מאמר שיטה

בעלות נמוכה ניתוח הילוך עבור פנוטיפים התנהגותיים של מודלים של עכבר של מחלות נוירוסקולריות

DOI:

10.3791/59878

⸱

18 ביולי 2019

 ,  ,  , 
1Department of Neurology, Duke University School of Medicine, 2Duke Center for Neurodegeneration & Neurotherapeutics, Duke University School of Medicine, 3Biomedical Sciences Graduate Program, University of California San Diego, 4Department of Neurobiology, Duke University School of Medicine, 5Department of Cell Biology, Duke University School of Medicine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתוח טביעת רגל הוא חלופה בעלות נמוכה לניתוח הילוך ההילוך הדיגיטלי עבור החוקרים הפרעות בתנועה של עכברים. בשל המהירות שלה, פשטות, ופוטנציאל האורך, הוא אידיאלי עבור פנוטיפים התנהגותיים של מודלים של העכבר.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מדידת תנועה בעלי חיים היא כלי התנהגותי נפוץ המשמש לתיאור הפנוטיפ של מחלה נתונה, פציעה, או מודל התרופה. שיטת בעלות נמוכה של ניתוח הילוך הפגינו כאן הוא מדד פשוט אך יעיל של הפרעות הליכה במודלים murine. עקבות מנותח על ידי ציור כפות הרגליים של העכבר עם צבע הכביסה שאינם רעילים ומאפשר את הנושא ללכת דרך מנהרה על גיליון נייר. העיצוב של מנהרת הבדיקה מנצל את התנהגותו של העכבר הטבעי ואת הזיקה שלהם למקומות קטנים ואפלים. אורך פסיעה, רוחב פסיעה, והתפשטות הבוהן של כל עכבר נמדד בקלות באמצעות סרגל ועיפרון. זוהי שיטה מבוססת היטב ואמינה, ומפיקה מספר מדדים האנלוגיים למערכות דיגיטליות. גישה זו היא רגישה מספיק כדי לזהות שינויים בצעד מוקדם במצגת פנוטיפ, ובגלל הגישה הלא פולשנית שלה, זה מאפשר בדיקה של קבוצות על פני החיים או מצגת פנוטיפים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תנועה דורש תאום נוירולוגי מורכבים והשלד ושריר, ו ליקויים בהיבט אחד של מסלולים מוטוריים יכול לייצר הפרעות הליכה הנצפה1,2. ניתוח הילוך הוא כלי קריטי עבור החוקרים בדיקת מודלים של העכבר משום שהוא מספק נתונים התנהגותיים לכימות על איך מחלה נתונה, פציעה, או השפעות התרופה של התנועה של בעל חיים3. עם זאת, ניתוח הילוך דיגיטלי דורש רכישה של הליכון, מצלמה, ותוכנה משויכת, אשר יכול להיות יקר באופן גמיש עבור חוקרים. ניתוח הילוך משמש לעתים קרובות לסירוגין לעקוב אחר שינויים האורך בתפקוד המנוע, ולכן זה עשוי להיות קשה להצדיק את ההוצאה אם בדרך כלל בשימוש4. למרות שניתוחים סרוקים עשויים לספק מדדים הילוך מפורט יותר מאשר ניתוח טביעת רגל פשוטה, אלה אמצעים מורכבים יותר אינם תמיד נחוצים או רלוונטיים לאפיון של פנוטיפ התנהגותית5.

כאן אנו מציגים שיטה בעלות נמוכה לניתוח טביעת רגל ידנית כחלופה מהירה ורגישה לתוכניות ניתוח הילוך דיגיטלי6,7. ניתוח טביעת רגל ידנית הוכיחה לזהות הבדלים הילוך משמעותי בהמון של מחלת מורטין דגמי4,7,8,9,10,11 ,12,13,14,15,16,17, ובמקרה אחד לפחות, שיטה זו בעלות נמוכה זיהתה שינויים בהילוך ש לא אותרו על-ידי תוכנית ניתוח הילוך דיגיטלי משותף12. העלות הכוללת של החומרים הוא נומינלי, והוא יכול להיות מותאם בקלות מודלים אחרים מחקר מכרסם.

בעוד יש הרבה מדדי הילוך שונים מהם ניתן לצייר נתונים, השיטה שאנו מתארים מתמקד בשלושה מדדים ספציפיים: אורך פסיעה, רוחב פסיעה (הידוע "מסלול רוחב"), והבוהן להתפשט. חשוב לציין כי הפרמטרים שיש להעריך צריך להיקבע על בסיס דגם לפי-מודל. שיטה זו של ניתוח הילוך אינו מיועד למדוד פונקציה קוגניטיבית, ולא מומלץ למחקרים הדורשים מדידות ביו-מכניקה מורכבים של הליכה16.

אנו מציגים נתונים התנהגותיים מתוך קבוצה של מודלים לפני ואחרי-סימפטומטי מידול השדרה מקושרים X ו בולבר ניוון שרירים (SBMA), מחלה נוירו-מולקולרית המאופיינת הניוון מוטוריים נוירונים וניוון שרירים. עכברים אלה לפתח בהילוך הדרגתי הילוך כי חופפים עם התחלתה של פנוטיפים אחרים ספציפיים למחלות. זה מדגים את החוקיות ואת הספציפיות של שיטה זו, ומאשרת כי הוא יכול להפלות באופן אמין בין בעלי חיים מושפעים ולא מושפעים.

העכברים ניסיוני במחקר זה היו 2.5 (טרום סימפטומטי) ו 9-חודש (לאחר סימפטומטי) העכברים BAC fxAR121 טרנסגניים על C57BL/6 רקע (nexpt= 12). מודל זה נוצר במעבדה שלנו ומאופיין במלואו כמודל עכבר רב עוצמה של SBMA9. מבני-ממשל לא-טרנסגניים שימשו כפקדים (nctrl= 8). SBMA היא מחלה מוגבלת מין אשר מתבטא לחלוטין אצל זכרים בלבד, כך עכברים זכרים שימשו בלעדית עבור מחקר זה. במהלך התכנון, על החוקרים לקחת בחשבון את השיקולים הלאומיים של הבריאות של המין כמשתנה ביולוגי כדי לקבוע את גודל הקבוצה ואת הקומפוזיציה18.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל בדיקות שנערכו עם עכברים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של אוניברסיטת דיוק. האדם האחראי על בדיקות והבקיע חייב להיות עיוור למצב גנוטיפ בעלי חיים או מצבו הניסיוני עד ניתוח הילוך והבקיע של ניירות הושלמה עבור הקבוצה כולה.

1. בדיקת הכנת חומרים

  1. התנהלות בדיקות עם מנהרה שנבנתה מ 3 לחתוך מראש לוחות אקרילי ברור כי הם 0.375 אינצ'ים עובי. להרכיב מנהרה על ידי הדבקת לוחות יחד עם איטום הקשורים במיוחד אקריליק ולא פולט ריחות כאשר יבשים.
    1. עבור C57BL/6 עכברים סטנדרטיים, השתמש במידות המנהרה הבאות: 2.5 בתוך. רחב, 3 בתוך. גבוה, ו -13 בתוך. עכברים חייבים להיות מסוגלים בנוחות ללכת דרך המנהרה ולקחת מספיק צעדים (> 4) כך הליכה ניתן למדוד.
  2. לבנות את תא המטרה עם מראש לחתוך לוחות אקריליק אפור 0.375 אינצ'ים עבה, מודבק יחד עם איטום זהה כמו בשימוש על המנהרה. המדידות הפנימיות של החדר הן 4 ב. רחב, 4 ב. ארוך, ו 3 ב. גבוה. התאם את פתיחת חדר זה לפתיחת המנהרה (2.5 בתוך. רחב x 3.0 ב. גבוה). בגלל העכברים באופן טבעי מעדיפים חללים כהים כדי חללים מוארים היטב, להשתמש בחומר אטום וחשוך בצבע.
  3. השתמש בנייר למעקב אחר שלבים עבים וחלקים (נייר בצבעי מים פועל היטב). גזור רצועות מסמכים בודדים כדי להיות מעט יותר ארוך יותר מאשר רוחב ואורך של המנהרה. אם השימוש במידות המנהרה המתוארת כאן, גזור את הדפים ל-15 בתוך 3.5.
  4. השתמש בשני צבעים מנוגדים (לדוגמה, ירוק וסגול) של צבע שאינו רעיל המבוסס על מים רחיץ. הקצה צבע אחד לגפיים אחוריות, השני עבור forelimbs. עכברים ללקק את הצבע שנותר מרגליהם לאחר בדיקה, כך הצבע שנבחר חייב להיות לגמרי לא רעיל.
  5. השתמש בשני מכחולים חבית עגולים, אחד עבור כל צבע צביעה (~ 0.5 ס מ בקוטר, מחודדות/הצביע קצה מברשת).
  6. בחר סרגל עם סימונים למטה למילימטרים, ו קליבר עם המידות עד 0.1 מ"מ. עיפרון מומלץ לכתוב על הניירות הבקיע.
  7. אופציונלי: לבעלי חיים בעלי חרדה גבוהה או מוטיבציה נמוכה, מספקים תמריץ התנהגותי בתא המטרה. זה יכול לכלול כמויות קטנות של זרעי חמניות מעוקר (ממוקם בכלוב הבית 2 ימים לפני בדיקות כדי לאפשר הרגלה). ביום של בדיקות, מניחים זרעי חמניות בתוך תא המטרה כדי לעודד עכברים ללכת דרך בלי לעצור.

2. איסוף נתונים

  1. אם בדיקה מבוצעת בחדר נפרד, התאקלם את העכברים לחדר החדש 30 דקות ולאחר מכן להתחיל את הספר התנהגותי. בנוסף, כי עכברים הם ליליים באופן טבעי, להבטיח את כל העכברים הם התעורר לגמרי והתראה לפחות 5 דקות לפני הבדיקה.
  2. הכן את כיוונון הבדיקה על-ידי מיקום המנהרה מעל הנייר וסימון הנייר עם מזהה העכבר ותאריך הבדיקה. הצב את תא המטרה בקצה המנהרה, תוך חיבור שני הקצוות הפתוחים. הוסיפו זרעי חמניות בקצה המנהרה (בתוך תא המטרה) למוטיבציה במידת הצורך.
  3. להסיר את העכבר כדי להיבדק מהכלוב שלו לאחוז אותו בחוזקה על ידי האחיזה שלה, והקפד לאחוז את הזנב כדי לייצב את התנועה של הגפיים האחוריות שלה.
  4. צבעו את כפות הרגליים כך שכל החלק התחתון של כל הבהונות ומרכז כף הרגל יהיו מכוסים לגמרי בצבע. חזור על זה עם צבע מנוגד של צבע על כפות רגליו האחוריות. לנגב כל צבע כי העכבר מקבל על חלקים אחרים של הגוף שלו עם בד לח נקי כדי למנוע כתמים שעלולים להפריע איסוף נתונים.
    הערה: הטיפול בעכבר חייב להתבצע על ידי חוקרים מנוסים כדי למזער את הלחץ בעלי חיים.
  5. למקם את העכבר בתחילת המנהרה ולאפשר לו ללכת כל הדרך אל חדר המטרה, ולאחר מכן לאחזר את העכבר, בעדינות לנגב את רגליו עם בד לחה מים, ולהחזיר אותו לכלוב הבית שלו.
  6. אפשר לנייר עם עקבות להתייבש במלואו לפני הבקיע. נגב את אזור הבדיקה ואת המנהרה עם אתנול או פתרון ניקוי שווה ערך בין כל חיה.

3. קריטריוני הניקוד

  1. השתמש בצעדים שמרווחים בעקביות עם טביעות רגליים ברורות ושאינן מוכתם לניקוד. איור 1B הוא דוגמה טובה לרצף של טביעות רגליים שניתן להבקיע. כדי לייצר מספיק נתונים הבקיע, חייב להיות לפחות 2 צעדים רצופים מכל רגל, אבל 4-6 שלבים לכל רגל מומלץ. אין לכלול את העקבות הראשונה והאחרונה על הנייר, כפי שהם לא סביר לייצג הליכה נורמלית כי העכבר משנה את מהירות ההליכה שלה.
  2. השימוש אורך פסיעה, רוחב פסיעה, ואת הבוהן להתפשט כמו שלושה מדדים שונים של הילוך שניתן לנתח באמצעות שיטה זו.
    הערה: אורך הפסיעה והרוחב דורשים הדפסים רציפים ברורים שבהם אזור קדמת כף הרגל מוגדר היטב בצבע. התפשטות הבוהן אינו דורש הדפסים רציפים עבור הבקיע, רק הדפסים ברורים של הבהונות הראשונה והאחרונה על רגל אחת. עם זאת, אם טביעת רגל נתונה אינה כלולה במידות של אורך או רוחב פסיעה, לא ניתן להבקיע אותו עבור התפשטות הבוהן. . כל שלושת האמצעים מוערך בסנטימטרים
    1. הגדר אורך פסיעה כמרחק בין שתי העקבות הרציפים שנוצרו באותה רגל (כלומר, צעד אחד) (איור 1א, 1b).
      1. עם עיפרון, לצייר עיגול 2-4 מ"מ סביב אזור הרגל לפני הרגליים של שתי הרגליים forelimb (מזוהה על ידי צבע מוקצה לעיל) בצעד אחד ולצייר קו ביניהם באמצעות סרגל.
      2. הקלט את המרחק בין שתי הדפסים מאמצע כל מעגל (כלומר, מרכז של כל משטח כף רגל) כימין-לפני 1 (RF1) או משמאל לקידמה 1 (LF1).
      3. חזור על הפעולה עבור כל השלבים שניתן להבקיע (RF2, LF2, RF3, LF3 וכן הלאה).
      4. חזרו לימין והשאירו טביעות רגליים אחוריות.
      5. ממוצע כל מרחק צעד מוקלט בודדים עבור כל איבר. לניתוח סטטיסטי, חברי הקבוצה בודדים יכולים להיות בממוצע יחד.
    2. הגדר רוחב פסיעה כמדד המרחק בין שמאל לימין או הגפיים האחוריות (איור 1א, 1b).
      1. כדי להעריך את המרחק הזה, לצייר ולמדוד קו מן האזור הקיפו רגל הקדמי של אחד הגפיים האחוריות החותך ניצב עם הקו לאורך פסיעה על הגפיים האחוריות שבצלעות.
      2. חזור על פעולה זו עבור כל ההדפסות האחוריות שניתן להבקיע ולאחר מכן הממוצע את המידות. שיטת החישוב עבור רוחב פסיעה זהה עבור הגפיים האחוריות.
    3. הגדר התפשטות הבוהן כמרחק בין האצבע הראשונה והאחרונה על טביעת רגל אחת או הגפיים האחוריות (איור 1א, 1b).
      1. השתמש בקליפרס כדי למדוד את המרחק בין קצה טביעת האצבע הראשונה לבין קצה טביעת האצבע האחרונה.
      2. חזור על כל ההדפסות האחוריות שניתן להבקיע ולמדוד את המידות. שיטת החישוב עבור התפשטות הבוהן היא זהה עבור הגפיים האחוריות.
  3. אם לא ניתן להבקיע את הנייר, הניחו לבעל החיים לנוח 10 דקות לפני שינסו שוב.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עם מספר מספיק של בעלי חיים, הליך זה הוא מסוגל לזהות הבדלים הילוך בין גנוטיפים העכבר, בתוך המתח אותו לאורך זמן. איור 1B מראה עקבות נציגים של תמונות טביעת הרגל שנאספו במעבדה שלנו, באמצעות מודל העכבר של השדרה מקושרים X ו בורגול ניוון שרירים (SBMA), הפרעת ניווניות המשפיעים על מנוע תחתון נוירונים ושריר השלד. בעבר דיווחו כי עכברים הזכר BAC fxAR121 הטרנסגניים לפתח אובדן משקל משמעותי, ליקויים בכוח אחיזה, ואת אורך פסיעה מקוצר בגילאים שלאחר סימפטומטי בהשוואה שולטת שאינם טרנסגניים שולט

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באמצעות שיטת ניתוח הליכה בעלות נמוכה שתוארה לעיל, אנו מראים זיהוי מוצלח של מספר פרמטרים של תפקוד הילוך בגילאים שלאחר סימפטומטי במודל העכבר BAC fxAR121 של SBMA. הקטנת אורך פסיעה עקביים עם לימודי SBMA קודמים של דגמי העכבר וחולי האדם9. אנו גם מראים בפעם הראשונה כי יש הבדלים משמעותיים בבוהן האחוריות הגפיים התפשטות בעכברים SBMA סימפטומטי לעומת שולטת שאינם טרנסגניים בקרי העצם. מעניין, ירידה במריחה על הבוהן האחוריות יכול להיגרם על ידי חולשה בשריר פושט שרירים, התכווצות בשריר כופף כף היד, או אינבציה העצב ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים רוצים להודות בבוקר על סיוע לזיהוי בעלי חיים. עבודה זו היתה נתמכת על ידי מענקים של ארה ב. המכון הלאומי לבריאות (R01 7 RF1 AG057264 A.R.L.S. ו C.J.C. ו R01 NS100023 ל-R. L. S) ו ניוון שרירים האגודה (המענק מחקר בסיסי A.R.L.S., פיתוח מענק C.J.C.).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
קליפרn/an/a חייבבעל סימונים עד 0.1 מ"מ
דבק קראפטE6000n/a
צבע טביעת רגל (צבע טמפרה)Artmindn/aחייב להיות לא רעיל
מברשות צבע עגולות חביתסימפלי, סימונסn/aבקוטר 0.5 ס"מ
סרגלn/an/a חייבלהיות בעל סימונים עד מילימטרים
נייר ניקוד (רפידות בצבעי מים)Cansonn/aחתוך לגודל
מנהרה ותא מטרהפלסטיק בין-מדינתיn/aחתוך לגודל
להיות

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Clarke, K. A., Still, J. Development and consistency of gait in the mouse. Physiology & Behavior. 73 (1-2), 159-164 (2001).
  2. Mendes, C. S., et al. Quantification of gait parameters in freely walking rodents. BMC Biology. 13, 50(2015).
  3. Carter, R. J., Morton, J., Dunnett, S. B. Motor coordination and balance in rodents. Current Protocols in Neuroscience. , Chapter 8 Unit 8 (2001).
  4. Tillerson, J. L., Caudle, W. M., Reveron, M. E., Miller, G. W. Exercise induces behavioral recovery and attenuates neurochemical deficits in rodent models of Parkinson's disease. Neuroscience. 119 (3), 899-911 (2003).
  5. Pallier, P. N., Drew, C. J., Morton, A. J. The detection and measurement of locomotor deficits in a transgenic mouse model of Huntington's disease are task- and protocol-dependent: influence of non-motor factors on locomotor function. Brain Research Bulletin. 78 (6), 347-355 (2009).
  6. Sugimoto, H., Kawakami, K. Low-cost Protocol of Footprint Analysis and Hanging Box Test for Mice Applied the Chronic Restraint Stress. Journal of Visualized Experiments. (143), (2019).
  7. Carter, R. J., et al. Characterization of progressive motor deficits in mice transgenic for the human Huntington's disease mutation. Journal of Neuroscience. 19 (8), 3248-3257 (1999).
  8. Barlow, C., et al. Atm-deficient mice: a paradigm of ataxia telangiectasia. Cell. 86 (1), 159-171 (1996).
  9. Cortes, C. J., et al. Muscle expression of mutant androgen receptor accounts for systemic and motor neuron disease phenotypes in spinal and bulbar muscular atrophy. Neuron. 82 (2), 295-307 (2014).
  10. D'Hooge, R., et al. Neuromotor alterations and cerebellar deficits in aged arylsulfatase A-deficient transgenic mice. Neuroscience Letters. 273 (2), 93-96 (1999).
  11. Fernagut, P. O., Diguet, E., Labattu, B., Tison, F. A simple method to measure stride length as an index of nigrostriatal dysfunction in mice. Journal of Neuroscience Methods. 113 (2), 123-130 (2002).
  12. Guillot, T. S., Asress, S. A., Richardson, J. R., Glass, J. D., Miller, G. W. Treadmill gait analysis does not detect motor deficits in animal models of Parkinson's disease or amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Motor Behavior. 40 (6), 568-577 (2008).
  13. Harper, S. Q., et al. RNA interference improves motor and neuropathological abnormalities in a Huntington's disease mouse model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (16), 5820-5825 (2005).
  14. Lin, C. H., et al. Neurological abnormalities in a knock-in mouse model of Huntington's disease. Human Molecular Genetics. 10 (2), 137-144 (2001).
  15. Sopher, B. L., et al. Androgen receptor YAC transgenic mice recapitulate SBMA motor neuronopathy and implicate VEGF164 in the motor neuron degeneration. Neuron. 41 (5), 687-699 (2004).
  16. Tillerson, J. L., Caudle, W. M., Reveron, M. E., Miller, G. W. Detection of behavioral impairments correlated to neurochemical deficits in mice treated with moderate doses of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine. Experimental Neurology. 178 (1), 80-90 (2002).
  17. Wheeler, V. C., et al. Early phenotypes that presage late-onset neurodegenerative disease allow testing of modifiers in Hdh CAG knock-in mice. Human Molecular Genetics. 11 (6), 633-640 (2002).
  18. Clayton, J. A., Collins, F. S. Policy: NIH to balance sex in cell and animal studies. Nature. 509 (7500), 282-283 (2014).
  19. Maricelli, J. W., Lu, Q. L., Lin, D. C., Rodgers, B. D. Trendelenburg-Like Gait, Instability and Altered Step Patterns in a Mouse Model for Limb Girdle Muscular Dystrophy 2i. PLoS One. 11 (9), e0161984(2016).
  20. Castelhano-Carlos, M. J., Sousa, N., Ohl, F., Baumans, V. Identification methods in newborn C57BL/6 mice: a developmental and behavioural evaluation. Lab Animals. 44 (2), 88-103 (2010).
  21. Lakes, E. H., Allen, K. D. Gait analysis methods for rodent models of arthritic disorders: reviews and recommendations. Osteoarthritis Cartilage. 24 (11), 1837-1849 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים