דמיין את הדינמיקה של משטח הפני-תא באמצעות מיקרוסקופ גיליון אור של סריג

Summary

המטרה של פרוטוקול זה היא להראות כיצד להשתמש במיקרוסקופיה של יריעות האור כדי להמחיש באופן זמני את הדינמיקה של קולטן פני השטח בתאים חיים. כאן קולטני תא T על CD4⁺ תאי t הראשי מוצגים.

Abstract

האיתות והתפקוד של תא מוכתבים על-ידי מבנים דינאמיים ואינטראקציות של קולטני פני השטח שלה. כדי באמת להבין את היחסים מבנה פונקציה של קולטנים אלה באתרו, אנחנו צריכים להמחיש ולעקוב אחריהם על פני השטח התא לחיות עם רזולוציה מספקת הזמן הזמני. כאן אנו מראים כיצד להשתמש לאחרונה פיתח רשת מיקרוסקופית גיליון אור (LLSM) לתמונה קולטני T-cell (TCRs) ארבע-מימדי (4D, מרחב וזמן) בקרום התא החי. תאי T הם אחד התאים העיקרי של האפקטור של המערכת החיסונית אדפטיבית, וכאן השתמשנו בתאי T כדוגמה כדי להראות כי האיתות והפונקציה של תאים אלה מונעים על ידי הדינמיקה ואינטראקציות של TCRs. LLSM מאפשר הדמיה 4D עם רזולוציה חסרת תקדים הזמני. טכניקה זו מיקרוסקופית ולכן ניתן להחיל בדרך כלל על מגוון רחב של מולקולות משטח או תאיים של תאים שונים בביולוגיה.

Introduction

הדינמיקה המדויקת של הסחר במולקולות והפצת המשטחים התלת-ממדיים בזמן אמת הייתה תעלומה לפתרון. מיקרוסקופ תמיד היה איזון של מהירות, רגישות, ורזולוציה; אם אחד או שניים מהם מוגדלים, השליש ממוזער. לכן, בשל גודל קטן ומהירות עצומה עם אילו קולטני פני השטח לנוע, מעקב אחר הדינמיקה שלהם נשאר אתגר טכנולוגי גדול לתחום של ביולוגיה התא. לדוגמה, מחקרים רבים נערכו באמצעות סך השתקפות פנימית מיקרוסקופ (tirf)^1,2,3, אשר יש ברזולוציה הטמפורלית הגבוהה, אבל יכול רק תמונה פרוסה דקה מאוד של קרום T-cell (~ 100 nm), ולכן מחמיץ אירועים קורה רחוק יותר בתא. אלה תמונות TIRF גם מראה קטע דו מימדי של התא. לעומת זאת, טכניקות ברזולוציה סופר, כגון מיקרוסקופ סטוכסטי שחזור אופטי (סטורם)⁴, מיקרוסקופ לוקליזציה פוטומופעל (PALM)⁵, ו מיקרוסקופית פליטה מגורה (ההיסטד)⁶, יכול להתגבר על מגבלת מגביל של אבה של האור. טכניקות אלה יש רזולוציה מרחבית גבוהה (~ 20 החלטה nm)^4,5,6,7, אבל לעתים קרובות הם לוקחים הרבה דקות כדי לרכוש מלא דו-ממדי (2d) או תלת מימדי (3d) התמונה, ולכן הרזולוציה הטמפורלית אובד. בנוסף, טכניקות כגון הסערה והדקל המסתמכים על אותות מהבהבים עשויים להיות אי-דיוקים בספירת^8,9. מיקרוסקופ אלקטרוני יש הרזולוציה הגבוהה ביותר (עד 50 pm החלטה)¹⁰; זה יכול אפילו להתבצע תלת מימדי עם קרן יון ממוקדת סריקה אלקטרון מיקרוסקופ (פרפור-SEM), וכתוצאה מכך 3 ננומטר XY ו 500 nm Z החלטה¹¹. עם זאת, כל צורה של אלקטרון מיקרוסקופ דורש הכנה לדוגמה קשה יכול להתבצע רק עם תאים קבועים או רקמות, ביטול האפשרות של הדמיה לחיות דגימות לאורך זמן.

טכניקות כדי להשיג את הרזולוציה גבוהה זמן זמן הדרוש כדי לזהות את הדינמיקה של פני השטח מולקולות תאיים בתאים חיים בטבע הפיזיולוגי האמיתי שלהם 3d הוא רק לאחרונה פיתח. אחת הטכניקות הללו היא מיקרוסקופ גיליון האור של סריג (LLSM)¹², אשר מנצל גיליון אור מובנה כדי להקטין באופן דרסטי הלבנה. פותח בשנת 2014 על ידי חתן פרס נובל אריק ביאזיג, הרזולוציה הגבוהה בציר, הלבנה נמוכה ורעש הרקע, ואת היכולת לדמות בו מאות מטוסים לשדה התצוגה להפוך מיקרוסקופים מעולה לשדה שטח, tirf ו^{קונפוקלית יקרוסקופים12,13,14,15},^16,17,18,19. זה 4-מימדי (x, y, z ו-time) הדמיה טכניקה, בעוד עקיפה מוגבלת (~ 200 ננומטר החלטה XYZ), יש ברזולוציה הטמפורלית מדהים (השגנו שיעור מסגרת של כ 100 fps, וכתוצאה מכך תמונת תא 3D שוחזר עם 0.85 שניות לכל מסגרת) עבור רכישה מרחבית תלת-ממדית.

Llsm ניתן להשתמש בדרך כלל כדי לעקוב אחר הדינמיקה בזמן אמת של כל המולקולות בתוך תא כלשהו ברמת מולקולה אחת וברמה תא יחיד, במיוחד אלה בתאי נעים מאוד כגון תאים חיסוניים. לדוגמה, אנו מראים כאן כיצד להשתמש ב-LLSM כדי להמחיש דינאמיקה של קולטן T-cell (TCR). תאי T הם התאים האפקטור של המערכת החיסונית אדפטיבית. TCRs אחראים לזיהוי פפטיד-MHC (pMHC) ליגנדס הציג על פני השטח של תאים המציגים אנטיגן (APC), אשר קובע את הבחירה, פיתוח, בידול, גורל, ותפקוד של תא T. הכרה זו מתרחשת בממשק שבין תאי T ו-APCs, וכתוצאה מכך, באשכולות הקולטן מקומי כדי ליצור את מה שנקרא סינפולוגית. אמנם ידוע כי TCRs ב סינפולוגית החיסונית הם הכרחי לפונקציה T-cell אפקטור, עדיין לא ידוע הם המנגנונים הבסיסיים של סחר TCR בזמן אמת הסינפסה. LLSM אפשרה לנו לדמיין בזמן אמת את הדינמיקה של TCRs לפני ואחרי הסחר בסינפסה עם האינטראקציה הנובעת pMHC-TCR (איור 1). LLSM ניתן להשתמש לפיכך כדי לפתור את השאלות הנוכחיות של הדינמיקה המעצבים של TCRs ולספק תובנות כדי להבין כיצד תא מבדיל בין אנטיגנים עצמאיים וזרים.

Protocol

5C. C7 TCR-transgenic RAG2 עכברים בB10. הרקע שימש במחקר זה על פי פרוטוקול שאושר על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים של אוניברסיטת שיקגו.

1. קציר והפעל תאי T

הערה: חלק זה של הפרוטוקול מבוסס על פרוטוקולים קודמים. ראה אזכורים לפרטים נוספים^20,21.

1. המתת חסד a 10-12 שבוע בן 5 ג. העכבר C7 טרנסגניים של שני מין (~ 20-25 g) על פי פרוטוקול IACUC מאושר (כלומר, חדר CO₂ ואחריו פריקה צוואר הרחם).
2. ספריי גווייה העכבר ביסודיות עם 70% אתנול לספוג את הפרווה ולהביא לארון בטיחות BSL-2.
3. להפוך את העכבר על הצד הימני שלו ולעשות חתך קטן בחלל הגוף עם מספריים כירורגית. להסיר את הטחול באמצעות מלקחיים כירורגי. חותכים את רקמת החיבור כנדרש עם מספריים כירורגיים.
4. מניחים את הטחול ב 70 μm-הנקבוביות תא מסננת ומחית עם הגב של מזרק 1 mL. לשטוף דרך מסננת ביסודיות עם RPMI מלאה (RPMI עם 10% סרום של שור עוברי [FBS], 2 מ"מ L-גלוטמין, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 50 μM 2-mercaptoethanol).
5. צנטריפוגה את התא הבולם היחיד של הטחול ב 300 x g עבור 5 דקות. לבטל את הסופרנטאנט.
   הערה: הגלולה בנקודה זו תהיה אדומה.
6. השהה מחדש את הטחול במאגר של 5 מ ל לפירוק. דגירה עבור 5 דקות, ואז להרוות עם 5 מ ל של RPMI השלם.
7. צנטריפוגה את התא הבולם היחיד של הטחול ב 300 x g עבור 5 דקות. לבטל את הסופרנטאנט.
   הערה: הגלולה בנקודה זו צריכה להיות לבנה, לא אדומה.
8. השהה מחדש את הגלולה ב-5 מ ל להשלמת RPMI.
9. העבר לבקבוקון T-25 והוסף 10 μM עש ציטוכרום-C (מק, רצף אנארדיליאיקטק). הניחו את התאים בחממה לתרבות התא ב-37 ° c, 5% CO₂ לילה.
10. ביום למחרת, להוסיף רקומביננטי עכבר IL-2 לריכוז הסופי של 100 U/mL.
11. צפו בימים הבאים, הוספת מדיה טרייה כאשר המדיה הנוכחית הופכת לצהובה. תאי T ימותו אם שמאל במדיה צהוב ללא השגחה עבור מעל 48 h. תאים מוכנים להשתמש 6-10 ימים לאחר הקציר.

2. הכן תאים

1. מודטה 5 מילימטר שמיכות עגול עם 0.1% פולי-L-ליזין עבור 10 דקות.. ולתת להתייבש באופן טבעי
2. השתמש מגיב הדרגתי צפיפות (לראות את הטבלה של חומרים) כדי להפריד תאים מתים להשיג 1 x 10⁶ תאים T ו-1 x 10⁶ apcs (CH27 תאים^{21, 22 התמרה} באמצעות ציטוסולג mcherry) בנפרד.
   הערה: תאים נספרים באמצעות הומוציטוטומטר.
   1. הוסף 3 מ ל של צפיפות מעבר הצבע מגיב ל 15 מ"ל צינור חרוט ולהוסיף תאים dropwise לקצה הצינור בזהירות. אל תערבב. צנטריפוגה ב 930 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c; השתמש בהאצת/האטה: איטית/איטית. הסר את שכבת התאים האמצעית הדקה בין המדיה המלאה ומעבר הצבע המגיב בקפידה, תוך הצבת כל סוג תא בצינורות חרוטיים נפרדים.
      הערה: יש צורך להכין יותר תאים מהדרוש להדמיה, כפי שאנו מוצאים כי 50% אובד בממוצע במהלך התהליך. יותר תאים המשמשים את התהליך, קל יותר לקצור אותם מעבר הדרגתי צפיפות. אנו משתמשים 4-8 mL של שני סוגי התא כדי להבטיח תאים עודפים. במקרה הצורך, ניתן לספור תאים לפני שלב זה כדי להבטיח את נפח האחסון הדרוש. כל התאים הנוספים הם בחזרה לתוך מבחנות בהתאמה שלהם.
   2. לשטוף את שתי הצינורות של תאים T ו CH27 תאים שלוש פעמים עם 5 mL להשלים RPMI (300 x g עבור 5 דקות). התעלם מהסופרנטנט בכל פעם בזמן השטיפה. השהה מחדש כל צינור ב-1 mL להשלים RPMI ולספור תאים על ידי הומוציטומטר.
3. השעיה מחדש 1 x 10⁶ apcs ב 500 μl להשלים RPMI ולהוסיף 10 ΜM mcc. דגירה עבור 3 h ב 37 ° צ', 5% CO₂. לשטוף את התאים שלוש פעמים עם 500 μL RPMI להשלים (300 x g עבור 5 דקות). . להיפטר מהסופרנטנמלים
4. השהה מחדש 1 x 10⁶ תאים T ב 500 μl השלם RPMI. להוסיף 2 μg של anti-TCRβ Alexa488 התווית Fab (שיבוט H57) כדי 500 μL של תאים. דגירה של 30 דקות ב 37 ° c, 5% CO₂. לשטוף את התאים שלוש פעמים עם 500 μL של RPMI השלם (300 x g עבור 5 דקות). מחק את הסופרנטאנט לאחר כל כביסה.
   הערה: הנוגדן האנטי-ממדי שנחתך באמצעות ערכת הכנה מסוג Fab (ראה את שולחן החומרים) כדי למנוע התחברות של קולטני התא T על-ידי הנוגדן הדינטי (שלב זה הוא אופציונלי).
5. השהה מחדש את שני סוגי התאים ב-500 μL של מדיית דימות (פנול-free-15 בינוני של לייבוביץ עם 10% FBS, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 2 מ"מ L-גלוטמין).

3. הנהלת המערך היומי של LLSM

הערה: (חשוב) פרוטוקול יישור זה מבוסס על כלי ה-LLSM המשמש (ראה את טבלת החומרים). כל LLSM עשוי להיות שונה ודורשים אסטרטגיות יישור שונות, במיוחד אלה שנבנו בבית. בצע את היישור השגרתי המתאים והמשך לסעיף 4.

1. הוסף 10 מ ל של מים פלוס 30 μL fluorescein (1 מ"ג/mL מלאי) אל האמבטיה LLSM (~ 10 mL נפח), לחץ על תמונה (Home) כדי להעביר את המטרה למיקום התמונה, ולהסתכל על תבנית יחידה לייזר בסל. יישר את קרן הלייזר בעזרת המדריכים והאזור שנקבע מראש של ריבית (ROI) כדי להפוך את הקרן לתבנית דקה בכל הכיוונים.
   1. הקרן צריך גם להופיע ממוקד מצלמת מאתר. השתמש שתי מראה להטות משקף, מיקרומטר העליון, פוקוס, וצווארון אובייקטיבי המטרה כדי לכוונן. ראה איור 2א, B עבור קרן מיושרת כהלכה.
2. לשטוף את האמבטיה ואת המטרות עם לפחות 200 mL של מים כדי להסיר לחלוטין fluorescein.
3. התמונה חרוזים בתקן פלורסנט במדיה הדמיה (מוכן על ידי שמירה חרוזים 5 מ"מ coverslip עם פולי-L-ליזין, לראות את הטבלה של חומרים; זה יכול להיות מראש מוכן מחדש) עבור פונקציה התפשטות נקודה פיזית (psf) במדיה הדמיה.
   הערה: יכול להיות רק חרוז אחד בתצוגה לעיבוד מאוחר יותר, כך לנסות למצוא חרוז כי הוא על ידי עצמו בצופה או יכול בקלות להיחתך כדי לקבל חרוז אחד.
   1. הפעל מיזוג צבעים על-ידי הגדרה ל-3 בתיבה ' X galvo range '. הקש על Live כדי להציג את השדה הנוכחי. לנוע לאורך כיוון Z כדי למצוא את שובר הכיסוי ואת החרוזים. מצא את המרכז של חרוז על ידי נע לאורך Z, לחץ על הפסק כדי להשהות את הלייזר. בדוק תלת -ממד, הקש מרכז ולאחר מכן לחץ על בצע. פעולה זו תאסוף את הנתונים.
   2. באופן ידני להתאים את המראה הטיה, הצווארון האובייקטיבי, מיקרומטר מיקוד הערכים האפורים הגבוהים ביותר, ולאחר מכן להתאים לפי הצורך כדי להשיג דפוסים הנכון עבור סריקה אובייקטיבית, z galvo, z + מטרה (תוצרת מדומה), ו לדוגמה לסרוק (סמלפימית) ללכוד מצבי. ראה איור 2C-F עבור הקרנות מרביות בעוצמה מקסימלית (mips).
      הערה: מצבי לכידות שונים (סריקה אובייקטיבית, z galvo, z + אובייקטיבי, וסריקה לדוגמה) לשנות את האופן שבו גיליון האור נע דרך המדגם. יש להשתמש בכל מצבי הסריקה לצורך יישור.
   3. הסריקה לדוגמה מראה כיצד הנתונים ייאספו במהלך הניסוי. לאסוף את PSF לדוגמה על ידי לחיצה על לבצע במצב סריקה לדוגמה עבור deskewing ופירוק (ראה סעיף 5). לשנות לייזרים למצב צבע שלושה (488, 560, 647) ולחץ לבצע שוב.
      הערה: מאז תמונות LLSM בזווית (57.2 °), תמונות שנתפסו במצב "לסרוק את המדגם" נאספים בזווית זו, ולכן הם "מוטה". De-skewing הוא תהליך של תיקון עבור זווית זו ו "יישור מחדש" את התמונה למחסנית z אמיתי. יש לאסוף נתונים אלה במדיית הדמיה ובכל הערוצים שיהיו בתמונה במהלך הניסוי. אם הדבר לא נאסף כראוי, הנתונים לא יהיו מכווננים כהלכה. כמו כן, ודא שהמדיה הייתה מתחממת ל-37 ° צ' (או לטמפרטורה הניסיונית הרצויה).

4. הגדרת תאים עם LLSM

1. הוסף 100,000 APCs (50 μL) משלב 2.5 עד 5 מ"מ בקוטר שמיכות מעגלית משלב 2.1 ולאפשר להם להתפשר על 10 דקות.
2. משמן את מחזיק המדגם ולאחר מכן להוסיף את התא coverslip בצד עד זה. הוסף טיפה של מדיית הדמיה לחלק האחורי של שמיכות כדי למנוע בועות לפני הצבת באמבטיה. לעזאזל עם מחזיק המדגם על piezo, ולחץ על התמונה (Home).
3. מצא APC לתמונה כדי להבטיח את התוכנה LLSM והדמיה (ראה טבלת חומרים) מתפקד כראוי.
   הערה: אנו התמונה בגודל השלב 0.4 יקרומטר עם 60 z-שלבים ו 10 ms חשיפה לשני צבעים עם מיזוג להגדיר 3, אשר תוצאות 1.54 s לכל מסגרת של תמונה תלת-ממדית עם ~ 200 nm ו-400 הרזולוציה ננומטר z. ייתכן שיהיה צורך לכוונן הגדרות אלה על בסיס גודל התא, הרזולוציה הרצויה של z, וכוח האות משיטת תיוג הפלורסנט המשמשת. השימוש בכוח לייזר יהיה גם משתנה בהתבסס על הטכניקה תיוג פלורסנט בשימוש.
   1. הקש על Live כדי להציג את התמונה הנוכחית. הזז לאורך Z כדי למצוא את שובר הכיסוי והתאים.
   2. מצא את מרכז APC על ידי הזזת כיוון Z, ולאחר מכן לחץ על הפסק כדי להשהות את הלייזר. בדוק תלת -ממד והקלט את ההגדרות הרצויות (ראה שלב 4.3.1), הקש Center ולאחר מכן לחץ על בצע. פעולה זו תאסוף את הנתונים.
4. הנמך את השלב כדי לטעון מיקום ולהוסיף 50 μl של תאים T במדיית הדמיה (100,000 תאים, משלב 2.5) dropwise ישירות מעל coverslip. מומלץ לתת טופס טיפה על קצה הפיפטה ולאחר מכן לגעת בקצה לנוזל האמבט. להעלות את השלב בחזרה על ידי לחיצה על "תמונה (לחזור)".
5. . התחילו בהדמיה הקפד להגדיר את גודל המחסנית הרצוי באורך זמן הקפיצה. לדוגמה, התמונה 60 z-ערימות בגודל 0.4 יקרומטר שלב וקלט 500 מסגרות הזמן. (בדרך כלל) להפסיק את ההקלטה לפני 500 מסגרות מגיעים כדי להימנע photobleaching לבנה. השתמש במצב Live כדי לחפש זוגות תאים וכאשר הגדרות מוכנות ורצויות הוזנו, לחץ על הפעל כדי לאסוף נתונים. ראה סרט 1 ואיור 1 לדוגמה.

5. מעקב אחר דינמיקה של פני השטח

1. יצא את הנתונים מתוכנת הדימות (עיין בטבלת החומרים). זה ייצור z-מחסנית TIF קבצים עבור כל נקודת זמן בכל צבע.
2. . קודם כל, ולפרק את המידע
   הערה: אנו משתמשים בצינור הנפט LLSpy תחת רישיון על ידי מחקר בקמפוס Janelia של המחקר¹⁸, אבל deskewing ופירוק זמינים גם בתוך תוכנות דימות מרובות (ראה טבלת חומרים).
3. . לדבליץ את הנתונים
   הערה: אנו משתמשים בתכונת הדבליץ של פיג'י עם התאמת היסטוגרמה (מסלול פיג'י: תמונה | כוונן | תיקון אקונומיקה | התאמת היסטוגרמה | בסדר).
4. יבא לתוך תוכנת המעקב (עיין בטבלת החומרים). עקוב אחר אשכולות לפי מפרטי התוכנה. ראה סרט 2 לדוגמה.
   הערה: תוצאות המעקב יהיו תלויות בתוכנת המעקב שבשימוש, באלגוריתם שנבחר, בפרמטרים הרצויים של הפלט שנבחרו, וכו '. לדוגמה, בתוכנת המעקב שלנו (ראה את טבלת החומרים), בחרנו לאפשר לתוכנה לעקוב אחר צורות חריגות, במקום להקצות לכל תכונה נקודה אחת, מאחר שאשכולות tcr אינם מאורגנים לתחומים מושלמים. בנוסף, בחרנו לאסוף 35 פרמטרים, כולל מהירות, כיוון, נפח, עוצמה, אזור, מיקום ומעקב אחר מידע משך. עם זאת, שיטות או פרמטרים שונים יהיו מועילים לענות על שאלות שונות.
   1. אם לא רצוי לבצע מעקב, השתמש בתוסף הקול לקבלת המחשה ויצירת סרטים מנתוני היפרמחסנית.

Results

כאן, אנו מתארים את הבידוד, ההכנה, והדמיה של העכבר הראשי 5C. התאים C7 T באמצעות סריג במיקרוסקופ האור. במהלך סעיף 3, זה הכרחי ליישר את המיקרוסקופ כראוי, ולאסוף PSF היומי שבו כדי לפרק את הנתונים לאחר האוסף. באיור 2, אנו מציגים את התמונות יישור הנכון שיראו בעת יישור המיקרוסקופ. איור 2A ו- איור 2ב הצגת נתיב הקרן הנכון ויישור הקרן, בהתאמה, כאשר הם מופיעים בתמונה בפלואורואסעין. הסריקה האובייקטיבית צריכה לה...

Discussion

הפרוטוקול המוצג היה אופטימיזציה לשימוש של CD4⁺ T תאים מבודדים מ 5c. בשימוש בכלי ה-LLSM משתמשים, ולכן מערכות תאים אחרות ו-Llsm עשויים להיות ממוטבים באופן שונה. עם זאת, פרוטוקול זה מראה את העוצמה של הדמיה 4D, כפי שניתן להשתמש בו כדי לכמת את הדינמיקה של קולטן פני השטח על תא שלם עם עיוות הפחות בתנאים פיסיולוגיים. לכן, קיימים יישומים עתידיים רבים אפשריים של טכניקה זו.

צעד קריטי מאפשר לתאים להתיישב בריכוז מתאים. אם רבים מדי APCs להתיישב על שמיכות ולהיות צפוף מדי, קשה למצוא תא T כי הוא אינ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 מ"ל מזרק	BD	309659	לקציר תאי T
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148-25ML	לתרבית תאי T
5 מ"מ כיסויים עגולים	Precision Instruments	502040	להדמיה
70um מסננת תאים סטרילית	קורנינג	7201431	לקציר תאי T
Alexa Fluor 488 אנטי עכבר TCR & beta; נוגדן שרשרת	BioLegend	109215	להדמיית
סרום בקר עוברי (FBS)	X& תרבית תאים	Y FBS-500	לתרבית תאי T
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-02	מגיב שיפוע מכחיש לקציר תאי T
מלח נתרן פלואורסצאין	סיגמא-אולדריץ'	F6377	ליישור מיקרוסקופ
FluoSpheres מיקרוספירות קרבוקסילט שונה	Thermo Fisher Scientific	F8810	ליישור מיקרוסקופ
Imaris	Bitplane	N/A	; אפשרויות אחרות לתוכנת מעקב כוללות Amira או Trackmate (פיג'י).
מיקרוסקופ גיליון אור סריג	3i	N / A	מיקרוסקופ השתמש במדיום
L-15 של לייבוביץ, ללא פנול אדום	תרמו פישר	21083027	מדעית להדמיה
L-גלוטמין	תרמו פישר מדעי	25030-081	לתרבית תאי T
LLSpy	Janelia מחקר קמפוס N	/A	LLSpy שימש ברישיון מהמכון הרפואי הווארד יוז, קמפוס המחקר ג'נליה. צור קשר עם innovation@janelia.hhmi.org לקבלת גישה. שיטות דה-קונבולוציה ו-deksewing אחרות זמינות בתוכנות עיבוד תמונה כגון Fiji, Slidebook, Amira ואחרות. https://llspy.readthedocs.io/en/latest/
Moth Cytochrome C (MCC), רצף ANERADLIAYLKQATK	Elimbio	סינתזה מותאמת אישית	לקציר תאי T
Penacillin/Streptamycin	Life Technologies	15140122_3683884612	לתרבית תאי T
פולי-L-ליזין	פניקס	P8920-100ML	להדמיית
RBC מאגר ליזה	eBioscience	00-4300-54	לקציר תאי T
עכבר רקומביננטי IL-2	סיגמא-אולדריץ'	I0523	לתרבית תאי T
RPMI 1640	MT10040CV קורנינג		לתרבית תאי T
Slidebook	3i	N / A	LLSM תוכנת הדמיה
כלי	דיסקציה כירורגיתNova-Tech International	DSET10	לקציר תאי
T T-25 צלוחיות	Eppendorf	2231710126	לתרבית תאי
T Thermo Scientific Pierce Fab ערכות הכנה מיקרו	Thermo Fisher Scientific	44685	להכנת Fab