החיים, ושתי בארות נוספות עבור הצבת אלקטרודות (איור 1E).
  4. מניחים את הצלחת על הקרח וממלאים אותו עד הסוף עם קרח קר 1x DPBS. השתמש באותו פתרון DPBS להכנת צלחות כדי להבטיח conductibility חשמלי עקבי בהגדרת.

3. קביעת התצורה של האלקטרופורקטור

  1. קבע את תצורת האלקטרופוראטור. הגדר את הדופק צפיה להכיל פולס דו קוטבית אחד של 70 V, עם משך של 5 אלפיות השנייה, מרווח של 50 ms, ואין ריקבון מתח. להגדיר את הדופק העברה יש ארבעה פולסים דו קוטבית של 40 V, עם משך של 50 ms, מרווח של 999 ms, ו 10% ניוון מתח.
  2. חבר את האלקטרודות לאלקטרופורטור והתאם את הפינצטה להיות בהפרש של 7 מ"מ. השקיעו את האלקטרודות בגביע של DPBS לפני ובין האלקטרופורציה.

4. הכנת וטעינת נימי זכוכית מיקרוהזרקה

  1. לבצע מבחן הרמפה על פולר בוער/חום מיקרופיפטה לפי הוראות היצרן כדי לקבוע את ערך החום.
  2. משוך נימים הזרקה עם קצוות מחודדות באמצעות הפרמטרים הבאים: חום = ערך הבדיקה השיפוע, משוך = 100, מהירות = 100, זמן = 100.
  3. . הביטו במחט מתחת לstereomicroscope באמצעות מלקחיים עדינים, לשבור את הנימים בזווית כך שיש לו טיפ משופע. לשבור בעמדה שבה הוא רזה מספיק כדי למקד את התעלה המרכזית, תוך היותו חזק מספיק כדי לחדור את העור.
    הערה: הנקודה בה הקוטר הוא בערך 20 יקרומטר או כ-50% מקוטר חוט השדרה הוא נקודת התחלה טובה. ייתכן שיהיה צורך בנסיונות מרובים כדי לקבל שבירת אופטימלית.
  4. הוסף פתרון מהיר ירוק FCF לתמהיל RNP ביחס של 1:30 וטען על 5 μL של תערובת הזרקה לתוך נימי עם טיפ מיקרוטוען מיקרו.
  5. הר הקפילר על המשאבה הפניאומטית, כשקצהו הנטוי פונה כלפי מטה.

5. קביעת התצורה של המשאבה הפניאומטית

  1. הגדר את המשאבה הפניאומטית. הגדר את החסימה כדי 0.5 פאונד לאינץ ' מרובע (psi), להוציא כדי 2 psi להחזיק, ואת משך מגודרת.
  2. מבחן קפיטים ופנאומטי הגדרות משאבה ידי לטבול את הנימים לתוך טיפת מים לחיצה על דוושת הרגל כדי להזריק. ודא שערבוב ההזרקה יוצא בזרם איטי אך יציב.
  3. להתאים את הלחץ להחזיק אם ערבוב ההזרקה להתחיל דולף באופן ספונטני או מים הוא נשאב את הנימים. להגדיל את הלחץ הפליטה או לשבור יותר של נימי אם תערובת ההזרקה יוצאת לאט מדי. הפחת את הלחץ הפליטה אם הזריקה יוצאת מהר מדי.

6. הזרקת RNP לתוך חוט השדרה

  1. בשנת 0.03% הפתרון בנזוקיין במשך 10 דקות לפחות. בדוק כי בעלי החיים אינם מגיבים על ידי היפוך אותם הפוך במים.
  2. להרים בעל חיים עם מלקחיים הטבעת ולהניח אותו על מיטה של סיליקון, עם הצד השמאלי של החיה הפונה כלפי מעלה הזנב מצביע לכיוון ימין. הצב את אתר ההזרקה באמצע שדה התצוגה של הstereomicroscope (איור 1א).
  3. כוונן את המיקרומניפולציה כך שהנימי יגיע ב-60 ° מצדו הימני של שדה התצוגה (איור 1ב).
  4. זהה את חוט השדרה ואת התעלה המרכזית (איור 1ג).
    הערה: חוט השדרה הוא מבנה צינורי מעל notochord.
  5. כיוון לתעלה המרכזית, הזז את הקפילר קדימה כדי לחדור בעדינות את העור ואת השריר לתוך התעלה המרכזית של חוט השדרה. הגבילו את תנועת הקפילר לצעדים קטנים, כאשר חוט השדרה נמצא ממש מתחת לשרירי הזנב.
  6. לחץ והחזק את דוושת הרגל כדי להזריק את התערובת לתוך התעלה המרכזית. שים לב אם המיקס RNP מתפשט לאורך התעלה המרכזית כשורה כחולה בשני הכיוונים, אשר מראה כי הקפילר ממוקם כראוי (איור 1ד).
  7. אם זה לא קורה, להשאיר את דוושת הרגל לחוץ תוך הזזת נימי קצת פנימה והחוצה עד המיקס RNP מתחיל ללכת. אם הנימים הופך סתומים על ידי רקמה, לנקות אותו על ידי הוצאת לתוך מים על לחצים גבוהים.
  8. כוונן את הלחץ הפליטה כך שיהיה מספיק כדי לגרום למיקס ה-RNP להתפשט בתעלה המרכזית, אך לא עד כדי כך שהוא יפוצץ את המבנה.
  9. המשך להחזיק את הדוושה ברגל כך ערבוב ההזרקה מתפשט לאורך התעלה המרכזית, עד שהוא מגיע הטרמינל שלפוחית בסוף חוט השדרה והחדרים במוח.
    הערה: הדבר עשוי להימשך עד 2 דקות בהתאם לגודל החיה. ייתכן שיהיה צורך להגביר את הלחץ לאחר זמן מה כדי לגרום לערבוב RNP להיכנס לחללי המוח.
  10. המשך בהקדם האפשרי לאלקטרופורציה לאחר הזרקה מוצלחת.

7. אלקטרופורציה

  1. להעביר את בעל החיים עם מלקחיים הטבעת על הצלחת המוכן מראש אלקטרופורציה (איור 1E) על הקרח. מניחים את הזנב בתוך החריץ כך שהוא דחוקה על ידי agarose (איור 1F).
  2. מניחים את האלקטרודות לתוך הבארות משני צידי הזנב. ודא כי כל החיות והאלקטרודות מכוסות על-ידי PBS קר קרח.
  3. לחץ על מתג הרגל כדי להתחיל את האלקטרופורציה.
  4. לאחר השלמת האלקטרופורציה, החזר את החיה למים.
  5. המשך להזריק בעלי חיים נוספים אם יש צורך בכך.
  6. בדוק כי בעלי החיים electroporated הם בריאים לאחר ההרדמה מתפוגג וכי אין נזק שנגרם לזנב.

8. הערכת יעילות להוריד

  1. . תקן את הזנב של החיה האלקטרו-מלאכותית לעשות צולבות סעיפים של הזנב ואחריו מכתים אימונוהיסטוכימיה כדי להעריך את היעילות של הנוק אאוט ברמת החלבון.
    הערה: אם יש לבצע כריתת זנב לאחר האלקטרופורציה, ניתן להשתמש בזנב החתוך למטרה זו. בעלי חיים החשמליים עם gRNAs נגד Gfp או Tyrosinase, למשל, יכול לשמש כפקד שלילי4.
  2. לחילופין, חוט השדרה האלקטרו-מגנטי יכול להיות מחולץ ומיועד לבדיקת דנ א. בצע את ה-PCR בעקבות הערכת הרצף של Sanger או רצף הדור הבא כדי להעריך את אחוזי הסדר הגנטי הערוך15.
    הערה: יעילות העריכה המתקבלת תפחית את יעילות העריכה בפועל עבור NSCs, בשל הכללה של תאים שאינם אלקטרופורביים ונוירונים שחוסר הקשר האפיפיורי אל המרכז המרכזי ולכן לא יקבל את המיקס RNP.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הזרקה ואלקטרופורציה של קומפלקס CAS9-gRNA נגד Sox2 לתוך התעלה המרכזית לחוט השדרה המרכזי הוביל לאובדן מסיבי של Sox2 immunoreactivity ברוב של השדרה NSCs חוט, עם Grna נגד Tyrosinase (tyr) כפקד (איור 2 A). B3-טובולין (ויטראז ' עם TUJ1) הוא סמן לנוירונים ולא התבטא ב NSCs, ו SOX2-TUJ1-תאים סביב התעלה המרכזית נחשבו תאים מחסה SOX2 מחיקות. הקוונפיקציה הראה Sox2 החוצה במספר משמעותי של NSCs על-ידי CAS9-Sox2-grna אלקטרופורציה (איור...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרוטוקול המתואר מאפשר הזמן והשטח הגן מוגבלת לנקוש ב NSCs בחוט השדרה axol. הפרוטוקול הנוכחי מאפשר פילוח ספציפי של NSCs בזמן מוגדר מיקום עם החדירה גבוה. היא מונעת השפעות בלתי רצויות פוטנציאלי שמקורם הגן לנקוש ב NSCs באזורים אחרים כגון המוח המתרחשים בעת שימוש במערכת היצור-LoxP. זה גם מונע השפעות התפתחותיות שמקורם מתמשך החוצה, המאפשר לימוד של תפקוד הגנים התמקדו התחדשות. בנוסף, פרוטוקול זה יכול להתבצע בעלי חיים מסוג פראי, הימנעות זמן ההמתנה הארוך הדרוש כדי לייצר axo, המקביל הטרנסגניים, אשר נדרש עבור מערכת היצור-LoxP. הוא גם ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אינם מצהירים על ניגודי אינטרסים.

תודות

אנו מודים לפרופסור אלי מ. טנקה על תמיכתה המתמשכת וארוכת הטווח. עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית המדע הטבעי של סין (NSFC) מענק (317716), מחקר החל מענקים מאוניברסיטת דרום סין נורמלי (S82111 ו 8S0109), ו הקרן המדע הפוסט דוקטורט של סין (2018M633067).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אגרוזסיגמא-אולדריץ'A9539
בנזוקאיןסיגמא-אולדריץ'E1501-100 גרם
בנזוקאין 0.03% (משקל/נפח)מערבבים 500 מ"ל של 10& פעמים; TBS, 500 מ"ל של 400% (משקל/נפח) Holtfreter' תמיסת S ו-30 מ"ל של תמיסת מלאי בנזוקאין של 10% (Wt/Vol). מלאו את עוצמת הקול עד 10 ליטר ב-dH2O. ניתן לאחסן את התמיסה בטמפרטורת החדר עד 6 חודשים.
בנזוקאין 10% (משקל/נפח)מערבבים 50 גרם בנזוקאין ב-500 מ"ל של 100% אתנול (נפח/נפח). ניתן לאחסן את התמיסה בטמפרטורת החדר עד 12 חודשים.
נימי זכוכית בורוסיליקט 1.2 מ"מ OD, 0.94 מ"מ תעודת זהותמכשיר גמגום BF120-94-8
CaCl2· 2H2OMerck102382
CAS9 buffer, 10xמערבבים 200 מ"מ HEPES ו-1.5 מ"מ KCl במים נטולי RNase. התאם את ה-pH ל-7.5. לסנן לעקר, לעקר ולאחסן ב & מינוס; 20 מעלות; C עד 24 חודשים
חלבון CAS9-NLS   PNA BioCP03
כלי תרבית תאים, 10 ס"מFalcon351029
Dumont #5 - מלקחיים עדיניםמכשירים מדעיים משובחים11254-20
אלקטרופורטורNepa Gene NEPA21
BEXCUY21EDIT II
מהיר ירוק FCFSigma-AldrichF7252-5G
תמיסת FCF ירוקה מהירה, 5xלהמיס 12.5 מ"ג של אבקת FCF ירוקה מהירה ב 10 מ"ל של 1 פעמים; PBS.
חולץ מיקרופיפטה בוער / חום מכשיר גמגום P-97
הולטפרטר פתרון S 400% (משקל/נפח) ממיסים 11.125 גרם של MgSO4· 7H2O, 5.36 גרם CaCl2· 2H2O, 158.4 גרם NaCl ו-2.875 גרם KCl ב-10 ליטר של dH2O. ניתן לאחסן את התמיסה בטמפרטורת החדר עד 6 חודשים.
KClMerck104936
MgSO4· 7H2OMerck105886
Microloader קצות פיפטהEppendorf5242956003
Micromanipulator נארישיגהMN-153 
NaClMerck106404
Pneumatic PicoPumpWorld Precision Instruments SYS-PV830
מלקחיים טבעתייםמכשירים מדעיים משובחים11103-09
סטריאומיקרוסקופאולימפוסSZX10 
Tris baseSigma-AldrichT6066
Tris-buffered מי מלח, 10xממיסים 24.2 גרם של בסיס Tris ו-90 גרם NaCl ב-990 מ"ל של dH2O. התאימו את ה-pH ל-8.0 על ידי הוספת 10 מ"ל של 37% (נפח/נפח) הידרוכלוריד. ניתן לאחסן את התמיסה בטמפרטורת החדר עד 6 חודשים.
פינצטה עם פער משתנה 2 אלקטרודת פלטינה עגולה, קוטר 10 מ"מNepa Gene 
מחולל דופק CUY650P10

מקורות

  1. O'Hara, C. M., Egar, M. W., Chernoff, E. A. G. Reorganization of the ependyma during axolotl spinal cord regeneration: Changes in intermediate filament and fibronectin expression. Developmental Dynamics. 193 (2), 103-115 (1992).
  2. Mchedlishvili, L., Mazurov, V., Tanaka, E. M. Reconstitution of the Central Nervous System During Salamander Tail Regeneration from the Implanted Neurospheres. Plant, Soil and Environment. 916 (8), 197-202 (2012).
  3. Nordlander, R. H., Singer, M. The role of ependyma in regeneration of the spinal cord in the urodele amphibian tail. Journal of Comparative Neurology. 180 (2), 349-373 (1978).
  4. Fei, J. F., et al. Tissue- and time-directed electroporation of CAS9 protein–gRNA complexes in vivo yields efficient multigene knock-out for studying gene function in regeneration. npj Regenerative Medicine. 1 (1), 16002(2016).
  5. Fei, J. F., et al. CRISPR-mediated genomic deletion of Sox2 in the axolotl shows a requirement in spinal cord neural stem cell amplification during tail regeneration. Stem Cell Reports. 3 (3), 444-459 (2014).
  6. Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease. Development. 141 (10), Cambridge, England. 2165-2171 (2014).
  7. Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration. eLife. 6, (2017).
  8. Fei, J. -F., et al. Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 201706855. , (2017).
  9. Nowoshilow, S., et al. The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators. Nature. 554 (7690), 50-55 (2018).
  10. Bryant, D. M., et al. A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors. Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).
  11. Smith, J. J., et al. A chromosome-scale assembly of the axolotl genome. Genome Research. 373548, (2019).
  12. Smith, J. J., et al. Sal-Site: Integrating new and existing ambystomatid salamander research and informational resources. BMC Genomics. 6, 1-6 (2005).
  13. Campbell, L. J., et al. et al Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration. Developmental Dynamics. 240 (7), 1826-1840 (2011).
  14. Stewart, R., et al. Comparative RNA-seq Analysis in the Unsequenced Axolotl: The Oncogene Burst Highlights Early Gene Expression in. the Blastema. PLoS Computational Biology. 9 (3), (2013).
  15. Fei, J. -F., et al. Application and optimization of CRISPR–Cas9-mediated genome engineering in axolotl (Ambystoma mexicanum). Nature Protocols. 13 (12), 2908-2943 (2018).
  16. Holder, N., et al. Continuous growth of the motor system in the axolotl. Journal of Comparative Neurology. 303 (4), 534-550 (1991).
  17. Tazaki, A., Tanaka, E. M., Fei, J. F. Salamander spinal cord regeneration: The ultimate positive control in vertebrate spinal cord regeneration. Developmental Biology. 432 (1), 63-71 (2017).
  18. Albors, A. R., Tanaka, E. M. High-Efficiency Electroporation of the Spinal Cord in Larval Axolotl. Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. 1290, 115-125 (2015).
  19. Albors, A. R., et al. et al Planar cell polarity-mediated induction of neural stem cell expansion during axolotl spinal cord regeneration. eLife. 4, 1-29 (2015).
  20. Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  21. Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
  22. Graham, D. B., Root, D. E. Resources for the design of CRISPR gene editing experiments. Genome Biology. 16 (1), 260(2015).
  23. Khattak, S., et al. Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination. Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

CRISPR-Cas9קומפלקס Cas9-gRNAהזרקה לתעלה המרכזיתניתוח אימונוהיסטוכימיPCR לגנוטיפינגריצוף סנגר
גן ישיר לנקוש-החוצה של חוט השדרה בתאי גזע עצביים באמצעות אלקטרופורציה של CAS9 חלבון-gRNA מכלולי
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.