הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

היווצרות של חניכיים האדם ברצועה הספרואידים תא על סרטים Chitosan

5.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59855

⸱

19 ביוני 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Periodontology, School & Hospital of Stomatology, Tongji University, Shanghai Engineering Research Center of Tooth Restoration and Regeneration, 2Department of Periodontology, Dental Diseases Prevention & Treatment Center of Jiading District, 3College of Materials Science and Engineering, Tongji University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים של culturing ברצועה חניכיים האדם (PDL) תא spheroids על ידי סרטים chitosan. תרבות של הספרואידים תלת ממדיים (3D) הסלולר מספק אלטרנטיבה של מערכת התרבות הקונבנציונלית פוליסטירן מרקמת רקמה (TCPS).

תקציר

ברצועה חניכיים (PDL) תאים להחזיק הבטחה גדולה להתחדשות רקמת חניכיים. באופן מקובל, תאים PDL הם מתורבתים על דו מימדי (2D) מצעים כגון פוליסטירן מעור הרקמה (TCPS). עם זאת, שינויים אופייניים של תאים PDL נצפו במהלך תרבות מבחנה. תופעה זו היא כנראה משום שהדו הדו שונה ממיקרו-vivo תלת-מימדי (3D). בהשוואה לתאים בעלי מצעים דו-ממדיים, תאים שגדלו בתצוגה מיקרוסביבתית תלת-ממדית דומים יותר לתאים vivo. לכן, מודלים של תרבית תאים תלת-ממדיים מספקים חלופה מבטיחה לתרבות התאים הקונבנציונלית של 2D מונאולייר. כדי לשפר את המסורת המקובלת של התרבות התאית, פיתחנו לאחרונה שיטת התרבות התא 3D, אשר מבוססת על היווצרות ספרואיד של תאים PDL על סרטים chitosan. כאן, אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים של התרבות התאית המבוססת על סרטים chitosan. מערכת התרבות התלת-ממדית של PDL תאית הסלולר להתגבר על חלק מן המגבלות הקשורות תרבות התאים 2D קונבנציונאלי מונאולייר, ובכך עשוי להיות מתאים להפקת תאים PDL עם יעילות טיפולית משופרת עבור התחדשות רקמות העתיד חניכיים.

מבוא

חניכיים, מאותחל בעיקר על ידי רובד דנטלי1, מאופיין בנזק של רקמות חניכיים כולל ברצועה חניכיים (PDL), מכתשיים העצם, ו המלט. הטיפולים הנוכחיים עבור חניכיים מצליחים בדרך כלל במניעת ההתקדמות של המחלה הפעילה, אבל התחדשות של רקמות חניכיים איבד נשאר אתגר קליני. לאחרונה, התקדמות חשובה נעשתה בגישות מבוססות תא עבור התחדשות רקמות חניכיים כדי להתגבר על החסרונות של הטיפולים הנוכחיים2,3,4.

סקירה שיטתית הקודם שלנו חשף כי תאים PDL הראה פוטנציאל גדול התחדשות חניכיים5. באופן מקובל, תאים PDL הם מתורבתים על דו מימדי (2D) מצעים כגון פוליסטירן מעור הרקמה (TCPS). עם זאת, שינויים אופייניים של תאים PDL נצפו במהלך תרבות מבחנה6. תופעה זו היא ככל הנראה משום TCPS 2D שונה מן תלת מימדי (3D) מיקרוסביבה7. בהשוואה לתאים המתורבתות ב-2D מצעים, תאים הגדלים בתצוגה מיקרוסביבה 3D דומה יותר לתאים vivo8. לכן, מודלים של תרבית תאים תלת-ממדיים מספקים חלופה מבטיחה לתרבות התאים הקונבנציונלית של 2D מונאולייר.

שיטת התרבות התלת-ממדית המקובלת היא encapsulating תאים באמצעות ביואריאלס תלת-ממדיים. לעומת תאים שעברו אנקפסולציה ב ביואריאלס 3d, spheroids הסלולר לחקות את המצב vivo באופן הדוק יותר מכיוון spheroids הם אגרגטים של תאים הגדלים ללא חומרים זרים9,10,11, 12. מדווחים כי מכשירי הסלולר הסלולריים קידמו את הפעילות הביויוטית באמצעות שימור הרכיבים המתכלים (ecm), כולל פינבאקטין ולמינציה ב-13. כדי לשפר את המסורת המקובלת של התרבות התאית, פיתחנו לאחרונה שיטת התרבות של תא PDL 3D, אשר מבוססת על היווצרות ספרואיד של תאים PDL על chitosan סרטים14. היווצרות ספרואיד הגדילה את התחדשות עצמית ויכולות הבידול אוסטגניים של תאים PDL14. כאן, אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים של התרבות PDL מפורט ספרואיד מבוסס על סרטים chitosan. מערכת התרבות התלת-ממדית של PDL תאית הסלולר להתגבר על כמה חסרונות הקשורים בתרבות התא TCPS ובכך עשוי להיות מתאים להפקת תאים PDL עם יעילות טיפולית משופרת להתחדשות רקמת חניכיים עתידיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פרוטוקול המחקר אושר על ידי ועדת האתיקה של בית הספר ובית החולים לרפואת שיניים, אוניברסיטת טונגג'י. כל המטופלים סיפקו הסכמה מושכלת בכתב.

1. בידוד תא PDL

  1. להפוך בינונית התפשטות עבור התרבות של תאים PDL: α-הגברת מדיום שיושלם עם 10% FCS ו 100 U/mL עט/דלקת.
  2. הכן מכולה עם קרח כדי להעביר טוחנות שלישי מבודדים.
  3. לעקר כלי ניתוח באמצעות החיטוי.
  4. לחלץ מטוחנות שלישי השפיעו על האדם הרגיל ממבוגרים (18-28 שנים של גיל) במרפאת השיניים של בית הספר ובית החולים לרפואת שיניים, אוניברסיטת טונגג'י.
  5. מניחים את הטוחנות השלישי לתוך המדיום ההתפשטות ומעבירים למעבדה ב -4 ° c.
  6. מניחים את השן מחולץ בצלחת פטרי 100 מ"מ סטרילי, עובד בתוך מכסה הזרם הביולוגי למינארי.
  7. הוסף 10 מ ל של PBS לשטוף את השן מחולץ. חזור על צעד הכביסה פעמיים.
  8. באמצעות אזמל סטרילי, הפרד בעדינות את ה-PDL מהשורש.
    הערה: PDL צריך להיות מגורד מהחלק השלישי האמצעי של השורש כדי למנוע זהום של חניכיים או רקמות פסגה.
  9. האוהב PDL לתוך 1-2-mm שברי בעזרת להב אזמל מעוקר.
  10. מניחים שברי PDL ב T-25 בקבוקון תרבות, מלא 3-4 mL של בינוני התפשטות.
  11. תרבות הדגימות בחממה ב-37 ° c ב-5% CO2 עם מחולל אוויר.
  12. לשנות את בינונית התרבות לאחר הצמיחה של תאים PDL נצפתה. זה בדרך כלל לוקח 1-2 שבועות עבור מוצלח של תאים PDL. לראות את הצמיחה של תאים PDL באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות השלב ההופכי.
  13. שנה את מדיום התרבות פעמיים בשבוע לאחר מכן.
  14. כאשר תאים PDL הגיעו למפגש, תאי תת תרבות ביחס של 1:4 (מעבר 1).
  15. צפו בצמיחת התאים מדי יום ושינו את מדיום התרבות פעמיים בשבוע.
  16. בצע כל מעבר הבא ביחס של 1:4 לאחר התאים להשיג 80% המפגש. השתמש השלישי לדור החמישי של תאים PDL עבור זריעת תאים.

2. הכנת סרטים chitosan

  1. לקראת הכנת 1% (v/v) חומצה אצטית הפתרון, להוסיף 5 מ ל של חומצה אצטית 495 mL של מים כפולים מזוקקים בגביע זכוכית נקייה.
  2. לקראת הכנת 1% w/v chitosan הפתרון, שוקל 5 גרם של אבקת chitosan (משקל מולקולרי ממוצע 400 kDa, 85% מידה של מרחלציה) ולהוסיף 495 mL של 1% (v/v) חומצה אצטית תמיסה.
  3. מערבבים את הפתרון המוכן 24 שעות עם בר ערבוב ולוחית ערבוב מגנטית ב 60 ° c.
  4. אוטוקלב את הפתרון המוכן כדי להבטיח פירוק מוחלט של chitosan.
    הערה: ניתן להשהות את הניסוי בשלב זה.
  5. כדי ליצור סרטים chitosan, להוסיף 1% w/v פתרון chitosan לתוך הרקמה התרבותית הרקמות (TCPS) מנות ב 0.25 mL/cm2. לדוגמה, להוסיף 0.5 mL של 1% w/v chitosan פתרון אחד טוב של 24-טוב צלחת.
  6. מנות TCPS יבשים בתנור ב-60 ° c למשך 24 שעות כדי ליצור סרטים chitosan.
  7. הכינו 0.5 N נתרן הידרוקסיד (NaOH). מערבבים 10 גרם של NaOH, קצת בזמן, לתוך נפח גדול של מים כפולים מזוקקים באמצעות מעורר מגנטי בר, ולאחר מכן לדלל את הפתרון לעשות 0.5 L.
    הערה: הוספת NaOH אל המים--לא להוסיף מים NaOH מוצק. לא לגעת NaOH! . זה יכול לגרום לכוויות כימיות
  8. לנטרל chitosan סרטים עם 0.5 N NaOH. הוסף 0.5 mL של 0.5 N NaOH פתרון אחד טוב של הצלחת 24-באר עבור 2 שעות.
  9. רוחצים סרטים chitosan שלוש פעמים עם מים כפולים מזוקקים.
    הערה: ניתן להשהות את הניסוי בשלב זה.
  10. לפני זריעת תאים, לחטא את הצלחות chitosan מצופה 24-לחות ב-70% אלכוהול לילה בטמפרטורת החדר.
  11. שטפו צלחות מצופות chitosan שלוש פעמים עם PBS בטמפרטורת החדר.
  12. לחטא צלחות chitosan מצופה על ידי טיפול תחת אור אולטרה סגול לילה בטמפרטורת החדר.

3. זריעת תאים

  1. פתרון PBS בינוני מחמם לפני ההפצה וטריפסין/EDTA ל37 ° c.
  2. להיפטר סופרנטאנט מתוך בקבוקון תרבות התא T-75.
  3. רוחצים תאים PDL שוטפת עם 10 מ ל של פתרון PBS.
  4. מחק את פתרון ה-PBS.
  5. הוסף 1 מ ל של טריפסין/EDTA פתרון T-75 בקבוקון תרבות התא.
  6. מודחלת תאים עם טריפסין/EDTA פתרון עבור 3 דקות ב 37 ° c.
  7. לסיים את תהליך העיכול של טריפסין על ידי הוספת 3 מ ל של הפצת בינוני T-75 בקבוקון תרבות התא.
  8. העבר את השעיית התא המוכן לשפופרת צנטריפוגה בעלת 15 מ"ל.
  9. צנטריפוגה את ההשעיה עבור 5 דקות ב 300 x g וטמפרטורת החדר.
  10. להיפטר supernatant מ 15 mL צנטריפוגה שפופרת ו להשעות מחדש את הגלולה התא ב 500 μL של התפשטות בינונית.
  11. ספירת תאים PDL עם הומוציטומטר.
  12. זרע PDL תאים בצפיפות של 0.5 x 104, 1 x 104, 3 x 104, ו 6 x 104 תאים/cm2.
  13. תרבות PDL תאים על סרטים chitosan בחממה ב 37 ° c ב 5% CO2 עם מחולל אוויר.
  14. שנה את מדיום התרבות פעמיים בשבוע לאחר מכן.
  15. בימים 1, 2, 3, 4, ו -5, בדוק את מורפולוגיה התא מדי יום באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות השלב ההופכי.

4. הישרדות תאים

  1. לאחר 1, 3, ו 6 ימים של תרבות, לקבוע את ההישרדות של תאים באמצעות ערכת הכדאיות המסחרית/הרעלת ציטובית.
  2. בצינור 15 מ ל, להכין 2 מ ל של פתרון טרי של 2 מ"מ calcein-AM ו 4 מ"מ הומודיום ההומודימר ב-PBS על ידי vortexing עבור 5 s.
    הערה: שמור את התהליך בחושך.
  3. להסיר את המדיום תרבות ולשטוף spheroids ב-PBS.
  4. מסגרות הספרות של ה-PBS המכילות 2 מ"מ calcein-AM ו 4 מילימטר אתידיום הומודימר עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
  5. שטוף את הרורואידים פעמיים ב-PBS. עבור הספרואידים מבאר אחת של 24-באר, השתמש 2 מ ל של PBS עבור כל פעם.
  6. צפו בדגימות באמצעות מיקרוסקופ של זריחה באמצעות הגדלה של 10x או 20x.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

שימוש בפרוטוקול הנוכחי, מזהי תאים PDL הקיימים בהצלחה נוצרו. איור 1 הראה כי תאים מושעה או spheroids במקום תאים מחוברים נצפו בעיקר על סרטים chitosan. עבור צפיפות הזריעה של 0.5 x 104 תאים/ס"מ2, תאים pdl מצורפים נמצאו מדי פעם ביום 1 ו-3, ו-pdl החוליות של התא לא נצפו לעתים רחוקות. להיפך, עבור צפיפות הזריעה של 3 x 104 ו-6 x 104 תאים/cm2, גדלים שונים של תאים PDL spheroids נמצאו מאז יום 1. PDL תא ספרואיד היווצרות...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

המחקר הנוכחי הציג מערכת התרבות תא תלת-ממד כדי להתגבר על מספר מגבלות הקשורות לתרבות התא 2D קונבנציונאלי מונאולייר. על פי הפרוטוקול, מזהי הסלולר PDL נוצרו בהצלחה על ידי תאי culturing על סרטים chitosan. המחקר הקודם שלנו דיווח כי היווצרות ספרואיד הגדילה את התחדשות עצמית ויכולות הבידול אוסטגניים של תאים PDL14. במקום להשתמש באנזים כדי לקצור תאים מ TCPS משתמשים בתאי משתמש PDL ניתן לקצור מסרטים chitosan על ידי פשוט ללטף את המדיום כמה פעמים14. כך ניתן לשמור היטב על הצמתים של ECM ושל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

מחקר זה היה בחסות הלאומי המדע הטבעי הקרן של סין (NSFC 81700978), קרנות המחקר היסודי עבור האוניברסיטאות המרכזיות (1504219050), הקרן המדע הטבעי של שנגחאי (17ZR1432800), ושנגחאי פרויקט חיפושי רפואי ( 17411972600).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
α-MEMGibco11900-073
חומצה אצטית Sigma-Aldrich64197
בקבוק תרבית תאים 25 ס"מ2430639
תרבית תאים קורנינג 75 ס"מ2קורנינג430641
צ'יטוזןהפה רפואי  Chitosan GmbH/משקל מולקולרי 500 kDa, דרגת דה-אצטילציה 85%
FCSGibco26140-079
ערכת כדאיות חיה/מתה/ציטוטוקסיותמולקולרית  בדיקותL3224
NaOHסיגמא-אולדריץ'1310732
PBSKeyGen Biotech 
KGB5001 עט/סטרפטוקוסGibco15140-122
טריפסין/EDTA KeyGen ביוטק 
KGM25200 צינור צנטריפוגה חרוטי 15 מ"לקורנינג430790
צלחת 24 בארותקורנינג3524
בקבוק

מקורות

  1. Albandar, J. M. Epidemiology and risk factors of periodontal diseases. Dental Clinics of North America. 49 (3), 517-532 (2005).
  2. Bartold, P. M., McCulloch, C. A., Narayanan, A. S., Pitaru, S. Tissue engineering: a new paradigm for periodontal regeneration based on molecular and cell biology. Periodontology 2000. 24, 253-269 (2000).
  3. Chen, F. M., Jin, Y. Periodontal tissue engineering and regeneration: current approaches and expanding opportunities. Tissue Engineering Part B Review. 16 (2), 219-255 (2010).
  4. Yu, N., et al. Enhanced periodontal tissue regeneration by periodontal cell implantation. Journal of Clinical Periodontology. 40 (7), 698-706 (2013).
  5. Yan, X. Z., Yang, F., Jansen, J. A., de Vries, R. B., van den Beucken, J. J. Cell-Based Approaches in Periodontal Regeneration: A Systematic Review and Meta-Analysis of Periodontal Defect Models in Animal Experimental Work. Tissue Engineering Part B Review. 21 (5), 411-426 (2015).
  6. Itaya, T., et al. Characteristic changes of periodontal ligament-derived cells during passage. Journal of Periodontal Research. 44 (4), 425-433 (2009).
  7. Zhang, J., Li, B., Wang, J. H. The role of engineered tendon matrix in the stemness of tendon stem cells in vitro and the promotion of tendon-like tissue formation in vivo. Biomaterials. 32 (29), 6972-6981 (2011).
  8. Elliott, N. T., Yuan, F. A review of three-dimensional in vitro tissue models for drug discovery and transport studies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (1), 59-74 (2011).
  9. Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
  10. Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities. Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).
  11. Yeh, Y. C., et al. Cardiac repair with injectable cell sheet fragments of human amniotic fluid stem cells in an immune-suppressed rat model. Biomaterials. 31 (25), 6444-6453 (2010).
  12. Kabiri, M., et al. 3D mesenchymal stem/stromal cell osteogenesis and autocrine signalling. Biochemical and Biophysical Research Communications. 419 (2), 142-147 (2012).
  13. Lee, J. H., Han, Y. S., Lee, S. H. Long-Duration Three-Dimensional Spheroid Culture Promotes Angiogenic. Activities of Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells. Biomolecules & therapeutics. 24 (3), 260-267 (2016).
  14. Yan, X. Z., van den Beucken, J., Yuan, C., Jansen, J. A., Yang, F. Spheroid formation and stemness preservation of human periodontal ligament cells on chitosan films. Oral Diseases. 24 (6), 1083-1092 (2018).
  15. Meli, L., Jordan, E. T., Clark, D. S., Linhardt, R. J., Dordick, J. S. Influence of a three-dimensional, microarray environment on human Cell culture in drug screening systems. Biomaterials. , (2012).
  16. LaRue, K. E., Khalil, M., Freyer, J. P. Microenvironmental regulation of proliferation in multicellular spheroids is mediated through differential expression of cyclin-dependent kinase inhibitors. Cancer Research. 64 (5), 1621-1631 (2004).
  17. Tsai, A. C., Liu, Y., Yuan, X., Ma, T. Compaction, fusion, and functional activation of three-dimensional human mesenchymal stem cell aggregate. Tissue Engineering Part A. 21 (9-10), 1705-1719 (2015).
  18. Cesarz, Z., Tamama, K. Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 9176357(2016).
  19. Tong, J. Z., Sarrazin, S., Cassio, D., Gauthier, F., Alvarez, F. Application of spheroid culture to human hepatocytes and maintenance of their differentiation. Biology of the Cell. 81 (1), 77-81 (1994).
  20. Lee, W. Y., et al. The use of injectable spherically symmetric cell aggregates self-assembled in a thermo-responsive hydrogel for enhanced cell transplantation. Biomaterials. 30 (29), 5505-5513 (2009).
  21. Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Engineering Part C Methods. 16 (4), 735-749 (2010).
  22. Wang, W., et al. 3D spheroid culture system on micropatterned substrates for improved differentiation efficiency of multipotent mesenchymal stem cells. Biomaterials. 30 (14), 2705-2715 (2009).
  23. Miyagawa, Y., et al. A microfabricated scaffold induces the spheroid formation of human bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells and promotes efficient adipogenic differentiation. Tissue Engineering Part A. 17 (3-4), 513-521 (2011).
  24. Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (31), 13724-13729 (2010).
  25. Baraniak, P. R., McDevitt, T. C. Scaffold-free culture of mesenchymal stem cell spheroids in suspension preserves multilineage potential. Cell and Tissue Research. 347 (3), 701-711 (2012).
  26. Rabea, E. I., Badawy, M. E., Stevens, C. V., Smagghe, G., Steurbaut, W. Chitosan as antimicrobial agent: applications and mode of action. Biomacromolecules. 4 (6), 1457-1465 (2003).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

תאי רסן השןיצירת ספרואידיםתרבית תאים תלת-ממדיתצפיפות זריעת תאיםמצע פרוליפרציהTrypsin EDTAמיקרוסקופיה בניגודיות פאזהמבחן חיותהתמיינות אוסטאוגנית
היווצרות של חניכיים האדם ברצועה הספרואידים תא על סרטים Chitosan
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.