דמיין את הדינמיקה של משטח הפני-תא באמצעות מיקרוסקופ גיליון אור של סריג

Jillian Rosenberg; Jun Huang

doi:10.3791/59914

Method Article

דמיין את הדינמיקה של משטח הפני-תא באמצעות מיקרוסקופ גיליון אור של סריג

DOI:

10.3791/59914

⸱

January 30th, 2020

Jillian Rosenberg¹ , Jun Huang¹^,²

¹Committee on Cancer Biology, The University of Chicago, ²Pritzker School of Molecular Engineering, The University of Chicago

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המטרה של פרוטוקול זה היא להראות כיצד להשתמש במיקרוסקופיה של יריעות האור כדי להמחיש באופן זמני את הדינמיקה של קולטן פני השטח בתאים חיים. כאן קולטני תא T על CD4⁺ תאי t הראשי מוצגים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

האיתות והתפקוד של תא מוכתבים על-ידי מבנים דינאמיים ואינטראקציות של קולטני פני השטח שלה. כדי באמת להבין את היחסים מבנה פונקציה של קולטנים אלה באתרו, אנחנו צריכים להמחיש ולעקוב אחריהם על פני השטח התא לחיות עם רזולוציה מספקת הזמן הזמני. כאן אנו מראים כיצד להשתמש לאחרונה פיתח רשת מיקרוסקופית גיליון אור (LLSM) לתמונה קולטני T-cell (TCRs) ארבע-מימדי (4D, מרחב וזמן) בקרום התא החי. תאי T הם אחד התאים העיקרי של האפקטור של המערכת החיסונית אדפטיבית, וכאן השתמשנו בתאי T כדוגמה כדי להראות כי האיתות והפונקציה של תאים אלה מונעים על ידי הדינמיקה ואינטראקציות של TCRs. LLSM מאפשר הדמיה 4D עם רזולוציה חסרת תקדים הזמני. טכניקה זו מיקרוסקופית ולכן ניתן להחיל בדרך כלל על מגוון רחב של מולקולות משטח או תאיים של תאים שונים בביולוגיה.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדינמיקה המדויקת של הסחר במולקולות והפצת המשטחים התלת-ממדיים בזמן אמת הייתה תעלומה לפתרון. מיקרוסקופ תמיד היה איזון של מהירות, רגישות, ורזולוציה; אם אחד או שניים מהם מוגדלים, השליש ממוזער. לכן, בשל גודל קטן ומהירות עצומה עם אילו קולטני פני השטח לנוע, מעקב אחר הדינמיקה שלהם נשאר אתגר טכנולוגי גדול לתחום של ביולוגיה התא. לדוגמה, מחקרים רבים נערכו באמצעות סך השתקפות פנימית מיקרוסקופ (tirf)¹^,²^,³, אשר יש ברזולוציה הטמפורלית הגבוהה, אבל יכול רק תמונה פרוסה דקה מאוד של קרום T-cell (~ 100 nm), ולכן מחמיץ אירועים קורה רחוק יותר בתא. אלה תמונות TIRF גם מראה קטע דו מימדי של התא. לעומת ז....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

5C. C7 TCR-transgenic RAG2 עכברים בB10. הרקע שימש במחקר זה על פי פרוטוקול שאושר על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים של אוניברסיטת שיקגו.

1. קציר והפעל תאי T

הערה: חלק זה של הפרוטוקול מבוסס על פרוטוקולים קודמים. ראה אזכורים לפרטים נוספים²⁰^,²¹.

המתת חסד a 10-12 שבוע בן 5 ג. העכבר C7 טרנסגניים של שני מין (~ 20-25 g) על פי פרוטוקול IACUC מאושר (כלומר, חדר CO₂ ואחריו פריקה צוואר הרחם).
ספריי גווייה העכבר ביסודיות עם 70% אתנול לספוג את הפרווה ולהביא לארון בטיחות BSL-2.
להפוך את העכבר על הצד הימני שלו ולעשות חתך קטן ב....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מתארים את הבידוד, ההכנה, והדמיה של העכבר הראשי 5C. התאים C7 T באמצעות סריג במיקרוסקופ האור. במהלך סעיף 3, זה הכרחי ליישר את המיקרוסקופ כראוי, ולאסוף PSF היומי שבו כדי לפרק את הנתונים לאחר האוסף. באיור 2, אנו מציגים את התמונות יישור הנכון שיראו בעת יישור המיקרוסקופ. איור 2A ו- איור 2ב הצגת נתיב הקרן הנכון ויישור הקרן, בהתאמה, כאשר הם מופיעים בתמונה בפלואורואסעין. הסריקה האובייקטיבית צריכה לה.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המוצג היה אופטימיזציה לשימוש של CD4⁺ T תאים מבודדים מ 5c. בשימוש בכלי ה-LLSM משתמשים, ולכן מערכות תאים אחרות ו-Llsm עשויים להיות ממוטבים באופן שונה. עם זאת, פרוטוקול זה מראה את העוצמה של הדמיה 4D, כפי שניתן להשתמש בו כדי לכמת את הדינמיקה של קולטן פני השטח על תא שלם עם עיוות הפחות בתנאים פיסיולוגיים. לכן, קיימים יישומים עתידיים רבים אפשריים של טכניקה זו.

צעד קריטי מאפשר לתאים להתיישב בריכוז מתאים. אם רבים מדי APCs להתיישב על שמיכות ולהיות צפוף מדי, קשה למצוא תא T כי הוא אינ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוני להכיר בעצות ובהדרכה של ד ר וייז בינדוקאס באוניברסיטת שיקגו. אנו מודים למתקן הליבה של מיקרוסקופ אור משולב באוניברסיטת שיקגו לתמיכה ולשמירה על מיקרוסקופ האור הסריג. עבודה זו נתמכת על ידי NIH חדש המייצרת פרס 1DP2AI144245 ו NSF קריירה פרס 1653782 (כדי J.H.). התוכנית למלגות בוגרת NSF מקיימת בתמיכת ג'יי. פי.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
1 מ"ל מזרק	BD	309659	לקציר תאי T
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148-25ML	לתרבית תאי T
5 מ"מ כיסויים עגולים	Precision Instruments	502040	להדמיה
70um מסננת תאים סטרילית	קורנינג	7201431	לקציר תאי T
Alexa Fluor 488 אנטי עכבר TCR & beta; נוגדן שרשרת	BioLegend	109215	להדמיית
סרום בקר עוברי (FBS)	X& תרבית תאים	Y FBS-500	לתרבית תאי T
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-02	מגיב שיפוע מכחיש לקציר תאי T
מלח נתרן פלואורסצאין	סיגמא-אולדריץ'	F6377	ליישור מיקרוסקופ
FluoSpheres מיקרוספירות קרבוקסילט שונה	Thermo Fisher Scientific	F8810	ליישור מיקרוסקופ
Imaris	Bitplane	N/A	; אפשרויות אחרות לתוכנת מעקב כוללות Amira או Trackmate (פיג'י).
מיקרוסקופ גיליון אור סריג	3i	N / A	מיקרוסקופ השתמש במדיום
L-15 של לייבוביץ, ללא פנול אדום	תרמו פישר	21083027	מדעית להדמיה
L-גלוטמין	תרמו פישר מדעי	25030-081	לתרבית תאי T
LLSpy	Janelia מחקר קמפוס N	/A	LLSpy שימש ברישיון מהמכון הרפואי הווארד יוז, קמפוס המחקר ג'נליה. צור קשר עם innovation@janelia.hhmi.org לקבלת גישה. שיטות דה-קונבולוציה ו-deksewing אחרות זמינות בתוכנות עיבוד תמונה כגון Fiji, Slidebook, Amira ואחרות. https://llspy.readthedocs.io/en/latest/
Moth Cytochrome C (MCC), רצף ANERADLIAYLKQATK	Elimbio	סינתזה מותאמת אישית	לקציר תאי T
Penacillin/Streptamycin	Life Technologies	15140122_3683884612	לתרבית תאי T
פולי-L-ליזין	פניקס	P8920-100ML	להדמיית
RBC מאגר ליזה	eBioscience	00-4300-54	לקציר תאי T
עכבר רקומביננטי IL-2	סיגמא-אולדריץ'	I0523	לתרבית תאי T
RPMI 1640	MT10040CV קורנינג		לתרבית תאי T
Slidebook	3i	N / A	LLSM תוכנת הדמיה
כלי	דיסקציה כירורגיתNova-Tech International	DSET10	לקציר תאי
T T-25 צלוחיות	Eppendorf	2231710126	לתרבית תאי
T Thermo Scientific Pierce Fab ערכות הכנה מיקרו	Thermo Fisher Scientific	44685	להכנת Fab

World תוכנת מעקב מוצרי מחקר בינוני

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poulter, N. S., Pitkeathly, W. T. E., Smith, P. J., Rappoport, J. Z. The Physical Basis of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy and Its Cellular Applications. Methods in Molecular Biology. 1251, Clifton, N.J. 1-23 (2015).
Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

דמיין את הדינמיקה של משטח הפני-תא באמצעות מיקרוסקופ גיליון אור של סריג

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles