מאמר שיטה

ניתוח של השומנים שומנים תוכן ביקוע והנצה ליעדים באמצעות עיבוד תמונה אוטומטית

7.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/59889

⸱

17 ביולי 2019

 ,  ,  , 
1Faculty of Science, Charles University

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים יישום MATLAB של זיהוי אוטומטי ותיאור כמותי של טיפות שומנים בתמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטית של ביקוע ותאי שמרים.

תקציר

חילוף החומרים ליפיד והרגולציה שלה הם בעלי עניין הן בסיסיות והן מדעי החיים המוחלים וביוטכנולוגיה. בהקשר זה, מינים שמרים שונים משמשים כמודלים במחקר חילוף חומרים לשומנים או לייצור השומנים התעשייתי. טיפות השומנים הם גופי אחסון דינאמי מאוד והתוכן הסלולרי שלהם מייצג הבדיקה נוח של מצב מטבולית השומנים. מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית היא שיטה של בחירה עבור ניתוח כמותי של טיפות שומנים סלולריים, כפי שהוא מסתמך על ציוד זמין נרחב מאפשר ניתוח של טיפות שומנים בודדים. יתר על כן, ניתוח תמונה מיקרוסקופיים יכול להיות אוטומטי, הגדלת מאוד התפוקה הכוללת הניתוח. כאן, אנו מתארים זרימת עבודה ניסיונית ואנליטית עבור זיהוי אוטומטי ותיאור כמותי של טיפות שומנים בודדות בשלושה מינים שונים של שמרים מודל: ביקוע שיאת הביקוע ו . והשמרים השיכחויות טיפות ליפידים הם דמיינו עם bodipy 493/503, ו תוספי תא-הניאון מתווסף למדיית התרבות כדי לעזור לזהות גבולות התא. תאים חשופים למיקרוסקופיה אפיפלואורסצנטית תלת-ממדית בערוצים ירוקים וכחולים והתמונות של מחסנית z מעובדות באופן אוטומטי על-ידי צינור MATLAB. ההליך פלט נתונים כמותיים עשיר על השומנים הסלולר תוכן droplet ומאפיינים בודדים droplet השומנים בפורמט טבלאי מתאים ניתוח במורד הגיליון האלקטרוני או חבילות סטטיסטיות. אנו מספקים למשל ניתוחים של שומנים בתוכן droplet בתנאים שונים המשפיעים על חילוף החומרים של השומנים הסלולריים.

מבוא

שומנים לשחק תפקידים מהותיים באנרגיה התאית פחמן מטבוליזם, סינתזה של רכיבים ממברנה, וייצור של חומרים אקטיביים. חילוף החומרים ליפיד הוא מכוונן בהתאם לתנאי הסביבה, זמינות מזינים ו-מחזור התא שלב1. בבני אדם, חילוף החומרים ליפיד כבר מחובר למחלות, כגון השמנה, סוכרת סוג II וסרטן2. בתעשייה, שומנים שיוצרו על ידי מיקרואורגניזמים, כגון מיאס, מייצגים מקור מבטיח של דלק דיזל מתחדשת3. תאים מאחסנים שומנים ניטרליים ב שנקרא טיפות שומנים בדם (מקרא). הגופים האבולוצדיים הללו מורכבים מטריליגליליפוספלים, אסטרים של שריר, שריר הפוספוליפיד החיצוני וחלבונים משויכים1. המילד מקורם ברשת האנדופלזמית, מחזור התאים או הצמיחה-שלב התפתחות, והם חשובים עבור הומאוסטזיס שומנים סלולריים1. מספר LD ומורפולוגיה ניתן להשתמש כמו פרוקסי נוח כאשר הדבר מטבוליזם השומנים תחת תנאי צמיחה שונים או בעת הקרנת פאנל של מוטציות. בהתחשב האופי הדינמי שלהם, טכניקות מסוגל לנתח את המאפיינים של האדם היחיד מתעניין מחקרים של מטבוליזם השומנים.

מינים שמרים שונים שימשו לתיאור מסלולים מטבולית הקשורים השומנים ואת הרגולציה שלהם, או בשימוש ביוטכנולוגיה לייצר תרכובות מעניינות או דלקים1. יתר על כן, עבור מודלים של מודל, כגון שמרים לבקוע cerevisiae ס או הקשורים ביקוע הקשורות שמרים שיניים, הגנום-רחב מחיקה הספריות זמינים כי ניתן להשתמש עבור תפוקה גבוהה מסכי4,5. לאחרונה LD קומפוזיציה ודינמיקה תוארו ב -S. ביקוע6,7,8,9, מוטציות הקשורות חילוף החומרים השומנים כבר מבודדים במודל המתעוררים שמרים . כן.

טכניקות רבות זמינות כדי ללמוד תוכן LD ודינמיקה. רוב להעסיק סוג כלשהו של כתמים של המכונה עם ליפופילית צבעים כגון הנילוס אדום או BODIPY 493/503. האחרון מראה עירור צר יותר ספקטרום פליטה, ו מוגברת ספציפיות לעבר שומנים ניטרליים (המכונה) לעומת פוספוליפידים (ממברנות)11. פלואורימטריה וזרימה-cytometry שיטות שימשו בהצלחה מינים פטרייתיים שונים כדי לחשוף גנים ותנאי גדילה המשפיעים על אחסון השומנים תוכן12,13,14,15. בעוד ששיטות אלה מתאימות יישומים בעלי תפוקה גבוהה, הם אינם יכולים למדוד את המספרים ואת המבנה של התעודות הזהות הבודדות בתאים, אשר יכולים להיות שונים באופן דרמטי בין תנאי גדילה לבין גנוטיפים. פיזור ראמאן קוהרנטי או מיקרוסקופ הולוגרפי דיגיטלי הן שיטות ללא תווית המפיקות נתונים ברמת LD, אך דורשות ציוד יקר מיוחד16,17,18. מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית, מצד שני, יכול לספק נתונים מפורטים על תוכן LD, תוך שימוש נפוץ מכשירים וניתוח תמונה כלי התוכנה. קיימות מספר זרימות עבודה של ניתוח התכונות דרגות שונות של תחכום ואוטומציה בזיהוי תא/LD מנתוני תמונה, והם ממוטבים עבור סוגי תאים שונים, כגון תאים מטזובן עם מזהה גדול19,20 , , עשריםושבעה. חלק מגישות אלה פועלות רק ב-2D (לדוגמה, בתמונות הקרנה מרביות), שעשויות להיכשל באופן מהימן בתיאור התוכן התאי של ה-LD. לידיעתך, לא קיימים כלים לקביעת תוכן LD ומורפולוגיה מנתונים מיקרוסקופיים שמרים ביקוע. פיתוח של ניתוח ברמת LD אוטומטי וחסון יביא רגישות מוגברת ועוצמה סטטיסטית משופרת, ולספק מידע עשיר על תוכן ניטרלי השומנים, באופן אידיאלי במינים שמרים מרובים.

פיתחנו זרימת עבודה עבור ניתוח תוכן LD מתוך 3D תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטית של תאים שמרים. תאים חיים מוכתמים עם BODIPY 493/503 ו דטרן כחול מדורגת כדי להמחיש התעודות ולקבוע גבולות התא, בהתאמה. תאים הם מקיבוע על שקופיות זכוכית נתון הדמיה z-מחסנית באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצלי סטנדרטי. התמונות מעובדות לאחר מכן על-ידי צינור אוטומטי מיושם ב-MATLAB, חבילה נפוצה (מסחרית) עבור ניתוחים סטטיסטיים. הצינור מבצע עיבוד מקדים של תמונה, פילוח (תאים לעומת רקע, הסרת תאים מתים) ו-LD זיהוי. נתונים עשירים ברמת LD, כגון גודל LD ועוצמת קרינה, מסופקים לאחר מכן בתבנית טבלאית התואמת לכלי תוכנה מרכזיים בגיליון אלקטרוני. זרימת העבודה שימש בהצלחה כדי לקבוע את ההשפעה של זמינות מקור חנקן על חילוף החומרים לשומנים ב -S. ביקוע24. כעת אנו מדגימים את הפונקציונליות של זרימת העבודה ב -s. ביקוע, s. הפקוניקוס ו -s. cerevisiae ס, באמצעות תנאי צמיחה או מוטציות המשפיעות על תוכן LD סלולרי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת פתרונות ומדיה

  1. הכינו פתרון להשומנים.
    1. כדי להכין מלאי השומנים מכתים פתרון התמוססות 10 מ ג של BODIPY 493/503 ב 10 מ ל של הידרואז DMSO (ריכוז סופי 1 מ"ג/mL). מתמוסס את התוכן כולו של 10 מ"ג BODIPY 493/503 בקבוקון כדי למנוע אובדן של חומר במהלך שקילה.
      זהירות: . DMSO יכול לעבור דרך העור תלבש ציוד הגנה אישי מתאים.
    2. להכין עבודה שומנים בצביעת פתרון על ידי ערבוב 100 μL של 1 mg/mL BODIPY 493/503 מניות פתרון ו900 μL של המים DMSO (הריכוז הסופי 0.1 mg/mL).
    3. הורדה של פתרונות המניה והעבודה, והחנות ב-20 ° c.
      הערה: מומס BODIPY 493/503 יציב במשך מספר שנים ב-20 ° c. עם זאת, הפתרון צריך להיות מוגן מפני לחות ואור.
  2. כדי להכין את הפתרון מניות עבור הדמיית גבולות התא, לפזר 25 מ ג של כחול מדורגת תוספי (מבחנה שלמה) ב 2.5 mL של מים מאוהים (ריכוז סופי 10 מ"ג/mL). מחלקים את פתרון המניה ואת החנות ב-20 ° c מוגן מפני אור.
  3. כדי להכין שקופית מיקרוסקופ פתרון ציפוי, לפזר 5 מ ג של סויה לקטין ב 5 מ ל של מים מאוהים (ריכוז סופי 1 מ"ג/mL). מחלקים את פתרון הליטין והחנות ב-80 ° c.
    הערה: פתרון הקטין יציב למשך מספר שנים ב-80 ° c. ניתן לאחסן כרגע בשימוש ב-20 ° c.
  4. הכינו מדיית טיפוח.
    1. כדי להכין 400 mL של מורכבות מדיום טיפוח YES עבור s. ביקוע ו- s. פקוניקוס, לפזר 2 גרם של שמרים לחלץ ו 0.1 g של תוספי הSP (אם נדרש עבור מוטציות auxotrophic) ב 340 ml של מים מיוהים בקבוק 500 mL וחיטוי. הוסף 60 mL של 20% (w/v) של הגלוקוז בנפרד או מסנן-מעוקר סוכר בתנאים אספטי.
    2. כדי להכין 400 mL של הגדרת מדיום הטיפוח EMM עבור s. ביקוע ו- s. פקוניקוס, התמוססות 4.9 g של ציר EMM ללא דקסטרוז ב 360 ml של מים מיוהים בבקבוקון 500 mL והחיטוי. הוסף 40 mL של 20% (w/v) של הגלוקוז בנפרד או מסנן-מעוקר סוכר בתנאים אספטי.
      הערה: להנחיות כלליות ב- s. ביקוע ו- s. הטיפוח-תרגול לראות25 ו-26, בהתאמה.
    3. כדי להכין 300 mL של מורכבות הטיפוח YPAD מורכבים עבור סכביפיסים cerevisiae ס, לפזר 3 גרם של תמצית שמרים, 6 גרם של peptone ו 30 מ ג של אדנוטין סולפט ב 270 מ ל של מים מיווים בבקבוקון 500 mL וחיטוי. הוסף 30 מ ל של 20% (w/v) של הגלוקוז בנפרד או סינון-מעוקר בתנאים אספטי.
    4. כדי להכין 300 mL של בינוני מינימלי מוגדר עבור S. cerevisiae, התמוססות 2 גרם של בסיס חנקן שמרים (ללא חומצות אמינו) ב 270 מ ל של מים מפוהים בבקבוקון 500 mL ו החיטוי. הוסף 30 מ ל של 20% (w/v) של הגלוקוז בנפרד או סינון-מעוקר בתנאים אספטי.
      הערה: להנחיות כלליות בנושא הטיפוח-תרגול של ס. צ. מראה27.

2. טיפוח התאים

  1. גידול של בנות או s. יפנית לשלב מעריכי או מוקדם נייח.
    1. בבוקר, איחסן 5 מ ל של YES בינונית עם ביומסה טרי שמרים ביקוע. מודטה ב 32 ° צ' עם טלטול (180 rpm) במשך כמה שעות.
      הערה: עבור כל הזנים, השתמש מבחנות Erlenmeyer אייר שיש פי 10 נפח של התרבות כדי להבטיח aeration הנכון. מעבדות מסוימות מעדיפות לגדול ב -30 ° c, אבל טמפרטורת הטיפוח של 32 ° c תוצאות בזמני ההכפלה קצרים יותר ללא תופעות מזיקות לתאים, ובכך מפחיתה את הזמן הכולל הנדרש לביצוע ניסוי25,28 .
    2. בשעות אחר הצהריים המאוחרות של אותו היום (לאחר לפחות 6 שעות של טיפוח), לדלל את התרבות עם טרי YES בינונית עד 10 mL נפח התרבות הסופי כך שהוא מגיע הצפיפות האופטית הרצויה (OD) (או מספר תאים/mL) למחרת בבוקר, ו דגירה ב 32 ° צ' עם s המלך (180 rpm). היתרון הוא לדעת את זמן ההכפלה של כל מאמץ משומש כדי לקבוע במדויק את פקטור הדילול (השתמש במשוואה 1).
      figure-protocol-1
      כאשר התרבות v היא אמצעי האחסון לפני התרבות הדרושים לדילול, vהסופי הוא הנפח הכולל של התרבות החדשה (10 מ"ל עבור זנים סטנדרטיים), odהסופי היא הרצויה כדי להגיע ל לאחר בוקר, odהנוכחי הוא המדד הנכון כיום של טרום תרבות, t הוא הזמן של צמיחת התאים עד לקציר, השהיה הוא משך של שלב ההשהיה (תלוי בתנאי מעבדה, צריך ל להיות מוגדר באמצעות האמפירי) ו- tDT הוא זמן ההכפלה של המתח.
      הערה: כאשר התאים בשלב מעריכי יש לנתח, לא נותנים לתרבויות קדם להגיע לשלב הנייח כמו זה משתנה באופן דרמטי פיזיולוגיה התא (כולל תוכן LD) עבור מספר דורות הבאים.
    3. בבוקר יום ההדמיה, אם התרבות הגיעה ממנת יתר גבוהה יותר מהנדרש (במקרה של תאים מעריכי-שלב), לדלל אותו עם כן טרי ולהמשיך הדגירה לפחות שתי פעמים יותר הכפלה לפני הצביעת של המילד. אחרת המשיכו ישירות ל כתמים (סעיף 3).
  2. גידול של ביולוגיה לשלב מעריכי ונייח.
    1. בשעות אחר הצהריים, האיחסן 10 מ ל של מדיום YPAD עם כמות קטנה של ביומסה טרי שמרים מחדש ו דגירה לילה ב 30 ° צ' עם טלטול (180 rpm).
    2. בוקר של יום הדמיה, לדלל את התרבות כדי OD 0.1 ב 10 mL של מדיום YPAD ולצמוח כדי OD הנדרש (למשל, OD 1 עבור שלב מעריכי). בצע כל מדלל תרבות כמתואר בשלב 2.1.2. המשך לצביעת (סעיף 3).

3. שומנים בצביעת Droplet

  1. הכן תגית מכסה למיקרוסקופ עבור כל דוגמה ליצירת תמונה. פזר 1 μL של פתרון ציפוי שקופיות אל מכסה כיסוי נקי באמצעות הצד הארוך של קצה ממוקם אופקית של פיפטה. הרשו לפתרון הציפוי להתייבש לחלוטין ולאחסן את פתקי הכיסוי בסביבה נטולת אבק.
    הערה: ניתן לנקות שקופיות זכוכית וכיסוי לפני השימוש אם יש צורך בכך. תהליך הניקוי כולל כביסה עם ניקוי כלים, שטיפה עם מים, לילה הספוגים 3% חומצה הידרוכלורית, ושטיפת מים מזוקקים. שקופיות נקיות ושמיכות מאוחסנות באתנול טהור עד השימוש.
  2. מדוד את ה-OD של תרבות התא או מספר התאים/mL, כנדרש. נסה להגיע ערכים דומים בין כל הזנים נבדק כדי להבטיח תנאים ניסיוניים דומים.
  3. פיפטה 1 מ ל של כל תרבות תא לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL. עבור S. cerevisiae ס בלבד, להוסיף 5 μl של הפתרון ציפוי שקופיות, מערבולת בקצרה, ו דגירה ב 30 ° צ' עם רעד עבור 5 דקות.
  4. הוסף 1 μL של הפתרון מכתים את השומנים לכל התרבות ומערבולת בקצרה. לאחר מכן להוסיף 10 μL של הפתרון הדמיית גבול התא ומערבולת בקצרה.
    הערה: אין להכין מראש פתרונות מעורבים של שתי הכתמים כמו זה מוביל לקוצ'ינג הקרינה של BODIPY 493/503.
  5. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה (1,000 x g, 3 דקות, RT) ולהסיר כמעט כל supernatant (~ 950 μl). השהה מחדש את התאים בסופרננט הנותר.
  6. פיפטה 2 μL של השעיית התא צפוף על מכסה לקטין מצופה לכסות ומקום על שקופית מיקרוסקופ נקי. . התאים צריכים ליצור מונאולייר המשך למיקרוסקופ (סעיף 4) מהר ככל האפשר כדי למזער את הפריטים בהדמיה; עבד שתי דגימות לכל היותר בכל פעם.

4. התקנת מיקרוסקופ ודימות

  1. מטב את תנאי הדימות.
    הערה:     הגדרת המיקרוסקופ דורשת חשיפות ארוכות למקורות אור חזקים שעלולים לגרום נזק למדגם ולתוצאות ההטיה. לכן, הגדר את תנאי הדימות באמצעות שקופית לדוגמה ייעודית שלא תהיה בשימוש נוסף עבור כימות LD.
    1. התמקד בתאים באמצעות ניגודיות פאזה או ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית (DIC).
      הערה: ניתן לנקוט בחדות פאזה או בתמונות DIC לצורך התייחסות, אך לא נעשה בהם שימוש במהלך שלב ניתוח התמונה האוטומטי.
    2. הגדרת הגדרות מחסנית z כדי להקיף את כל אמצעי האחסון של התא. המרחק האנכי הכולל תלוי בגודל התא; מספר הפרוסות האופטיות תלוי בצמצם המספרי של המטרה (הפונקציה התפשטות נקודה בציר z). הגדר את המוקד כדי לנוע ביחס למישור המוקד המרכזי.
      הערה: מספר הפרוסות האופטימלי מוגדר לעתים קרובות על-ידי תוכנת בקרת המיקרוסקופ ואין צורך לחשב אותה באופן ידני. רוחב התא אופייני הם 3-5 יקרומטר עבור s. ביקוע, 4-7 יקרומטר עבור s. פקוניקוס, ו 3-7 יקרומטר עבור s. cerevisiae ס.
    3. כדי התמונה הדמות, להגדיר את עוצמת האור ואת זמן החשיפה בערוץ ירוק (עירור ופליטה מקסימה של BODIPY הם 493 ו 503 ננומטר, בהתאמה).
      הערה: BODIPY 493/503 הוא fluorochrome בהיר מאוד; עם זאת, זה עשוי להיות לולבן במהירות עם עוצמת אור חזקה מדי. יתר על כן, הד הם ניידים בתאים חיים, ובכך למזער את זמן החשיפה וללכוד את מחסנית הערוץ הירוק המלא הראשון (לפני המעבר לערוץ הכחול) כדי למנוע טשטוש חפצים. כמו כן, קח בחשבון את הטווח הליניארי של המצלמה לעוצמת האות כדי למנוע פיקסלים רוויים.
    4. כדי גבולות תא תמונה, להגדיר את עוצמת האור ואת זמן החשיפה בערוץ הכחול (עירור ופליטה מקסימה תוספי כחול מדורגת הם 400 ו 420 ננומטר, בהתאמה).
      הערה: עוצמת האות בערוץ הכחול נדרשת לפילוח תמונה, אך היא אינה משמשת לכימות זיהוי זהות עצמה. לכן, הגדרות אופטימליות בערוץ זה אינן קריטיות לניתוח.
    5. במידת האפשר, צור זרימת עבודה ניסיונית אוטומטית בתוכנת בקרת המיקרוסקופ כדי להקל על הדמיה של דגימות מרובות תחת תנאים סטנדרטיים.
  2. לאחר שתנאי הדמיה ממוטבים, דגימות תמונה לשימוש עבור כימות. להתמקד בתאים ולדמות אותם בערוצים ירוק וכחול כמתואר בשלב 4.1.
    הערה: יש לרכוש את כל התמונות באמצעות אותן הגדרות כדי לאפשר השוואה בין דגימות. תמונה של שדות מרובים של תצוגה לכל מדגם כדי לקבל נתונים חזקים ומייצגים.
  3. שמור את התמונות הכחולות והירוקות של מחסנית z כגון קבצי TIFF בשכבות של 16 סיביות (כלומר, שני קבצים לכל שדה תצוגה). כלול מילים "ירוק" או "כחול" בשמות הקבצים המתאימים. המשך בניתוח תמונה (סעיף 5).

5. ניתוח תמונה

  1. בדוק חזותית את איכות התמונות שנרכשו.
    1. תמונות מיקרוסקופיים פתוחות ב-imagej29,30 או תוכנות מתאימות אחרות לניתוח תמונה.
    2. הסר ערימות של תמונות המכילות מספר ניכר של תאים שהועברו במהלך הרכישה (ולכן יצרו טשטוש פריטים).
    3. הסר ערימות התמונה המכילה חלקיקי פלורסנט מאוד לא תאים בערוץ הכחול (למשל, לכלוך על שקופית מיקרוסקופ או שובר כיסוי, זיהומים בינוני בטיפוח).
      הערה: אובייקטים בהירים מאוד שאינם תאים בערוץ הכחול עשויים ליצור ממצאים של זיהוי תאים או עלולים להפריע לזיהוי תאים בסביבתם.
    4. הסר ערימות תמונה המכילות חלק גדול של תאים מתים (כלומר, תאים עם זריחה כחולה מוגברת בהשוואה לתאים חיים).
      הערה: בעוד הנוכחות של חלק קטן של תאים מתים במדגם הוא בדרך כלל לא בעיה, תאים אלה נמחקים באופן אוטומטי במהלך הניתוח, כמה תאים מתים או גוססים עלולים להיות מזוהים מדי פעם כתאים חיים על ידי אלגוריתם פילוח ובכך הטות את התוצאות המדווחות.
  2. ניתוח תמונות בתוכנת MATLAB.
    1. צור תיקיה ראשית והעתק את כל קבצי ה-script MATLAB למיקום זה.
    2. צור תיקיית משנה ("פומבה", "cerevisiae" או "יפנית") והעתק קבצי תמונת קלט TIFF למיקום זה.
    3. הפעל את MATLAB, פתח את ה-script MAIN. m והפעל אותו. בתפריט לבחור את מינים שמרים לנתח ולהתחיל עיבוד תמונה.
      הערה: חלק מהפרמטרים הדרושים לאיתור תאים וזיהוי LD מוגדרים מראש עבור המינים הספציפיים, אחרים נקבעים באופן אוטומטי במהלך עיבוד תמונה. הערכים שנקבעו מראש נקבעו באופן אמפירי ותלויים במספר גורמים כגון הגדלה אובייקטיבית, סוג מצלמה ורגישות, והגדרות הדמיה. במקרה הצורך, משתמשים יכולים לערוך את קבצי ה-script כדי לשנות את ההגדרות המסוימות הספציפיות לאורגניזם כדי לשקף טוב יותר את ההתקנה הניסיונית שלהם. במילים אחרות, במהלך זיהוי תאים גדלים מקבילים של אובייקטים מקבלים את הפרמטרים "מיניאזור" ו-"maxArea", והחלק המינימלי של אמצעי האחסון המלא בתוך גבולות האובייקט ניתן על-ידי הפרמטר "אחידות". עבור זיהוי LD, סף הבהירות מוענק על-ידי הפרמטר "th" (הערך שלו מושפע בעיקר מעומק סיביות של התמונה ומעוצמת האות הפלואורסצנטית), וגודל הזיהוי המקסימלי המקובל ניתן על-ידי הפרמטר "MaxArea".
    4. בדוק ועבד את קבצי הפלט כנדרש באמצעות עורך גיליון אלקטרוני או חבילה סטטיסטית; זרימת העבודה מפיקה קבצי CSV מופרדים באמצעות נקודה-פסיק, וקבצי TIFF מקוטעת עם אובייקטי תא שאותרו ומזהה זיהוי.
      הערה: זרימת העבודה מפלחים תמונות לתוך אובייקטים של רקע ותאים, כאשר כל אובייקט תא עשוי להיות מורכב ממספר תאים סמוכים. לפיכך, הפלט בקבצי "xxxx_cells. csv" אינו מייצג נתונים של תא בודד ויש להשתמש בו רק כדי לחשב מדדי אמצעי אחסון לפי-יחידה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ההליך כולו מסוכם באיור 1 עבור ביקוע (זרימת העבודה של שמרים מדומה מקבילה), ומתחת אנו מספקים דוגמאות לאופן שבו ניתן להשתמש בזרימת העבודה כדי ללמוד תוכן LD בשלוש זנים שמרים שונים בתנאים שונים הידועים להשפיע על תוכן LD סלולרי. כל דוגמה מייצגת ניסוי ביולוגי אחד.

figure-results-1
איור 1: דיאגרמה סכמטית של זרימת העבודה הניסיונית והאנליטית. זרימת העבודה ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הבנת חילוף החומרים של השומנים והרגולציה שלה חשובה הן בביולוגיה הבסיסית והן ביישומים הקליניים והביוטכנולוגיים. תוכן LD מייצג בדיקה נוחה של מצב חילוף החומרים של השומנים של התא, עם מיקרוסקופ פלואורסצנטית להיות אחת השיטות העיקריות המשמשות לקביעת תוכן LD. הפרוטוקול המוצג מאפשר זיהוי אוטומטי ותיאור כמותי של הזהות האישית בשלושה זנים שונים ומורפולוגית שמרים ברורים. לידיעתך, לא קיימים כלים. דומים בשביל הביקוע קבצי ה-script הMATLAB הדרושים לעיבוד תמונה נכללים כקבצים משלימים, והם זמינים גם ממאגר המניות (DOI 10.6084/m9. התמונה) יחד ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

. למחברים אין מה לגלות

תודות

עבודה זו נתמכת על ידי אוניברסיטת צ'רלס מענקים פרימוס/MED/26, GAUK 1308217 ו-SVV 260310. אנו מודים Ondřej Šebesta לקבלת עזרה עם מיקרוסקופ ופיתוח של צינור ניתוח תמונה. אנו מודים למעבדת הReGenEx לגבי זנים של מחלת ה-s. cerevisiae ס , והפקנט והירורי ניקי, עבור זנים של היפנים . Ppc1-88 זן סופק על ידי מרכז המשאבים הגנטיים שמרים יפן. המיקרוסקופיה בוצעה במעבדה למיקרוסקופיה ומיקרוסקופית הפלואורסצנטית במימון הקרן האירופית לפיתוח האזור ותקציב המדינה של צ'כיה (פרויקט מס '. CZ. 1.05/4.1.00/16.0347 ו-CZ. 2.16/3.1.00/21515).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מצלמת CCD מונוכרומטית 12 סיביות Hamamatsu ORCA C4742-80-12AGHamamatsu או שווה ערך
מלח אדנין המיסולפט, ≥ 99%MerckA9126-25G 
BODIPY 493/503 (4,4-Difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene)Thermo Fisher ScientificD3922לצביעת שומנים ניטרלית
D-(+) - גלוקוז, ≥ 99.5%MerckG7021 
Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, אניוני, ליזין FixableThermo Fisher ScientificD1976לצביעה שלילית של תאים
דימתיל סולפוקסיד, ≥ טוהר 99.5%MerckD4540ומעלה, שמור נטול מים על מסננות מולקולריות
מרק EMM ללא דקסטרוזניתןלהכין מדיום PMD0405 מדיום גם מרכיבים בודדים
תוכנת פיג'י/ImageJNIH או שווה ערך; לבדיקה ויזואלית של נתונים מיקרוסקופיים
משקפי כיסוי דיוק גבוה, 22 מ"מ x 22 מ"מ, מס' 1.5VWR630-2186משתמשים בכל זכוכית כיסוי # 1.5
ארגז כלים לעיבוד תמונה עבור MATLAB, גרסה 10.0Mathworks  
לקטין מבית גליצין מקס (פולי סויה)MerckL1395לקיבוע תאים בשקופיות
תוכנת MATLAB, גרסה 9.2Mathworks  
שקופית מיקרוסקופ, 26 מ"מ x 76 מ"מ, עובי 1 מ"מKnittel GlassL762601.2השתמש בכל שקופית מיקרוסקופ המתאימה לשלב המיקרוסקופ שלך, נקה היטב לפני טעינת תאים
מיקרוסקופ Olympus CellR עם תנועת אובייקטיבית אוטומטית של ציר zאולימפוס או שווה ערך
סט מסנני פנטבנדSemrockF66-985ערוצים בהירים, ירוקים וכחולים מספיקים
ארגז כלים לעיבוד אותות עבור MATLAB, גרסה 7.4Mathworks  
תוספי SPלמדיוםPSU0101 
מחשב משרדי סטנדרטי המסוגל להריץ את MATLAB   
ארגז כלים לסטטיסטיקה ולמידת מכונה עבור MATLAB, גרסה 11.1Mathworks  
פפטון אוניברסלי M66 למיקרוביולוגיהMerck1070431000 
UPLSAPO 60XO אובייקטיביאולימפוס או שווה ערך
תמצית שמריםFormediumYEA03 
בסיס חנקן שמרים ללא חומצות אמינוFormediumCYN0405 

מקורות

  1. Koch, B., Schmidt, C., Daum, G. Storage lipids of yeasts: a survey of nonpolar lipid metabolism in Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, and Yarrowia lipolytica. FEMS Microbiology Reviews. 38 (5), 892-915 (2014).
  2. Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. Balancing the fat: lipid droplets and human disease. EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).
  3. Lazar, Z., Liu, N., Stephanopoulos, G. Holistic Approaches in Lipid Production by Yarrowia lipolytica. Trends in Biotechnology. 36 (11), 1157-1170 (2018).
  4. Kim, D. U., et al. Analysis of a genome-wide set of gene deletions in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Nature Biotechnology. 28 (6), 1628-1629 (2010).
  5. Giaever, G., Nislow, C. The yeast deletion collection: a decade of functional genomics. Genetics. 197 (2), 451-465 (2014).
  6. Meyers, A., et al. The protein and neutral lipid composition of lipid droplets isolated from the fission yeast, Schizosaccharomyces pombe. Journal of Microbiology (Seoul, Korea). 55 (2), 112-122 (2017).
  7. Meyers, A., et al. Lipid Droplets Form from Distinct Regions of the Cell in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe. Traffic (Copenhagen, Denmark). 17 (6), 657-659 (2016).
  8. Long, A. P., et al. Lipid droplet de novo formation and fission are linked to the cell cycle in fission yeast. Traffic (Copenhagen, Denmark). 13 (5), 705-714 (2012).
  9. Yang, H. J., Osakada, H., Kojidani, T., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. Lipid droplet dynamics during Schizosaccharomyces pombe sporulation and their role in spore survival. Biology Open. , 8(2016).
  10. Aoki, K., Shiwa, Y., Takada, H., Yoshikawa, H., Niki, H. Regulation of nuclear envelope dynamics via APC/C is necessary for the progression of semi-open mitosis in Schizosaccharomyces japonicus. Genes To Cells: Devoted To Molecular & Cellular Mechanisms. 18 (9), 733-752 (2013).
  11. Karolin, J., Johansson, L. B. A., Strandberg, L., Ny, T. Fluorescence and Absorption Spectroscopic Properties of Dipyrrometheneboron Difluoride (BODIPY) Derivatives in Liquids, Lipid Membranes, and Proteins. Journal of the American Chemical Society. 116 (17), 7801-7806 (1994).
  12. Bozaquel-Morais, B. L., Madeira, J. B., Maya-Monteiro, C. M., Masuda, C. A., Montero-Lomeli, M. A new fluorescence-based method identifies protein phosphatases regulating lipid droplet metabolism. PloS One. 5 (10), e13692(2010).
  13. Sitepu, I. R., et al. An improved high-throughput Nile red fluorescence assay for estimating intracellular lipids in a variety of yeast species. Journal of Microbiological Methods. 91 (2), 321-328 (2012).
  14. Rostron, K. A., Lawrence, C. L. Nile Red Staining of Neutral Lipids in Yeast. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1560, 219-229 (2017).
  15. Romero-Aguilar, L., Montero-Lomeli, M., Pardo, J. P., Guerra-Sánchez, G. Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis. Journal of Visualized Experiments. (134), 1-6 (2018).
  16. Gupta, A., Dorlhiac, G. F., Streets, A. M. Quantitative imaging of lipid droplets in single cells. The Analyst. , (2018).
  17. Wolinski, H., Bredies, K., Kohlwein, S. D. Quantitative imaging of lipid metabolism in yeast: from 4D analysis to high content screens of mutant libraries. Methods in Cell Biology. , 108-365 (2012).
  18. Campos, V., Rappaz, B., Kuttler, F., Turcatti, G., Naveiras, O. High-throughput, nonperturbing quantification of lipid droplets with digital holographic microscopy. Journal of Lipid Research. 59 (7), 1301-1310 (2018).
  19. Ranall, M. V., Gabrielli, B. G., Gonda, T. J. High-content imaging of neutral lipid droplets with 1,6-diphenylhexatriene. BioTechniques. 51 (1), 35-42 (2011).
  20. Schnitzler, J. G., et al. Nile Red Quantifier: a novel and quantitative tool to study lipid accumulation in patient-derived circulating monocytes using confocal microscopy. Journal of Lipid Research. 58 (11), 2210-2219 (2017).
  21. Bombrun, M., Gao, H., Ranefall, P., Mejhert, N., Arner, P., Wählby, C. Quantitative high-content/high-throughput microscopy analysis of lipid droplets in subject-specific adipogenesis models. Cytometry. Part A the journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (11), 1068-1077 (2017).
  22. Capus, A., Monnerat, M., Ribeiro, L. C., de Souza, W., Martins, J. L., Sant’Anna, C. Application of high-content image analysis for quantitatively estimating lipid accumulation in oleaginous yeasts with potential for use in biodiesel production. Bioresource Technology. 203, 309-317 (2016).
  23. Lv, X., et al. Identification of gene products that control lipid droplet size in yeast using a high-throughput quantitative image analysis. Biochimica et biophysica acta. Molecular and Cell Biology Of Lipids. 1864 (2), 113-127 (2018).
  24. Zach, R., Tvarůžková, J., Schätz, M., Ťupa, O., Grallert, B., Převorovský, M. Mitotic defects in fission yeast lipid metabolism “cut” mutants are suppressed by ammonium chloride. FEMS Yeast Research. 18 (6), 1-7 (2018).
  25. Petersen, J., Russell, P. Growth and the Environment of Schizosaccharomyces pombe. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (3), (2016).
  26. Aoki, K., Furuya, K., Niki, H. Schizosaccharomyces japonicus: A Distinct Dimorphic Yeast among the Fission Yeasts. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2017).
  27. Curran, B. P. G., Bugeja, V. Basic investigations in Saccharomyces cerevisiae. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). , 1-14 (2014).
  28. Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. Molecular genetics of Schizosaccharomyces pombe. Methods in Enzymology. 470 (10), 759-795 (2010).
  29. Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2015).
  30. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  31. Nakamura, T., Pluskal, T., Nakaseko, Y., Yanagida, M. Impaired coenzyme A synthesis in fission yeast causes defective mitosis, quiescence-exit failure, histone hypoacetylation and fragile DNA. Open Biology. 2 (9), 120117(2012).
  32. Furuya, K., Niki, H. Isolation of heterothallic haploid and auxotrophic mutants of Schizosaccharomyces japonicus. Yeast. 26 (4), 221-233 (2009).
  33. Ivnitski-Steele, I., et al. Identification of Nile red as a fluorescent substrate of the Candida albicans ATP-binding cassette transporters Cdr1p and Cdr2p and the major facilitator superfamily transporter Mdr1p. Analytical Biochemistry. 394 (1), 87-91 (2009).
  34. Wolinski, H., Kohlwein, S. D. Microscopic analysis of lipid droplet metabolism and dynamics in yeast. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 457 (1), 151-163 (2008).
  35. Graml, V., et al. A genomic Multiprocess survey of machineries that control and link cell shape, microtubule organization, and cell-cycle progression. Developmental Cell. 31 (2), 227-239 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

BODIPYMATLABZ Stack

מאמרים קשורים