מאמר זה מייצג שימושי בתוך מבחנה כדי להעריך את היכולת של המדיום הממוזג מתאי הגידול כדי למשוך מקרופאגים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בתוך שיטת חוץ גופית כדי ללמוד גידול-מקרופאג אינטראקציה
במאמר זה
סיכום
תקציר
מקרופאגים הקשורים לגידול (TAMs) חשבון עבור אחוז גדול של תאים במסת הגידול עבור סוגים שונים של סרטן. Gliנובלסטומה (GBM), גידול ממאיר במוח ללא תרופה, יש עד מחצית ממסת הגידול TAMs. TAMs יכול להיות pro-tumoral וסרי או אנטי-מוסרי, בהתאם להפעלת גנים ספציפיים בתאים. מוטציות גנטיות בגידולים, באמצעות ויסות ציטוקין ביטוי, יכול להשפיע על גיוס של TAMs לסביבת מיקרו הגידול. כאן, אנו מתארים שיטת כמותית מבוססת התא כדי להעריך את הגיוס מקרופאג על ידי המדיום הממוזג מתאי הגידול. שיטת הפעולה הזאת משתמשת בקו מקרופאג cell האנושי MV-4-11 כדי לחקור את האטרקציה מקרופאג על ידי המדיום הממוזג מ glioblastoma, ומאפשר השתנות גבוהה ושינויים נמוכים. נתונים שנוצרו באמצעות שיטת העבודה הזאת יכולים לתרום להבנה טובה יותר של האינטראקציה בין הגידול לבין מיקרואקולוגיה של הגידול. שיטת דומה יכולה לשמש להערכת האינטראקציה בין תאי הגידול לבין תאים חיסוניים אחרים, כולל תאי T והרוצח הטבעי (NK) תאים.
מבוא
המקרופאגים הם התאים החיסוניים עם פנוטיic גבוהה ופונקציונלי טרוגניות1. הם משחקים תפקידים חשובים במערכות ההגנה של המארחים, תיקון רקמות, פיתוח והתקדמות הגידול1. TAMs הם מקרופאגים ב מיקרואקולוגיה של גידולים מוצקים. Tams מסוימים יכולים לקדם את צמיחת הגידול באמצעות מעכב T בתיווך התא מתווכת פעילות, מודוללדירוג מיקרוסביבה הגידול (tams), קידום אנגיוגנזה, פלישה גרורות2,3,4, 5. tams הם בין סוגי התאים הנפוצים ביותר ב tams ומספר גבוה יותר של tams בדרך כלל הקשורים הישרדות החולה גרוע יותר בסוגים רבים של גידול....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנה בינונית
-
הכנת מדיום תאי גזע ללא הנסיוב
- הפשרת תוספת 50x B27, גורם הגידול באפידרמיס (EGF, 20 μg/mL ב 10 מ"מ חומצה אצטית עם 0.1% BSA), ואת גורם הצמיחה פיברוהפיצוץ (FGF, 20 μg/mL ב 10 מ"מ חומצה אצטית עם 0.1% BSA).
- להוסיף 500 μL של EGF (הריכוז הסופי 20 ng/mL), 500 μL של FGF (ריכוז סופי 20 ng/mL), 10 מ ל של 50x B27 ל 500 מ ל של בינונית שונה של נשר מדיום/תערובת מזינים F-12 (DMEM/F12) ו-5 מ ל של 100x פניצילין/סטרפטומיצין (עט הפוך את הבקבוק 4-6 פעמים כדי לערבב, מסנן לעקר באמצעות מ500 mL 0.1 יקרומטר הגביע לסינון. סמנו את הבקבוק והחנות ב -4 ° c.
הערה: המדיום טובה לשימוש עד חודש ב -4 ° c.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
התוצאות מוצגות בדרך כלל באמצעות תרשימי עמודות (דוגמה המוצגת באיור 1). דגימות עם 480/520 גבוה ערכים עולה כי המדיה הממוזגת יש קיבולת גבוהה לגייס מקרופאגים. בהתאם לצורך ניסיוני, ניתן לכלול פקדים נוספים. לדוגמה, ניתן להשתמש בנטרול נוגדנים כדי לטפל באמצעי התקשורת הממוזגים כדי לבטל את המקרופאג מוניות, ולבצע את אותה הצורה. ניתן גם להוסיף נוגדנים נוספים (כלומר, CCL2) למדיה הממוזגת, המשמשת כשליטה חיובית.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בפרוטוקול זה, קיימים מספר שלבים מרכזיים: 1) הבחירה של הכנסת הטרנסטוב. עבור הקו הנייד MV-4-11, 5 יקרומטר טרנסטוב מוסיף עבודה היטב. עם זאת, עבור קווי תאים אחרים כגון קו מונוציט בשימוש נפוץ THP-1, גודל נקבובית שונה עשוי לעבוד טוב יותר. 2) כאשר קווי תאים שונים גדלים במהירויות שונות, חשוב לכוונן את עוצמת המדיה הממוזגת בהתאם למספרי התאים. למטרה זו, ניתן להשתמש במדיה נטולת-תאים הניתנת לשימוש באותם תנאים ניסיוניים כדי לדלל את המדיה הממוזגת. 3) מכיל ציטוקינים. חשוב להשתמש במדיום ללא סרום כדי seed MV-4-11 תאים בחדר העליון. אם נעשה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
ויליאם א. וייס הוא ממייסדי Therapeutics. . לzhenyi אין שום דבר לגלות
תודות
גרנט תמיכה: Z התקבלה תמיכה מתוך הקרן לימונדה של אלכס לעמוד, האגודה האמריקנית לגידול במוח, NIH T32CA108462 ותוכנית למחקר ביורפואי פריצת דרך, אשר ממומנת חלקית על ידי קרן סנדלר. וייס נתמך על ידי מענקי NIH R01CA221969, R01NS091620, P50CA097257, U01CA217864, P30CA82103; הקרן לחקר הסרטן ע שמואל וקסמן; והיו ר אוולין ומאטי אנדרסון
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 0.1 μ סינון m | תרמו פישר | 566-0010 | |
| 0.45 μ m סינון יחידת | Millipore | SLHA033SS | |
| 10 מ"ל פיפטות סרולוגיות | אולימפוס פלסטיק | 12-104 | |
| 15 מ"ל צינורות צנטריפוגה סטריליים | אולימפוס פלסטיק | 28-103 | |
| 1 מ"ל קצה פיפטה | ART מוצרים ביולוגיים מולקולריים | 2779-RI | |
| 2 מ"ל שואב פיפט | פלקון | 357558 | |
| 24 בארות צלחת | Millipore | ECM507 | חלק מ-ECM507, או ניתן לרכוש בנפרד |
| 4x מאגר ליזה | Millipore | ECM507 | חלק מ-ECM507, או ניתן לרכוש אותו בנפרד |
| 5 μ m Transwell הכנס | Millipore | ECM507 | חלק מ-ECM507, או ניתן לרכוש בנפרד |
| 75 ס"מ2 בקבוק | Corning | 430641U | |
| Accutase | טכנולוגיות תאים חדשניות | AT-104 | |
| B27 | Gibco | 12587-010 | |
| CyQuant Dye | Millipore | ECM507 | חלק מ-ECM507, או ניתן לרכוש בנפרד |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| DMEM:F12 | Gibco | 10565-018 | |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| FBS | Gibco | 26140 | |
| FGF | Peprotech | 100-18B | |
| IMDM | Gibco | 12440-053 | |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| עט סטרפטוקוקוס | ג'יבקו | 15140-122 | |
| טריפן כחול | Biorad | 1450021 |
מקורות
- Liu, Y., Cao, X. The origin and function of tumor-associated macrophages. Cellular & Molecular Immunology. 12 (1), 1-4 (2015).
- Riabov, V., et al. Role of tumor associated macrophages in tumor angiogenesis and lymphangiogenesis. Front....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
